抗HBsAg抗體在乙型肝炎相關(guān)疾病中的應用進展

楊玥+劉煜

摘要：乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的包膜蛋白，其含量可以反映病毒活性，常用于臨床相關(guān)疾病的診斷。由于基因整合的原因，HBsAg在大部分HBV相關(guān)疾病中高表達，被認為是重要的靶標。針對此靶點的抗HBsAg抗體已被廣泛應用HBV相關(guān)疾病的分子診斷及治療領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞：乙型肝炎；抗乙型肝炎表面抗原抗體；病毒活性；應用

中圖分類號：R392 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）14-0028-03

乙型肝炎是由HBV引起的感染性疾病，盡管疫苗能夠成功減少HBV感染的人數(shù)，但仍有超過20億人受到HBV的困擾。持久的HBV感染會引起慢性肝炎，進而誘發(fā)肝硬化和肝癌等高致死性疾病。目前臨床上的治療方法主要是使用干擾素和抗逆轉(zhuǎn)錄試劑，但長期使用并不能徹底清除病毒，獲得較好的臨床受益，反而還會產(chǎn)生耐藥的突變病毒株。因此，研究者需繼續(xù)探索HBV的致病機制以及開發(fā)新的藥物。HBsAg是HBV的包膜蛋白，在病毒附著、侵入肝細胞的過程中發(fā)揮重要的作用；也是宿主體液和細胞免疫反應的靶點，可以誘導機體產(chǎn)生長期的保護性免疫，接種疫苗和HBV感染后會產(chǎn)生特異性抗HBsAg抗體。研究者利用抗HBsAg抗體研究HBsAg的復雜結(jié)構(gòu)，繪制蛋白的空間構(gòu)象，結(jié)合位點等，用于臨床檢測診斷試劑的開發(fā)以及設(shè)計合成、改構(gòu)針對HBsAg的高效價的特異性親和抗體。

1 抗HBsAg抗體在診斷方面的應用

早期診斷是治療成功的關(guān)鍵，精確的診斷試劑對于疾病的發(fā)展控制至關(guān)重要。HBsAg在HBV感染肝細胞后大量分泌，其表達水平可以反映HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性，配合反映病毒復制活性的HBV DNA水平對患者進行診斷。檢測HBsAg的方法大多以抗原抗體特異性反應為基礎(chǔ)。

HBsAg診斷試劑誕生于1992年，用于減少輸血時發(fā)生的HBV感染應運而生。隨著檢測試劑靈敏度、準確度的不斷發(fā)展，其用途也日益增多，如今常用于臨床檢測HBsAg的水平及變化判斷患者臨床狀態(tài)及治療效果[1]。HBsAg的持續(xù)表達會刺激肝細胞增生，對肝細胞癌（HCC）的形成及發(fā)展起著重要的作用。尤其是在肝硬化的患者中，肝細胞增殖速率的快速升高是導致HCC的危險因素。Chen Y C[2]等發(fā)現(xiàn)HBsAg血清轉(zhuǎn)換的患者有較好的臨床預后，較少發(fā)展為HCC。因此，監(jiān)測HBsAg的水平變化是必不可少的。

目前臨床上檢測HBsAg的方法是以抗HBsAg抗體捕獲樣本中HBsAg的能力為基礎(chǔ)，利用抗原抗體特異性反應的原理形成的，常用ELISA法、時間分辨熒光分析法、化學發(fā)光免疫分析法等，并且很多已商品化，如雅培Architect系統(tǒng)、羅氏Elecsys系統(tǒng)等。研究者為了提高靈敏度和精確度，不斷尋找新的方法。Alizadeh N等[3]發(fā)明以抗HBsAg抗體為基礎(chǔ)，利用高靈敏度的電化學免疫傳感器檢測HBsAg的方法。Sangkyu Lee等[4]建立了壓電微懸臂傳感器檢測方法，通過免疫反應后將生物信號轉(zhuǎn)化至電信號，檢測HBsAg的精確度可達0.1～100 ng/ml，并且裝備具有小巧、可攜帶、可多通量檢測等優(yōu)點。此外，抗HBsAg抗體本身也可作為臨床指標，如可以通過疫苗接種后檢測血樣中抗體滴度判斷免疫效果，也可與HBsAg水平共同判斷患者狀態(tài)給予更準確的診治方案。由此可見，抗HBsAg抗體是HBV相關(guān)疾病診斷的基礎(chǔ)。

2 抗HBsAg抗體在治療方面的應用

抗體由于具有中和作用，固有效應、刺激免疫系統(tǒng)等多種功能已成功用于腫瘤、自身免疫等疾病的治療，但很少用于慢性病毒感染。近年來，抗體在獲得性免疫缺陷綜合征、埃博拉等疾病的研究中也嶄露頭角。雖然目前尚未明確其分子機制，但是利用抗體介導的免疫療法可作為治療病毒感染性疾病的候選方法。抗體通過結(jié)合作用使病毒包膜蛋白失活，阻斷病毒入侵從而抑制感染的傳播；也可以通過固有效應功能如抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（ADCC）、補體裂解、吞噬作用等清除循環(huán)中的病毒、病毒抗原、產(chǎn)病毒細胞等；此外，抗體與病毒的復合物可以通過Fc段與免疫效應細胞作用產(chǎn)生多種固有和獲得性免疫效應對抗病毒。更重要的是，臨床上將HBsAg的血清轉(zhuǎn)換作為是抗HBV治愈的關(guān)鍵指標，然而目前的藥物很少能實現(xiàn)這一目標。

2.1中和作用

乙型肝炎人免疫球蛋白（HBIG）是臨床上常用的阻斷HBV感染的被動免疫試劑，通常從自然感染或接受疫苗后產(chǎn)生高效價抗HBsAg抗體的健康人血漿中獲取，經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法等生物濃縮工藝制得。HBIG可使人體被動接受高效價抗HBsAg抗體，從而中和、清除血液中游離的的HBV，避免感染的發(fā)生。Tsuge M等[5]發(fā)現(xiàn)HBIG可在人肝嵌合鼠模型中顯著減少HBV DNA的含量，并呈劑量依賴的形式，且在給藥24 h后血清HBsAg的含量便低于檢測限。因此，HBIG可用于治療HBV相關(guān)疾病。但是HBIG作為一種血液制品，由于原材料和質(zhì)量的嚴格控制等原因很難大規(guī)模生產(chǎn)，同時HBIG也有血液制品含有其它傳染性病原體風險的共同的隱患。為了解決這一壁壘，科學家們希望應用雜交瘤和噬菌體庫等技術(shù)生產(chǎn)安全、有效的抗體。

Zhang T Y等發(fā)現(xiàn)靶向HBsAg（GPCK（R）TCT）結(jié)合位點的抗體E6F6比結(jié)合其它表位的抗體對HBV具有更有效、更持久的作用[6]，證實其在動物模型中可以促進HBsAg和病原體的清除、阻止病毒初始感染。Kucinskaite-Kodze I等[7]也篩選出針對同一位點的高親和力的HB1抗體，證實其與抗體E6F6具有相同的活性。Tan W等[8]構(gòu)建的針對HBsAg兩個不同表位的雙特異性抗體C4D2-BsAb，不僅能更好的中和HBV，還可被內(nèi)吞進入肝細胞抑制HBsAg的分泌。研究者對于抗HBsAg抗體的開發(fā)及作用機制的逐漸認識有助于我們更好的了解HBV，更快的研發(fā)出新的有效的抗HBV相關(guān)疾病的藥物及療法。本實驗室也通過雜交瘤方法篩選出具有高親和力的抗HBsAg抗體，經(jīng)體外實驗證實其可以特異性靶向結(jié)合表達HBsAg的肝癌細胞，抑制細胞分泌HBsAg，促進細胞凋亡，具體作用機制有待進一步探索。

2.2靶向作用

腫瘤靶向治療在HER-2過表達的乳腺癌、胃癌等領(lǐng)域都取得了巨大的發(fā)展。HBV相關(guān)疾病如慢性乙型肝炎及其誘導的肝硬化、肝癌患者的基因組中會發(fā)生HBV DNA整合[9]，使HBsAg穩(wěn)定的過表達。因此，HBsAg可作為特異性標記物進行靶向治療。利用抗HBsAg抗體作為運輸工具，通過融合蛋白或化學偶聯(lián)等方式將一些小分子藥物、多肽、核酸、放射性核素等具有殺傷腫瘤作用或檢測相關(guān)的物質(zhì)遞送至肝細胞癌處發(fā)揮作用，而其中由于單鏈抗體具有分子量小，免疫原性低、表達構(gòu)建方法成熟、組織滲透性好等優(yōu)勢被研究者們廣泛使用。Bo Yan等[10]利用靶向HBsAg的單鏈抗體scFv15作為“子彈頭”攜帶Fdt-HA2-tBid到達HBsAg陽性的HCC細胞中，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤生長。Wen等[11]通過構(gòu)建靶向HBsAg的單鏈抗體與魚精蛋白截短體的融合蛋白，成功遞送SiRNA至HBsAg為陽性的HepG2.2.15細胞中有效抑制 HBV DNA的表達和復制。這些研究均證實抗HBsAg抗體作為靶向工具治療HBV相關(guān)肝部疾病的潛力。

2.3免疫激活作用

免疫反應是宿主清除體內(nèi)細菌、病毒及腫瘤細胞等病原物質(zhì)的重要手段。長期感染HBV患者機體免疫反應受到明顯抑制，主要表現(xiàn)為CD4+T細胞、CD8+T細胞數(shù)量明顯下降，Treg細胞數(shù)量明顯升高，且T細胞表面免疫抑制相關(guān)類受體如PD-1、CTLA-4、TIM-3等呈高表達，T細胞功能嚴重喪失[12]。研究表明，HBsAg可以嚴重影響骨髓來源的樹突狀細胞功能，進而抑制T細胞的增殖，降低INF-γ及IL-12等細胞因子的分泌[13]；也可以有效減弱Toll樣受體所介導的抗病毒反應[14]；高水平HBsAg會耗盡HBsAg特異性T細胞反應，被認為是慢性乙肝病人產(chǎn)生病毒免疫耐受的一個重要因素。

抗HBsAg抗體可以大幅度減少HBsAg水平，給免疫系統(tǒng)清除病毒提供機會，這是目前其他藥物所不具備的能力。Tharinger H等[15]利用抗HBsAg抗體與HBsAg結(jié)合形成復合物的能力，可以加快機體外周白細胞對HBsAg的吞噬作用。由于CHB患者與正常人血樣吞噬HBsAg：IC復合物的能力相當，HBsAg持續(xù)暴露并不會改變CHB患者外周白細胞的吞噬能力，因此可以通過注射外源性抗HBsAg抗體增強吞噬作用。Zhu D等[16]證明循環(huán)中HBsAg的水平和持續(xù)時間是導致免疫耐受的主要原因。抗HBsAg抗體可減少循環(huán)HBsAg的含量，使耐受鼠逐漸恢復B細胞和CD4+T細胞的反應，打破耐受。同時前文提到Zhang T Y等人[6]篩選出靶向HBsAg的抗體E6F6在動物模型中可以調(diào)節(jié)免疫作用，恢復HBV耐受鼠的抗HBV T細胞響應。這些證據(jù)均證實抗HBsAg抗體在恢復HBV相關(guān)疾病的免疫反應方面具有良好的潛力。

3 展望

越來越多的證據(jù)表明HBsAg在HBV相關(guān)疾病中扮演重要的角色，抗HBsAg抗體逐漸受到研究者的重視?？贵w的更新發(fā)展可以使診斷試劑精確及時的確診疾病，輔助用藥方案，為臨床預后給予參考；可以代替HBIG解決因來源導致的價格昂貴、產(chǎn)品緊俏以及血液制品固有的病原體風險等問題，用于中和HBV，阻斷病毒感染；可以利用抗HBsAg抗體的靶向性遞送小分子、基因、蛋白等藥物，或讓藥物與免疫系統(tǒng)相互作用，增加療效減少副作用。因此，堅信在未來抗HBsAg抗體在HBV相關(guān)肝部疾病的診斷檢測和臨床治療等領(lǐng)域會有更廣泛的應用。

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編輯/成森