轉(zhuǎn)染ELF5mRNA對子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡及周期的影響

戚 挺， 蹤佳鵬， 閆洪超

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院， 江蘇 徐州 221000 2.江蘇省徐州市第一人民醫(yī)院產(chǎn)科， 江蘇 徐州 221000 3.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科， 江蘇 徐州 221000)

轉(zhuǎn)染ELF5mRNA對子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡及周期的影響

戚 挺1， 蹤佳鵬2， 閆洪超3*

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院， 江蘇 徐州 221000 2.江蘇省徐州市第一人民醫(yī)院產(chǎn)科， 江蘇 徐州 221000 3.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科， 江蘇 徐州 221000)

目的：檢測人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ELF5+EGFP后ELF5基因的表達，并觀察其對Ishikawa細胞凋亡情況及周期變化的影響。方法:通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核細胞表達載體體外轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞，設(shè)立實驗組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核載體)、空質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP空載體)、空白對照組(未經(jīng)轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞)。體外實驗：用qRT-PCR法檢測子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中ELF5mRNA的表達情況，MTT法檢測ELF5mRNA對Ishikawa細胞增殖的影響，流式細胞儀檢測三組細胞周期及凋亡情況，Western blot法檢測三組腫瘤組織的細胞周期調(diào)控蛋白P21及凋亡調(diào)控因子Caspase-3表達情況的變化。體內(nèi)實驗：將三組細胞分別接種于NOD/SCID雌性裸鼠，觀察腫瘤生長情況及測定成瘤能力，應(yīng)用TUNEL法檢測三組腫瘤組織細胞凋亡的情況，采用蛋白印跡法檢測三組腫瘤組織的細胞周期調(diào)控蛋白P21及凋亡調(diào)控因子Caspase-3表達情況的變化。結(jié)果:重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ELF5+EGFP成功轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞；重組質(zhì)粒組細胞ELF5mRNA的表達明顯高于空質(zhì)粒組及空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；重組質(zhì)粒組各時間點的細胞增殖能力較較其他兩組明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；重組質(zhì)粒組G0/G1期的細胞比例均高于空質(zhì)粒組及空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；重組質(zhì)粒組細胞凋亡率分別與空質(zhì)粒組及空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；重組質(zhì)粒組細胞中P21及Caspase-3的表達明顯高于空質(zhì)粒組及空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。重組質(zhì)粒組裸鼠體內(nèi)的成瘤能力(瘤組織最大直徑、重量)明顯低于空質(zhì)粒組及空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；重組質(zhì)粒組裸鼠體內(nèi)瘤組織細胞凋亡率分別與空質(zhì)粒組及空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；(9)重組質(zhì)粒組裸鼠體內(nèi)瘤組織P21及Caspase-3的表達明顯高于空質(zhì)粒組及空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:ELF5基因可抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞的增殖，將細胞周期阻滯于G0/G1期，并誘導(dǎo)其凋亡，其機制可能與P21及Caspase-3有關(guān)。

ELF5基因； 卵巢癌細胞； 轉(zhuǎn) 染； 細胞周期； P21； Caspase-3； 細胞凋亡

子宮內(nèi)膜癌(Endometrial Cancer)是全球最常見的婦科惡性腫瘤之一，在中國近年也有明顯的上升趨勢[1]。作為子宮內(nèi)膜癌的癌前病變，EIN(子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤樣病變)的級別越高，發(fā)展為子宮內(nèi)膜癌的機會越多。大約80%子宮內(nèi)膜癌早期手術(shù)治療是有效的，與其它腫瘤相比預(yù)后較好。但由于缺乏有效的早期診斷方法，許多患者錯過了最佳治療時機。因此，積極尋求各種與子宮內(nèi)膜癌、EIN相關(guān)的指標(biāo)，以用于子宮內(nèi)膜癌及EIN的早期診斷和治療，已成為有關(guān)子宮內(nèi)膜疾病研究的熱點。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生涉及多基因、多步驟的復(fù)雜過程[2]，深入研究控制子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展過程中關(guān)鍵基因的作用，對子宮內(nèi)膜癌的早期診斷、早期治療及預(yù)后有重要意義。近年來研究表明，ELF5是一個潛在腫瘤抑制因子，ELF5在乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮著抑癌基因的作用[3]。而關(guān)于ELF5基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌Ishikawa細胞周期與凋亡的影響及其可能的機制尚無報道。本課題組前期研究成功構(gòu)建了含有ELF5基因的pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核細胞表達載體[4,5]，并在預(yù)實驗研究中證實：ELF5蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中表達明顯低于在子宮內(nèi)膜不典型增生組織及正常子宮內(nèi)膜組織。為了探討ELF5基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌Ishikawa細胞周期與凋亡的影響和作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料:子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞由徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院提供；pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核細胞表達載體由本課題組構(gòu)建并保存；Liptapfector脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物合成由日本TaKaRa公司提供；MTT試劑、AnnexinV-FITC流式細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期試劑盒購自南京凱基生物科技公司；ELF5一抗購自美國Chemicon公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):Ishikawa細胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁生長，根據(jù)細胞生長狀態(tài)換液，待細胞鋪板70%～80%時傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)染及分組:采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核細胞表達載體體外轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞(重組質(zhì)粒組)，具體操作按Liptapfector 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行，用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性Ishikawa細胞并擴增培養(yǎng)；同時以轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP(空質(zhì)粒組)及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞(空白對照組)作為對照。

1.2.3 體外實驗

1.2.3.1 實時熒光定量PCR法檢測細胞ELF5mRNA的表達情況:轉(zhuǎn)染72h后收集3組細胞，按RNA提取試劑盒說明書分別提取總RNA，然后進行瓊脂糖凝膠電泳。1μg總RNA加1μL DNase I去除DNA雜質(zhì)。取提純后RNA 2 μg按試劑盒說明在冰上將各種反應(yīng)物混合形成20μL反應(yīng)體系，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。利用delta-delta Ct法，再通過β-Actin的校正，最后對各組RNA中的ELF5mRNA表達量進行分析。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3.2 MTT比色法檢測細胞增殖：取對數(shù)生長期的Ishikawa細胞，25%胰蛋白酶消化，按每孔1×104個細胞接種于96孔板，每組樣本設(shè)6個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24h、48h、72h后每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，培養(yǎng)箱孵育4h，小心吸棄上清，每孔加入150μL DMSO，平板床搖勻(避光)，置酶標(biāo)儀于490nm波長處檢測每孔的吸光值(A490)，計算各組細胞的增殖抑制率。實驗重復(fù)3次。

1.2.3.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況:收集三組細胞，用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，加入2mL完全培養(yǎng)液終止消化，置于離心機1000rpm離心5min，棄上清，預(yù)冷PBS洗滌細胞3次(1000rpm，5min)，收集細胞于流式管中，加入500μL 的Binding Buffer 重懸細胞，加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，混勻后室溫避光反應(yīng)5～15min，1h內(nèi)上機檢測。上述實驗重復(fù)3次。

1.2.3.4 流式細胞儀檢測細胞周期:收集三組細胞，PBS洗滌、離心后調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，70%乙醇固定，PBS洗滌后每管加入100μL RNAase A 37℃水浴30min，再加入400μL PI染液混勻，4℃避光30min，上機檢測，用Flow Jo軟件分析各組細胞周期的比例。上述實驗重復(fù)3次。

1.2.3.5 Western免疫印跡法檢測蛋白表達:取生長期的三組細胞，分別于細胞裂解液(200μL)中冰上裂解，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度,SDS-PAGE電泳分離蛋白后，進行轉(zhuǎn)膜實驗，用封閉液進行封閉實驗后，加入1∶1000的ELF5一抗(兔抗人)，4℃過夜，與1∶10000的羊抗兔二抗室溫下反應(yīng)，加入化學(xué)發(fā)光試劑ECL，最后進行曝光、顯影劑掃描。用Image J圖像分析系統(tǒng)對圖像進行掃描，各組細胞中目的蛋白的表達水平以目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參(β-Actin)的灰度值的比值表示。

1.2.4 體內(nèi)實驗：①動物分組NOD/SCID雌性裸鼠(鼠齡4～6周)15只，隨機分為重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組及空白對照組，每組各5只；飼養(yǎng)于恒溫(25～27℃)、恒濕(45%～50%)、新鮮空氣、高度除塵除菌及無特殊病原體的環(huán)境中，用滅菌處理的水和飼料供小鼠自由攝入。②動物接種及處理:取生長期的三組細胞懸液，按2×104/mL濃度分別接種于裸鼠右腋窩皮下，每周兩次觀察腫瘤生長情況；待成瘤后取腫瘤組織，并測定其最大直徑及重量。并對瘤組織進行HE染色觀察移植瘤組織的病理學(xué)特點。③TUNEL法檢測裸鼠體內(nèi)瘤組織細胞凋亡的情況:取三組細胞裸鼠體內(nèi)的瘤組織切片，常規(guī)脫蠟水合，0.3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.1mg/mL蛋白酶K消化40min，TdT反應(yīng)液、鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(SP-HRP)37℃各作用1h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。具體操作按TUNEL檢測試劑盒說明書進行，鏡下計數(shù)凋亡細胞并計算凋亡率。④Western blotting法檢測裸鼠體內(nèi)瘤組織P21、Caspase-3蛋白的表達:取三組細胞裸鼠體內(nèi)的瘤組織，分別勻漿后提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白后，進行轉(zhuǎn)膜實驗，用封閉液封閉后，加入1∶1000的ELF5一抗(兔抗人)，4度C孵育過夜，與1∶10000的羊抗兔二抗室溫下反應(yīng)，加入化學(xué)發(fā)光試劑ECL，最后進行曝光、掃描。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ELF5+EGFP至子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞:采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA3.1-ELF5+EGFP轉(zhuǎn)染至人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞，感染48h后熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達較強，通過比較同一區(qū)域熒光視野和明視野下細胞熒光表達情況，可知細胞轉(zhuǎn)染效率在80%以上。見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染ELF5基因后Ishikawa細胞ELF5 mRNA表達的變化:實時熒光定量PCR法檢測顯示，重組質(zhì)粒組細胞ELF5 mRNA的表達均高于空質(zhì)粒組及空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 pcDNA3.1-ELF5+EGFP轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞48h后熒光圖

A:對照組綠色熒光表達;B:對照組細胞形態(tài);C:實驗組綠色熒光表達;D:實驗組細胞形態(tài)

圖2 ELF5mRNA的表達情況

1.重組質(zhì)粒組；2.空質(zhì)粒組；3.空白對照組

2.3 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA對Ishikawa細胞增殖的影響:MTT檢測結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間(24h、48h、72h)的增加，重組質(zhì)粒組細胞增殖抑制率較其他兩組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而空質(zhì)粒組與空白對照組比較，差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA后對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細胞增殖的影響±s)

*與重組質(zhì)粒組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

2.4 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA后Ishikawa細胞周期的變化:流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組中(60.86±0.52)%的細胞阻滯于G0/G1期，分別與空質(zhì)粒組(33.78±0.34)%及空白對照組(32.37±0.47)%比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而空質(zhì)粒組與空白對照組比較，差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3，圖3。

表3 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA對Ishikawa細胞周期的影響

*與重組質(zhì)粒組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

圖3 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA對Ishikawa細胞周期的影響

A組：空白對照組；B組：空質(zhì)粒組；C組：重組質(zhì)粒組

2.6 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA后Ishikawa細胞凋亡率的變化:流式細胞儀檢測結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒組凋亡率(38.03±1.40)%，較空質(zhì)粒組(17.07±0.28)%和空白對照組(19.27±0.55)%明顯增高(P<0.05)，而空質(zhì)粒組與空白對照組之間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA后細胞凋亡的變化

注：A組：空白對照組；B組：空質(zhì)粒組；C組：重組質(zhì)粒組

2.6 轉(zhuǎn)染ELF5基因后Ishikawa細胞中P21、Caspase-3蛋白表達的變化:Western blotting檢測結(jié)果顯示，P21、Caspase-3蛋白在重組質(zhì)粒組的表達均高于空質(zhì)粒組及空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 蛋白印跡法檢測三組細胞中P21、Caspase-3蛋白的表達

2.7 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA后子宮內(nèi)膜癌細胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力的變化:裸鼠體內(nèi)瘤組織HE染色病理切片證實了子宮內(nèi)膜癌細胞的致瘤性。裸鼠剖檢結(jié)果亦表明，重組質(zhì)粒組裸鼠體內(nèi)的成瘤能力(瘤組織最大直徑、重量)明顯低于空質(zhì)粒組及空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而空質(zhì)粒組與空白對照組比較，差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖6，表4。

圖6 子宮內(nèi)膜癌移植瘤HE染色病理切片(×20)

表4 各組瘤組織最大直徑、重量的比較±s，n=5)

*與重組質(zhì)粒組比較，P<0.05；*兩組間比較，P>0.05

2.8 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA后各組移植細胞凋亡情況:TUNEL法檢測結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組細胞凋亡率明顯高于空質(zhì)粒組及空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而空質(zhì)粒組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖7、表5。

圖7 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA后各組移植瘤細胞凋亡病理染色圖片(×200)

表5 TUNEL法檢測各組移植瘤細胞凋亡的比較

2.9 轉(zhuǎn)染ELF5mRNA后移植瘤組織中P21、Caspase-3蛋白表達的變化:Western blotting檢測結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組移植瘤組織中蛋白P21及Caspase-3的表達明顯高于空質(zhì)粒組及空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖8。

圖8 蛋白印跡法檢測各組移植瘤組織中P21、Caspase-3蛋白的表達

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌(EC)是最常見的婦科惡性腫瘤，是世界癌癥死亡的主要原因之一[6]，占婦科惡性腫瘤總數(shù)的7%，且發(fā)病率及死亡率呈逐年上升的趨勢。早期患者以手術(shù)為主，術(shù)后根據(jù)高危因素選擇輔助治療。然而對于早期有生育要求的年輕患者來說，手術(shù)并不是治療子宮內(nèi)膜癌的最佳選擇。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生涉及多基因、多步驟的復(fù)雜過程[7]，深入研究控制子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展過程中關(guān)鍵基因的作用，對子宮內(nèi)膜癌的早期診斷、早期治療及預(yù)后有重要意義。

ELF5屬于Ets家族成員之一，ELF5位于人11號染色體短臂13-15區(qū)，這個區(qū)域在癌癥中易發(fā)生雜合性丟失，Elf5含有兩個可識別結(jié)構(gòu)域，一個所有ETS轉(zhuǎn)錄因子都包含的能夠與TTCC核心序列結(jié)合的基序和一個參與蛋白間相互作用的點結(jié)構(gòu)域，ELF5的完整結(jié)構(gòu)域包含參與蛋白間相互作用的結(jié)構(gòu)域、與蘇氨酸/半胱氨酸核心序列結(jié)合的基序及兩個共性結(jié)構(gòu)域。

本研究將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核細胞表達載體體外轉(zhuǎn)染至人子宮內(nèi)膜癌細胞，同時以轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的人卵巢癌細胞作為對照，進一步從多方面研究ELF5基因干預(yù)對人子宮內(nèi)膜癌細胞周期及凋亡的影響，并探討其抑制癌細胞增殖及周期阻滯的可能機制。MTT檢測結(jié)果顯示，ELF5基因具有明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的作用。流式細胞儀檢測結(jié)果表明，ELF5基因可將細胞周期阻滯于G0/G1期，從而抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖。在蛋白水平，重組質(zhì)粒組細胞P21及Caspase-3的表達明顯高于其它兩組，表明ELF5基因可能通過上調(diào)人子宮內(nèi)膜癌干細胞P21及Caspase-3的表達而影響細胞周期及凋亡。本研究裸鼠移植瘤體內(nèi)實驗，進一步探討了ELF5基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌細胞周期及凋亡的影響。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組裸鼠體內(nèi)的成瘤能力明顯低于其它兩組，表明ELF5mRNA在體內(nèi)也可抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的生長。TUNEL檢測結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組裸鼠體內(nèi)的細胞凋亡率高于其它兩組，表明ELF5基因在體內(nèi)也具有明顯的促腫瘤細胞凋亡作用。蛋白水平顯示，重組質(zhì)粒組裸鼠體內(nèi)瘤組織P21及Caspase-3的表達明顯高于其它兩組，表明ELF5基因在體內(nèi)也可通過上調(diào)人子宮內(nèi)膜癌細胞P21及Caspase-3的表達而影響細胞周期及凋亡。

本實驗研究結(jié)果證實，ELF5mRNA對子宮內(nèi)膜癌增殖及周期有明顯影響，其機制可能與P21及Caspase-3有關(guān)。ELF5mRNA在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，這使得ELF5mRNA今后可能成為子宮內(nèi)膜癌基因治療的新靶點，這對降低子宮內(nèi)膜癌的病死率有著極其重要的意義。

[1] Gu HQ,Zhang ZB,et al. The role of the SDF-1/CXCR7 axis on the growth and invasion ability of endometrial cancer cells[J].Arch Gynecol Obstet,2017,17:4308.

[2] Chou WC,Lee PH,Tan YY,et al.An integrative transcriptomic analysis revealsbisphenol A exposure-induced dysregulation of microRNA expression inhuman endometrial cells[J].Toxicol in Vitro,2017, 2:12.

[3] Frend HT, Watson CJ.ELF5-breast cancer's little helper[J].Breast Cancer Res,2013,15(2):307.

[4] 錢衛(wèi)衛(wèi)，閆洪超.ELF5mRNA在卵巢上皮性癌組織中的表達及臨床意義[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,18(12):2009～2012.

[5] 仇影影,謝肖磊等.轉(zhuǎn)染ELF5基因的人卵巢癌干細胞增殖、侵襲能力及凋亡變化[J].山東醫(yī)藥,2016,56(19):25～27.

[6] Yang S, Thiel KW, Leslie KK. Progesterone: the ultimate endometrial tumor suppressor[J].Trends Endocrinol Metab, 2011, 22(4): 145～152.

[7] Arem H, Park Y, Pelser C, et al.Prediagnosis body mass index, physical activity and mortality in endometrial cancer patients[J].Jnci Natl Cancer Inst, 2013, 105 (5) : 342～349.

Effect of Transfection of ELF5 mRNA on Apoptosis and Cycle of Endometrial Carcinoma Cells

QITing,etal

(GraduateSchoolofXuzhouMedicalUniversity,JiangsuXuzhou221000,China)

Objective:To study the effects of ELF5 gene on cycles and apoptosis of human endometria cancer cells and its probable mechanism. Methods: The eukaryotic expression vectedical or pcDNA3.1-ELF5+EGFP was transfected into human endometria cancer cells in vitro (recombinant plasmid group), and positive cell clones were selected by G418 and amplified. Transfected pcDNA3.1-EGFP cells (empty plasmid group) and untransfected cells (blank control group) were served as control groups. In vitro, the cell prolifetraion ability of three groups was analyzed by MTT; the cycle and apoptosis was analyzed by flow cytometry; the expression of protein P21 and Caspase-3 was detected by Western blot. In vivo, three groups of cells were transplanted into NOD/SCID nude mice, and observed the growth ability of tumors; the apoptosis of tumors was determined by TUNEL; the expression of protein P21 and Caspase-3 in tumors was detected by Western blot. Results: The recombinant plasmid pcDNA3.1- ELF5+EGFP was successfully transfected into human endometria cancer cells; The expression of ELF5 mRNA in the recombinant plasmid group was higher than that in the empty plasmid group and blank control group (P<0.05); At each time point, the cell proliferation ability of the recombinant plasmid group was significantly decreased than that of the empty plasmid group and blank control group, the differences were statistically significant (P<0.05); The number of cells arrested in G0/G1phase of the recombinant plasmid group was higher than that of the empty plasmid group and blank control group, the differences were statistically significant (P<0.05); The apoptosis rate of the recombinant plasmid group was compared with the empty plasmid group and the blank control group, the differences were statistically significant (P<0.05); The expression of protein P21 and Caspase-3 in the recombinant plasmid group was higher than that in the empty plasmid group and blank control group (P<0.05). In vivo, the growth ability of tumors (maximum diameter, weight) in recombinant plasmid group was lower than that in the empty plasmid group and blank control group, the differences were statistically significant (P<0.05); In vivo, the apoptosis rate of the recombinant plasmid group was compared with the empty plasmid group and the blank control group, the differences were statistically significant (P<0.05); In vivo, the expression of protein P21 and Caspase-3 in the recombinant plasmid group was higher than that in the empty plasmid group and blank control group (P<0.05). Conclusions: ELF5 gene has obvious effects on cycles and apoptosis of human endometria cancer cells and its mechanism connected with the protein P21 and Caspase-3.

ELF5 gene; Endometria cancer cells; Transfection; Cell cycles; P21; Caspase-3; Apoptosis

1006-6233(2017)06-0889-06

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.06.04

*【通訊作者】閆洪超