改進(jìn)雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素的溶出度測(cè)定方法Δ

張 勉，李 超（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121）

·藥物分析與檢定·

改進(jìn)雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素的溶出度測(cè)定方法Δ

張 勉＊，李 超（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121）

目的：改進(jìn)雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素的溶出度測(cè)定方法。方法：采用槳法進(jìn)行溶出試驗(yàn)，以0.1mol/L鹽酸溶液為溶出介質(zhì)，溶出介質(zhì)體積為500m L，轉(zhuǎn)速為75 r/m in，取樣時(shí)間為45m in；樣品前處理中加入3.6%氫氧化鈉溶液的體積由原來(lái)的5 m L改為20m L，加入磷酸的體積由原來(lái)的0.2m L改為0.7m L。采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中雙氫青蒿素的溶出度：色譜柱為YMC-Pack ODS-A，流動(dòng)相為0.02mol/L磷酸氫二鈉溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH為2.4）-乙腈（65∶35，V/V），流速為1.0m L/m in，檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL。結(jié)果：雙氫青蒿素檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為7.802～117.03μg/m L（r＝0.999 9）；定量限為2.0 ng，檢測(cè)限為0.6 ng；精密度、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜1.0%；回收率為99.18%～100.46%（RSD＝0.45%，n＝9）。3批樣品中雙氫青蒿素的平均溶出度分別為94.9%、77.9%、89.6%。結(jié)論：改進(jìn)后的方法提高了其靈敏度、溶出度以及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

雙氫青蒿素哌喹片；雙氫青蒿素；溶出度測(cè)定；方法改進(jìn)

雙氫青蒿素哌喹片為雙氫青蒿素和磷酸哌喹的復(fù)方制劑。雙氫青蒿素為青蒿素的衍生物[1-2]，能迅速控制癥狀和殺滅瘧原蟲[3]。磷酸哌喹是一種長(zhǎng)效抗瘧疾藥物[4]，能使滋養(yǎng)體食物泡膜和線粒體腫脹，導(dǎo)致其生理功能的破壞，從而殺死瘧原蟲[5]。體外藥效學(xué)研究顯示，雙氫青蒿素與磷酸哌喹合用具有協(xié)同作用[6]，可延緩瘧原蟲抗藥性的產(chǎn)生[7]。雙氫青蒿素哌喹片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2010年版《中國(guó)藥典》（第一增補(bǔ)本）[8]。但在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素測(cè)定回收率偏低，溶出度測(cè)定結(jié)果也偏低。根據(jù)國(guó)家藥典委員會(huì)下達(dá)的全球基金項(xiàng)目國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高課題任務(wù)以及藥品生產(chǎn)企業(yè)對(duì)雙氫青蒿素哌喹片公示標(biāo)準(zhǔn)的反饋意見，為了更好地控制和評(píng)價(jià)企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量，本課題組經(jīng)試驗(yàn)研究，通過在樣品前處理中增加3.6%氫氧化鈉溶液和磷酸的體積，使溶液中雙氫青蒿素衍生更加完全，以達(dá)到提高回收率和溶出度測(cè)定結(jié)果的目的。本研究改進(jìn)的方法已收載于2015年版《中國(guó)藥典》（二部）[9]，現(xiàn)將有關(guān)情況報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

AT 7smart型溶出儀，包括CY7-50活塞泵及C613收集器（瑞士SOTAX公司）；ZKT-18型真空脫氣機(jī)（天津天大天發(fā)科技有限公司）；e2695型高效液相色譜（HPLC）儀，包括2489型紫外-可見吸收檢測(cè)器及Empower工作站（美國(guó)Waters公司）；KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：200W，頻率：40 kHz）；BSA224S-CW型萬(wàn)分之一電子天平及ME215S型十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

雙氫青蒿素哌喹片（華立巖康制藥有限公司，批號(hào)：010212、011110、010512，規(guī)格：每片含雙氫青蒿素40 mg、磷酸哌喹320mg）；雙氫青蒿素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100184-201202，純度：99.94%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：YMC-Pack ODS-A（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.02mol/L磷酸氫二鈉溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH為2.4）-乙腈（65∶35，V/V）；流速：1.0m L/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取雙氫青蒿素對(duì)照品20mg，置于50m L量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，精密量取適量，置于10m L量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，于37℃保溫45 m in，放冷至室溫，即得質(zhì)量濃度為390.1μg/m L的對(duì)照品貯備液。取上述對(duì)照品貯備液5 m L，置于25m L量瓶中，用3.6%氫氧化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，置于60℃水浴中反應(yīng)30m in，取出放冷至室溫，精密加入磷酸0.7m L，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，采用2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄ⅩC“溶出度測(cè)定”第二法（槳法），以0.1mol/L鹽酸溶液為溶出介質(zhì)，溶出介質(zhì)體積為500 m L，轉(zhuǎn)速為75 r/min，依法操作，于45min時(shí)取溶出液適量，作為供試品貯備液。取上述供試品貯備液5m L，置于25m L量瓶中，用3.6%氫氧化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，置于60℃水浴中反應(yīng)30min，取出放冷至室溫，精密加入磷酸0.7m L，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的處方稱取輔料（含磷酸哌喹）適量，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞2.0；理論板數(shù)以雙氫青蒿素衍生物1峰計(jì)＞3 000，保留時(shí)間為4.65m in。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 m L，各置于50 m L量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，于37℃保溫45m in，放冷至室溫，即得系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各20μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以雙氫青蒿素質(zhì)量濃度（x，μg/m L）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝0.000 03x－0.023 1（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，雙氫青蒿素檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為7.802～117.03μg/m L。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限（LOD）。結(jié)果，雙氫青蒿素的LOQ為2.0 ng，LOD為0.6 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，雙氫青蒿素峰面積的RSD＝0.20%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：010212）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，雙氫青蒿素峰面積的RSD＝0.46%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

取低、中、高質(zhì)量的雙氫青蒿素對(duì)照品適量，共9份，再按樣品的處方比例加入空白輔料（含磷酸哌喹）適量，分別置于500m L量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，各取適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.9 溶出介質(zhì)的選擇

取樣品（批號(hào)：010212）適量，分別以水、0.1mol/L鹽酸溶液、pH 4.0醋酸鹽緩沖液和pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，溶出介質(zhì)體積為500m L，轉(zhuǎn)速為75 r/m in，于5、15、30、45、60m in時(shí)取樣（同時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)的溶出介質(zhì)10m L），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，考察樣品在4種溶出介質(zhì)中的平均累積溶出度，結(jié)果見圖2。由圖2可知，樣品在4種溶出介質(zhì)中的溶出行為均相似。但是在0.1mol/L鹽酸溶液中的各溶出時(shí)間點(diǎn)的平均累積溶出度均較高，因此選擇0.1mol/L鹽酸溶液為溶出介質(zhì)。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Resultsof recovery tests（n＝9）

圖2 樣品在4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線Fig 2 Dissolution curvesof samples in 4 kindsof dissolutionmediums

2.10 轉(zhuǎn)速的確定

取樣品（批號(hào)：010212）適量，以0.1mol/L鹽酸溶液為溶出介質(zhì)，溶出介質(zhì)體積為500m L，轉(zhuǎn)速分別為50、75 r/min，于5、15、30、45、60min時(shí)取樣（同時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)的溶出介質(zhì)10m L），并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，考察樣品在不同轉(zhuǎn)速、不同時(shí)間點(diǎn)的平均累積溶出度，結(jié)果見表2。由表2可知，75 r/min轉(zhuǎn)速的平均累積溶出度較好，因此選擇75 r/min為本試驗(yàn)的轉(zhuǎn)速。

表2 樣品在不同轉(zhuǎn)速及不同時(shí)間點(diǎn)的平均累積溶出度（n＝6，%）Tab 2 Average accumulative dissolution of samplesat different rotation speeds and different time points（n＝6，%）

2.11 取樣時(shí)間的確定

取樣品（批號(hào)：010212）適量，共6份，以0.1mol/L鹽酸溶液為溶出介質(zhì)，溶出介質(zhì)體積為500m L，轉(zhuǎn)速為75 r/m in，于5、15、30、45、60m in時(shí)取樣（同時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)的溶出介質(zhì)10m L），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，考察樣品在不同時(shí)間點(diǎn)的平均累積溶出度，結(jié)果見圖3。由圖3可知，樣品在45 min時(shí)溶出曲線達(dá)到平臺(tái)期。

圖3 樣品在不同時(shí)間點(diǎn)的溶出曲線（n＝6）Fig 3 Dissolution curves of samples at different time points（n＝6）

2.12 濾膜吸附試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下濾過前和濾過后的對(duì)照品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算吸附量。結(jié)果，0.45μm微孔濾膜對(duì)雙氫青蒿素的吸附量＜2.0%（n＝6），符合規(guī)定[10]。

2.13 樣品溶出度測(cè)定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算溶出度（要求≥標(biāo)示量的70%）；同時(shí)，以2010年版《中國(guó)藥典》（第一增補(bǔ)本）的方法測(cè)定溶出度，結(jié)果見表3。

表3 樣品溶出度測(cè)定結(jié)果（n＝6，%）Tab 3 Results of dissolution determ ination of samples（n＝6，%）

3 討論

本課題組曾取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：010212）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、6、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，供試品溶液在室溫下放置2 h后，其中的雙氫青蒿素峰面積呈顯著遞減趨勢(shì)，因此本試驗(yàn)制備的供試品溶液應(yīng)在2 h內(nèi)完成測(cè)定。

因?yàn)殡p氫青蒿素存在α和β兩種差向異構(gòu)體，在不同溶劑中溶解兩種異構(gòu)體可能會(huì)相互轉(zhuǎn)換且雙氫青蒿素中無(wú)共軛結(jié)構(gòu)和發(fā)色基團(tuán)，不宜用分光光度法和HPLC法直接測(cè)定?？紤]到雙氫青蒿素含內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，在堿性條件下易水解，能得到更加穩(wěn)定和紫外吸收更強(qiáng)的衍生物（雙氫青蒿素衍生物1和2）。故本試驗(yàn)將樣品前處理中加入3.6%氫氧化鈉溶液體積由5 m L改為20 m L，加入磷酸的體積由0.2m L改為0.7m L，使其衍生更加完全，使其定量更準(zhǔn)確；且所有方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)均按外標(biāo)法以雙氫青蒿素衍生物1和2的峰面積之和計(jì)算結(jié)果。

按2010年版《中國(guó)藥典》（第一增補(bǔ)本）[8]方法測(cè)定，3批樣品的平均溶出度分別為83.1%、71.0%、86.8%；而按本試驗(yàn)方法測(cè)定，3批樣品的平均溶出度分別為94.9%、77.9%、89.6%，溶出度測(cè)定結(jié)果顯示靈敏度明顯提高。

綜上所述，改進(jìn)后的方法提高了其靈敏度、溶出度以及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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[8] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：第一增補(bǔ)本[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2012：271.

[9] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：95.

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Improvement of Determ ination Method for the Dissolution of Dihydroartem isinin in Dihydroartem isinin and Piperaquine Phosphate Tablets

ZHANG M ian，LIChao（Chongqing Institute for Drug and Food Control，Chongqing 401121，China）

OBJECTIVE：To improve the detection method for the dissolution of dihydroartem isinin in Dihydroartem isinin and piperaquine phosphate tablets.METHODS：The dissolution experiment adopted paddlemethod using 0.1mol/L hydrochloric acid solution 500m L as solventw ith rotating speed of 75 r/m in and sampling time of 45m in.In sample pre-treatment，the volume of 3.6% sodium hydroxide solution was increased from 5 m L to 20 m L，and that of phosphoric acid was increased from 0.2 m L to 0.7 m L. HPLC was adopted to determ ine the dissolution of dihydroartem isinin.The determ ination was performed on YMC-Pack ODS-A column w ith mobile phase consisted of 0.02 mol/L disodium hydrogen phosphate solution（pH adjusted to 2.4 using phosphoric acid）-acetonitrile（65∶35，V/V）at the flow rate of 1.0m L/min.The detection wavelength was set at 237 nm，and column temperature was 30℃.The sample size was 20μL.RESULTS：The linear range of dihydroartem isinin were 7.802-117.03μg/m L（r＝0.999 9）.The limit of quantitation was2.0 ng，and the limit of detection was 0.6 ng.RSDsof precision and reproducibility testswere all lower than 1.0%.The recoverieswere 99.18%-100.46%（RSD＝0.45%，n＝9）.Average dissolutionsof dihydroartem isinin in 3 batchesof sampleswere 94.9%，77.9%，89.6%，respectively.CONCLUSIONS：Improved method enhance the accuracy for the lim it of sensitivity，dissolution and detection results.

Dihydroartem isinin and piperaquine phosphate tablets；Dihydroartem isinin；Dissolution determ ination；Method improvement

R 927.2

A

1001-0408（2017）15-2086-04

2016-05-31

2016-11-30）

（編輯：劉 柳）

全球基金項(xiàng)目國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高課題（No. GF2012.39）

＊主管藥師。研究方向：藥物分析。電話：023-86072743。E-mail：7183503@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.15.20