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    轉(zhuǎn)vgb基因油菜的耐澇性

    2014-06-13 07:11:56李培玉孫國清薛計雄郭三堆
    生物技術(shù)進展 2014年4期
    關(guān)鍵詞:卡那霉素脯氨酸轉(zhuǎn)基因

    李培玉, 張 銳, 孫國清, 馬 林, 薛計雄, 林 芹, 郭三堆

    1.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所,農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學工程,北京100081;

    2.新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,烏魯木齊830052

    油菜是我國重要的油料作物和蛋白質(zhì)飼料作物,也是食用植物油的主要來源之一。我國油菜種植面積以及總產(chǎn)量占世界的三分之一,是世界上最大的油菜產(chǎn)區(qū)[1]。但我國油菜產(chǎn)區(qū)降水量較大,經(jīng)常會發(fā)生嚴重的澇害[2,3]。澇害嚴重影響了我國油菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,因此提高油菜的耐澇能力對于我國油菜可持續(xù)發(fā)展具有非常重大的意義。

    澇害的本質(zhì)并不是植株體內(nèi)水分的不斷積累增加,而是長時間缺氧使根系功能減弱導致植物代謝途徑的改變,并產(chǎn)生許多有害物質(zhì),如二氧化碳、硫化物等,進而影響植物的正常生長和發(fā)育,隨著危害程度的增加造成嚴重的傷害和減產(chǎn)[4~6]。而且由于缺氧造成作物根系損傷,植株在澇害解除以后也很難恢復生長,具有明顯的滯后效應[7]。因此,如何提高油菜抗?jié)澈δ芰κ钱斍爸萍s油菜可持續(xù)發(fā)展的瓶頸問題。

    當前,改良作物的耐澇能力主要是提高其無氧生活環(huán)境的適應能力。Quimio等[8]在水稻漬水脅迫的研究中發(fā)現(xiàn),厭氧環(huán)境下,轉(zhuǎn)基因植株P(guān)DC酶活性和乙醇的合成率減少了50%。在漬水脅迫過程中,通過限制酶活性的提高從而加快了代謝過程,進而提高了終產(chǎn)物乙醇的合成。一些轉(zhuǎn)錄因子也與作物耐漬性相關(guān),但目前為止,只在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一個轉(zhuǎn)錄因子AtMYB2[9]。

    透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla haemoglobin,VHb)是研究比較成熟的一種加氧蛋白(Vgb)。最初由Khosla等[10]從透明顫菌中克隆得到,并在大腸桿菌和酵母中表達,可以加強細胞的呼吸強度,降低細胞的臨界氧濃度,提高細胞的生長速率,使細胞在低氧甚至無氧條件下仍能保持生長優(yōu)勢[11~13]。已有將vgb基因引入植物細胞的研究,實驗證明該基因也可使轉(zhuǎn)基因植物發(fā)芽提前,并加快植物的生長,這可能與該基因可以增加細胞中的氧濃度相關(guān)[14]。

    本研究首次通過基因工程手段將透明顫菌血紅蛋白基因過表達轉(zhuǎn)入油菜,驗證其在油菜增產(chǎn)和抗?jié)撤矫娴墓δ芎妥饔?,為vgb基因在油菜中的表達所產(chǎn)生的生物量和生理代謝變化提供了數(shù)據(jù),為農(nóng)作物抗?jié)逞芯刻峁┝死碚撘罁?jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗時間、地點

    本研究田間試驗于2010-2011年在湖北麻城進行。

    1.2 試驗材料

    甘藍型油菜中雙10號,由本實驗室保存。大腸桿菌菌株E.coli TOP10、質(zhì)粒pBI121,由本實驗室保存。其他質(zhì)粒均購自Promega公司。

    1.3 表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

    用PstⅠ和 XhoⅠ雙酶切 pGSKA質(zhì)粒和pG4ASVHB質(zhì)粒,得到pGSKA載體(4 kb)和vgb(452 bp)基因片段,經(jīng)過回收、連接,鑒定后得到中間載體pGSVKA。EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切中間載體pGSVKA,回收表達盒基因片段,克隆于pBI121質(zhì)粒中,并命名為pGBISVKA(見圖1)。

    在油菜盛花期將已經(jīng)授粉的花朵摘去,采用直接噴花法或蘸花法轉(zhuǎn)化油菜花朵,轉(zhuǎn)化后的花朵做好標記。

    1.4 卡那霉素檢測

    圖1 pGBISVKA質(zhì)粒載體圖譜Fig.1 Map of pGBISVKA plasmid vector.

    選擇晴朗、無風天氣的午后,配制2 000 mg/L的卡那霉素溶液,取脫脂棉浸入卡那霉素的溶液,然后貼附在油菜葉片的表面,或用噴壺將卡那霉素溶液均勻噴灑在油菜葉片表面,一周后觀察試驗結(jié)果。卡那霉素敏感植株的葉片在接觸卡那霉素處呈黃色,不敏感植株的葉片無變化。

    1.5 PCR 檢測

    按照Joobeur等[15]的方法提取油菜基因組。根據(jù)vgb基因的CDS序列設計引物:vgbF:5'-ggctgcaggcttgatcaacagac-3'和 vgbR:5'-agctcgagctcaacagcttgagcgtac-3'。以轉(zhuǎn)基因油菜基因組DNA為模板,進行PCR擴增。PCR體系50 μL:1 μL基因組 DNA,5 μL 10 × PCR buffer,5 μL dNTPs,1 μL vgbF(10 μmol/L),1 μL vgbR(10 μmol/L),0.5 μL Taq 酶(2.5 U/μL),ddH2O 38.5 μL。PCR擴增程序為:95℃ 5min;95℃ 30 s,63℃ 30 s,72℃ 2.5min,35 個循環(huán);72℃ 5min。4℃,保存。電泳檢測結(jié)果。

    1.6 Southern 雜交檢測

    Southern雜交檢測采用地高辛隨機引物標記法標記探針,化學發(fā)光檢測技術(shù)進行檢測[16]。

    1.7 耐澇性檢測

    油菜的淹水試驗在經(jīng)人工處理的不滲漏的淹水池進行。普通田地向下挖40~45cm,鋪設防水塑料布,然后用土填平,旁邊起埂,施肥后人工播種,在油菜花期進行為期15 d的淹水實驗,每天下午6點人工往淹水池里灌水,水面保持在油菜根部4~5cm處。淹水結(jié)束后從轉(zhuǎn)基因株系中挑選出生長狀況基本一致的15個株系進行生理指標測定[17,18],包括丙二醛、脯氨酸和超氧化物歧化酶的測定,進行3次重復。然后拔出,洗凈,比較在淹澇條件下根部的形態(tài)變化。試驗采用三重復隨機區(qū)組設計試驗。

    1.8 統(tǒng)計分析

    對原始數(shù)據(jù)進行標準化處理,用SPSS11.0軟件進行方差分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 轉(zhuǎn)基因植株的卡那霉素篩選

    在油菜的苗期用卡那霉素篩選,先采用大面積噴灑卡那霉素溶液進行初篩,然后將不變色的油菜用脫脂棉浸泡卡那霉素溶液后,貼在油菜葉片表面,最終獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株11株。

    2.2 PCR 鑒定

    提取轉(zhuǎn)基因油菜葉片的基因組DNA,以稀釋10倍的基因組為模板,以vgbF和vgbR為引物,以非轉(zhuǎn)基因油菜為對照,以pGBISVKA質(zhì)粒為陽性對照進行 PCR,轉(zhuǎn)基因植株樣品擴增出約450 bp條帶,與預期的長度完全一致,而陰性對照材料(中雙10號)PCR擴增結(jié)果未出現(xiàn)相應的電泳圖譜,如圖2所示。

    圖2 PCR鑒定轉(zhuǎn)vgb基因油菜植株Fig.2 PCR identification of vgb transgenic plants.

    2.3 Southern 雜交分析

    為了檢測外源基因在油菜基因組中的整合情況,對轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA進行EcoRⅠ單酶切,以vgb基因標記探針開展Southern雜交,結(jié)果見圖3。Southern雜交結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因株系中出現(xiàn)了兩條明顯雜交條帶,表明所檢測的轉(zhuǎn)基因油菜是雙拷貝整合。

    圖3 轉(zhuǎn)vgb基因植株的Southern blot分析Fig.3 Southern blot detection of vgb transgenic plants.

    2.4 轉(zhuǎn)基因油菜耐澇性分析

    2.4.1 澇漬脅迫處理對轉(zhuǎn)vgb基因油菜脯氨酸含量的影響 在正常供水條件下(見圖4),轉(zhuǎn)基因油菜和對照植株葉片脯氨酸含量較為正常,各材料之間脯氨酸含量差異不顯著。但是在淹水條件下,各材料的脯氨酸含量均出現(xiàn)不同程度的變化,非轉(zhuǎn)基因植株11~15在其淹水前后變化很明顯,脯氨酸含量較高,而轉(zhuǎn)基因植株1~10變化不明顯。說明轉(zhuǎn)vgb基因的油菜在淹水過程中已經(jīng)基本適應了淹水的環(huán)境,已不需要脯氨酸的調(diào)節(jié),但對照油菜則受到淹水的危害很嚴重,且很難恢復正常水平。

    2.4.2 淹澇脅迫處理下對油菜SOD活力的影響對油菜進行為期15 d的淹澇實驗,采集樣品測定SOD酶活,結(jié)果如圖5所示。在正常供水條件下,轉(zhuǎn)基因油菜和對照SOD酶活的差異不明顯。而在淹水條件下,測得轉(zhuǎn)基因植株的SOD酶活性雖然有所降低,但與正常供水情況差距并不明顯,而對照植株的 SOD酶活性顯著下降,約50%的降幅。與對照相比,淹水條件下,轉(zhuǎn)基因植株的SOD酶活保持相對穩(wěn)定。而SOD酶活性的急劇變化,暗示著產(chǎn)生的SOD不能夠完全清除氧自由基,積累的氧自由基可能會對植物體產(chǎn)生損害,造成損失。實驗結(jié)果顯示的轉(zhuǎn)vgb基因油菜的SOD酶活性受淹水影響較小,說明植株已經(jīng)適應了淹澇環(huán)境,并且SOD的合成已經(jīng)逐漸恢復,這有利于油菜的體內(nèi)的自由基的清除,使損失降低。

    圖4 脯氨酸的含量在轉(zhuǎn)基因植株和對照間的區(qū)別Fig.4 Differences of proline contents between transgenic lines and the control.

    圖5 SOD的含量在轉(zhuǎn)基因植株和對照間的區(qū)別Fig.5 Differences of SOD contents between transgenic lines and the control.

    2.4.3 油菜淹澇脅迫下對轉(zhuǎn)基因油菜丙二醛含量的影響 在干旱、水澇等條件下,植物體內(nèi)常發(fā)生質(zhì)膜過氧化作用,破壞膜系統(tǒng),導致植物受到傷害。MDA是細胞質(zhì)膜不飽和脂肪酸過氧化的產(chǎn)物,其含量的高低可作為膜質(zhì)過氧化的指標,當細胞內(nèi)MDA的量增加時,表明細胞膜受傷害程度的加深。MDA檢測結(jié)果表明:在正常條件下,轉(zhuǎn)基因油菜的MDA值和對照相差不大,但是在淹澇條件下,對照的MDA的量明顯上升,統(tǒng)計分析表明,對照油菜的MDA值比轉(zhuǎn)基因油菜的高,且差異顯著(見圖6)。

    2.4.4 油菜淹澇脅迫下根部變化 為了研究轉(zhuǎn)基因植株的耐澇性,對轉(zhuǎn)基因株系進行大量擴繁,選取生長一致的轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)化對照植株,在淹水條件下轉(zhuǎn)基因油菜根部同對照植株的比較,結(jié)果如圖7(彩圖見封三圖版)所示。從圖中看出,轉(zhuǎn)基因油菜雖然側(cè)根很多,但是碳化嚴重,非轉(zhuǎn)基因油菜側(cè)根較少,碳化相對輕微,差別不明顯。

    3 討論

    通過基因工程手段來實現(xiàn)對植物抗逆性的改良已成為人們關(guān)注的重點。本研究通過引入外源vgb基因,可降低細胞的臨界氧濃度,增強細胞的呼吸強度,從而提高細胞生長速率,進而加快植物生長速率。VHb還可以通過促進呼吸作用來增加ATP的濃度,間接地促進植物的光合作用和生長。在實驗中還檢測了葉綠素含量,與對照相比,轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量增加,同時光合作用也得到增強,從而加快了植物的生長。另一方面,轉(zhuǎn)vgb基因的植株可以保證氧濃度水平的相對穩(wěn)定,減少無氧呼吸,從而避免不必要的能量浪費。

    圖6 MDA的含量在轉(zhuǎn)基因植株和對照間的區(qū)別Fig.6 Differences of MDA contents between transgenic lines and control.

    圖7 不同條件下的根部形態(tài)Fig.7 Root system of different plants in different treats.

    在擴繁過程中進一步發(fā)現(xiàn),這一基因的轉(zhuǎn)入可以增加油菜的生物量,提高種子萌發(fā)率,縮短萌發(fā)時間,提高油菜籽的產(chǎn)量,起到增產(chǎn)的作用。

    通過對油菜進行淹澇實驗表明:轉(zhuǎn)入vgb基因的油菜具有明顯的抗?jié)衬芰Α.敺寝D(zhuǎn)基因油菜的根部缺氧后,其能量代謝逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐蕴墙徒?、乙醇和乳酸發(fā)酵等途徑為主,這樣不僅會造成物質(zhì)能量的大量消耗,而且會產(chǎn)生大量氧自由基、乳酸、乙醇等有害物質(zhì),從而造成根系的吸收大幅降低,葉片死亡,光合作用下降甚至停止。而轉(zhuǎn)基因植株中,VHb與氧有著很強的親和能力,能夠清除氧自由基,改變氧化磷酸化效率,抑制種子中不飽和脂肪酸氧化功能,增強了油菜根部同氧的結(jié)合能力。并且VHb位于整個胞質(zhì)中,可以使細胞能夠維持相對穩(wěn)定的氧濃度水平,進而提高了植株的抗?jié)衬芰Α?/p>

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