掀開土壤生物“暗物質”
——土壤病毒的神秘面紗*

王光華

中國科學院東北地理與農業(yè)生態(tài)研究所 哈爾濱 150081

掀開土壤生物“暗物質”
——土壤病毒的神秘面紗*

王光華

中國科學院東北地理與農業(yè)生態(tài)研究所 哈爾濱 150081

病毒是地球上數(shù)量最多的生命體，在調控寄主群落結構、促進元素生物地球化學循環(huán)和生物進化中起到重要的作用。病毒被喻為生物“暗物質”。近年來，海洋環(huán)境下病毒生態(tài)學研究進展迅速；與此相反，在陸地生態(tài)系統(tǒng)，特別是土壤環(huán)境中病毒研究進展緩慢。文章從生態(tài)學角度對目前有關土壤病毒豐度、形態(tài)多樣性、基因多樣性、研究方法和生態(tài)功能等進行簡要的闡述，目的在于呼吁從事土壤微生物和土壤生態(tài)學研究的工作者重視對土壤病毒的研究工作，從而促進土壤病毒生態(tài)學科的發(fā)展。

土壤病毒，噬菌體，多樣性，宏基因組，病毒生態(tài)

DOI 10.16418/j.issn.1000-3045.2017.06.004

“病毒”是令人感到不愉快，甚至感到恐懼的詞匯。提起病毒，人們自然而然地想到它是引起多種農作物病害和人畜疾病的重要元兇，特別是與人類健康和生命息息相關的多種流行性、難治愈的傳染性疾病的病原多是由病毒引起的，如流感病毒、SARS病毒、艾滋病病毒和埃博拉病毒等。故此人們“談毒色變”，希望人類生活環(huán)境中最好遠離病毒，甚至希望病毒從地球上消失。但在現(xiàn)實生活中，這種想法是無法實現(xiàn)的，因為病毒是地球生物圈中數(shù)量最多的生命體，保守估算全球病毒數(shù)量 >1031[1]。凡是有生物的地方都會存在病毒，病毒是無處不在的，同時病毒也是地球生態(tài)系統(tǒng)不可或缺的重要成員。

1 生命之樹與生命第四域

1977 年，Woese 依據(jù)核糖體核苷酸序列將生物劃分為細菌域、古菌域和真核生物域，從而構建了生命之樹。地球上所有具有細胞結構的生物在這棵枝繁葉茂的大樹上都可找到自己的位置，但這顆大樹上沒有病毒的位次。病毒無法置于生命之樹上的原因一方面是病毒結構簡單，主要由外殼蛋白和包裹在外殼蛋白內的核酸兩部分組成，沒有核糖體結構，無法進行比較；另一方面過去人們認為病毒不能獨立進行自我繁殖，不屬于生物，不應該置于生命之樹上。但最近巨大的咪咪病毒（Mimivirus）和潘多拉病毒（Pandoravirus）的發(fā)現(xiàn)，顛覆了人們對病毒知識的認識，巨型病毒的發(fā)現(xiàn)有可能將病毒劃分為生命的第四個域——病毒域[2]。Brüssow[3]認為在地球上至少存在兩套大的DNA序列空間，一套是基于殼蛋白編碼的病毒（capsid-encoding viruses），另一套則是基于核糖體編碼的有細胞生物（ribosome-encoding cells）。Rohwer 和 Edwards[4]依據(jù) 105 個完整測序噬菌體氨基酸序列，構建并提出了噬菌體蛋白組樹（Phage Proteomic Tree）的分類方法。他們發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)發(fā)育樹與國際病毒分類委員會（ICTV）制定的分類系統(tǒng)相吻合，這表明病毒的分類進入后基因組時代（post-genomic era）。事實上，細菌、古菌和真核生物中的每一個生物體都被一種或多種病毒所侵染，而正是由于病毒作為遺傳物質“搬運工”所起到的穿梭作用，才推動了地球生物的進化演替，才會形成如此豐富多彩的地球生態(tài)系統(tǒng)。

2 土壤生物“暗物質”——土壤病毒

土壤是微生物的主要棲息地，包括細菌、真菌、古菌、原生動物等，而這些微生物均受到各種各樣病毒的侵染，所以土壤也是病毒最主要的分布場所。近年來，海洋、湖泊等水生環(huán)境中病毒生態(tài)學研究進展非常迅速；與此相對應，由于受到土壤異質性和土壤隔離的限制，學術界對土壤中病毒的研究和認識非常有限。鑒于我們對自然環(huán)境中病毒知識的匱乏，病毒常被比喻為生物界中的“暗物質”[5]，那么土壤病毒無疑是土壤生物中的“暗物質”。我們對土壤病毒的了解尚處于初始階段，土壤病毒多樣性及生態(tài)功能有待學術界的共同努力，以期揭開神秘的面紗。

2.1 土壤病毒存在狀態(tài)及數(shù)量

土壤中原核微生物（細菌和古菌）的數(shù)量遠大于真核生物，侵染原核微生物的病毒被稱為噬菌體，因此噬菌體是土壤中主要的病毒類群。眾所周知，噬菌體生活史存在兩種狀態(tài)（烈性噬菌體和溶原性噬菌體），以及病毒粒子被土壤顆粒吸附和病毒粒子微小等原因，對土壤病毒數(shù)量的精確測定一直以來是一個挑戰(zhàn)性的課題[6]。

大約 99% 的土壤微生物是不可培養(yǎng)的，目前對土壤微生物數(shù)量測定普遍采用的方法是定量 PCR 技術，但該技術無法用于測定土壤中病毒數(shù)量。其原因是病毒的基因序列變異非常大，在病毒中沒有發(fā)現(xiàn)存在共有的保守序列，因此無法設計通用引物，進而不能通過定量 PCR 技術檢測到土壤中病毒的數(shù)量。但對某些特定病毒，可以基于該病毒基因組序列的測序結果，設計引物，檢測其在土壤中的動態(tài)變化[7]。

土壤病毒（主要是噬菌體）存在狀態(tài)有 3 種：少部分病毒以游離狀態(tài)存在，大部分病毒（超過 90%）被土壤顆粒吸附而固定，其他部分則以溶原狀態(tài)存在于寄主細胞中。土壤礦物組成、陽離子交換量、有機質含量、pH 值、離子濃度等，以及病毒種類都會影響到病毒在土壤中的吸附量[6]，所以測定土壤病毒數(shù)量的前提是要將病毒粒子從土壤中分離出來。人工配制的多種提取劑，如營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)液、牛肉浸膏、甘油溶液、焦磷酸鈉和檸檬酸鉀溶液等常被用來分離提取土壤中的病毒。不同提取劑對病毒的提取效率存在差異，有研究發(fā)現(xiàn)，10% 的牛肉浸膏和 250 mmol/L 的甘油溶液對接種到土壤中的噬菌體提取效果好，但 1% 的檸檬酸鉀溶液從自然土壤中提取出的病毒顆粒最多，平均為 1.5×109VLP（viruslike particle）/克干土[8]。由于牛肉浸膏和甘油溶液的粘滯性，對后期病毒的濃縮和提純有妨礙，所以采用無機鹽類溶液作為土壤病毒提取劑會更合適。

傳統(tǒng)的土壤病毒計數(shù)方法是采用透射電鏡觀察，這種方法成本高，費時費力。而將病毒顆粒用核酸染料染色，然后采用熒光顯微鏡觀察計數(shù)是目前快速測定環(huán)境樣品中病毒數(shù)量的主流做法。采用該方法研究發(fā)現(xiàn)，海水中病毒數(shù)量在 105—107VLP/mL[9,10]，河口或湖泊中病毒數(shù)量可達到 108VLP/mL[11]；相對于水體環(huán)境，土壤中病毒豐度可高達 109VLP/ 克干土[12]。不同土地利用方式對土壤病毒豐度影響很大，森林土壤中病毒數(shù)量在1.31×109—4.17×109VLP/ 克干土之間，明顯高于農業(yè)土壤中的病毒數(shù)量（0.87×109—1.1×109VLP/ 克干土）[13]；Chen 等人[14]發(fā)現(xiàn)不同施肥處理下紅壤耕作層病毒數(shù)量在1.34×107—13.1×107VLP/ 克干土之間，以施用氮磷鉀化肥（NPK）配施有機肥（M）處理最高，單施氮肥（N）處理最低。需要指出的是由于浸提劑提取效率的限制，以及部分土壤細菌存在溶原性噬菌體[15]，真實的土壤病毒數(shù)量要高于觀測到的數(shù)值。

病毒與細菌的比值（VBR）也是表征環(huán)境病毒數(shù)量狀況的一個指標。不同環(huán)境中的 VBR 相差很大，海洋和湖泊水體環(huán)境中 VBR 在 3—25 之間[9,10,16]，稻田田面水VBR 在 0.11—72 之間[17]。與水體環(huán)境相比較，土壤環(huán)境中 VBR 變化較大，如農田土壤中 VBR 大約 3 000，森林土壤中 VBR 為 10[13]，而在沙漠表層土壤中的 VBR 數(shù)量只有 0.15—1.66[18]。此外，Swanson 等人[19]發(fā)現(xiàn)小麥根際病毒數(shù)量沒有體現(xiàn)出明顯的根際效應，從而導致非根際土壤的 VBR 明顯高于根際土壤（非根際為 4.68，根際為0.27）。土壤環(huán)境中 VBR 數(shù)值變化幅度大，表明調控土壤病毒數(shù)量的因子不單單取決于其寄主細胞的數(shù)量，其他土壤非生物因子也可能起到非常重要的作用。總體而言，環(huán)境中的病毒數(shù)量至少要高出其寄主數(shù)量的 10 倍[4]。

2.2 土壤病毒形態(tài)

土壤病毒形態(tài)是多樣的。由于病毒粒子微小，對病毒形態(tài)的觀察只能借助于電子顯微鏡技術。Williamson 等人[13]發(fā)現(xiàn)美國特拉華州土壤中病毒主要存在形式是噬菌體，且以有尾噬菌體為主；在有尾噬菌體中短尾噬菌體（Podophage）和長尾噬菌體（Siphophage）所占的比例高于肌尾噬菌體（Myophage）；他們還發(fā)現(xiàn)土壤中存在線型（Filamentous）和頭部長型的噬菌體。而 Swanson 等人[19]對英國一個地點小麥根際和非根際土壤樣品研究發(fā)現(xiàn)，根際與非根際土壤不同形態(tài)病毒分布比例沒有明顯差異，主要以無尾的、小的球型病毒為主，有尾噬菌體所占比例只有 5% 左右，在有尾噬菌體中又以短尾噬菌體為主。同樣，Chen 等人[14]也發(fā)現(xiàn)我國紅壤農田中存在多種病毒形態(tài)，但無尾噬菌體所占的比例明顯高于有尾噬菌體。需要指出的是，由于病毒粒子與土壤顆粒結合緊密，在土壤病毒提取和透射電鏡觀察過程中，一些有尾噬菌體的尾部結構可能會丟失或被截斷，從而妨礙我們對土壤中真實病毒形態(tài)的描述[20]。

環(huán)境中病毒頭部大小也是用來描述病毒形態(tài)的指標之一。海水、湖泊及稻田田面水中病毒頭部大小在 30—60 nm 之間，頭部小于 30 nm 和大于 100 nm 的病毒所占比例很小[9,10,21,22]。病毒粒子大小與其侵染寄主類型有一定的關聯(lián)性，一般侵染原核微生物的噬菌體頭部尺寸小，而感染真核生物的病毒頭部尺寸大，如感染真核藻類病毒的頭部大小平均為 150 nm[23]。最近，有科學家從智利海岸河流沉積物和澳大利亞淡水池塘泥漿中分離獲得了兩株感染變形蟲的巨大病毒，即潘多拉病毒，其直徑可達 1 000 nm[24]。這突破了人們對病毒粒子大小的認知，引發(fā)學術界的廣泛關注。

2.3 溶源性噬菌體

土壤中還有一部分病毒為溫和性噬菌體，溫和性噬菌體是以溶源狀態(tài)存在于寄主細胞中。處于溶源狀態(tài)的噬菌體在土壤中具有獨特的生存優(yōu)勢，特別是在寄主分布不均勻[25]、寄主豐度低[26,27]或寄主細胞營養(yǎng)狀況不良[26,28]的情況下，溶源狀態(tài)是確保噬菌體在寄主種群中長期存活的最有效的生存策略。研究發(fā)現(xiàn)土壤中溶源性噬菌體占的比例要遠高于海洋環(huán)境[15]，大約 30% 從土壤中分離到的可培養(yǎng)細菌中含有溶源性噬菌體[29]，而采用非培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn)有 22%—68% 的溫帶土壤和 4%—20% 南極的寒地土壤中檢測到有溶源性噬菌體的存在[15]。溶源性噬菌體也是極端沙漠條件下噬菌體生存的主要方式。研究發(fā)現(xiàn)，撒哈拉沙漠表層沙子溫度高，游離的病毒顆粒難以存活，從表層沙子中不能直接提取和觀察到病毒粒子的存在，但將沙子中細菌細胞進行絲裂霉素 C 處理后，發(fā)現(xiàn)釋放出大量的有尾噬菌體[30]。此外，對已測序完成的土壤細菌全基因組分析發(fā)現(xiàn)，多個細菌基因組中含有1個或多個前噬菌體元件（prophage element）[31]。前噬菌體元件可能攜帶有利于特定條件下寄主生存和增殖的基因，從而使土壤病毒通過基因溶源性轉換（lysogenic conversion）方式使寄主獲得新的性狀和功能，從而具有更強的環(huán)境適應能力和生存優(yōu)勢[32-34]。

2.4 土壤病毒遺傳基因多樣性

自然環(huán)境中不同病毒基因組大小存在差異，利用脈沖場凝膠電泳（PFGE）技術可以粗略地對環(huán)境病毒基因組大小進行區(qū)分，對病毒群落結構組成進行解析[35-37]。目前利用 PFGE 技術主要是針對水體環(huán)境中的病毒群落進行研究，尚未見針對土壤環(huán)境的研究報道。為了進一步較為精確地解析環(huán)境中病毒群落結構組成，Winget 和 Wommack[38]提出采用 RAPD-PCR 技術研究環(huán)境病毒群落結構的方法。Srinivasiah 等人[39]采用該技術對南極土壤和溫帶土壤病毒群落結構進行了研究，發(fā)現(xiàn)病毒群落結構因不同地區(qū)類型和土地利用方式存在較大差異。采用 RAPD-PCR 技術解析環(huán)境病毒遺傳基因多樣性的前提條件是要確保提取到的環(huán)境病毒遺傳物質中不含其他生物遺傳物質的污染。

采用特定的引物 PCR 擴增不同的分子標記基因是解析環(huán)境微生物基因多樣性和群落結果組成的常用方法。遺憾的是，到目前為止，在病毒中沒有發(fā)現(xiàn)可用于所有病毒基因多樣性研究的保守序列[40]。但最近宏基因組研究發(fā)現(xiàn)，病毒某些家族的結構或功能蛋白氨基酸片段序列高度保守，利用這些保守氨基酸片段序列設計出的簡并性引物，可用于 PCR 擴增出環(huán)境中相關基因序列，用于解析病毒遺傳基因多樣性[4]。這些基因主要有 T4 型噬菌體的 g23 基因[41,42]，藍藻噬菌體的 g20[43,44]、psbA 和 psbD 基因[45,46]，T7 型噬菌體的 DNA pol 基因[47,48]等。2014 年 Adriaenssens 和 Cowan[49]在 Applied and Environmental Microbiology 撰文詳細列舉了多個可用于環(huán)境病毒生態(tài)學和多樣性研究的分子標記基因。需要指出的是，到目前為止，針對上述噬菌體基因研究主要集中在海洋、湖泊、稻田等水體環(huán)境，而針對土壤環(huán)境研究很少。Srinivasiah 等人[50]對美國旱地土壤中 g23、g20 和 DNA pol 基因進行 PCR 擴增，但均未成功。他們認為土壤與水體環(huán)境相差巨大，從而導致土壤中病毒組成與水體中完全不同，用于研究水體病毒基因組成的 PCR 引物可能不適合用于土壤環(huán)境。近年來，筆者所在研究團隊致力于開展針對東北稻田和黑土中噬菌體基因多樣性的研究工作。我們成功地從旱地黑土農田中捕獲到了 T4 型噬菌體 g23 基因，發(fā)現(xiàn)旱地黑土農田 g23 基因分布與其在海洋和湖泊水體環(huán)境中完全不同，而是與稻田環(huán)境相近，但也有多個新的黑土類群存在[51,52]。此外，我們還利用研究海洋中噬菌體多樣性的多對引物，對東北稻田生態(tài)系統(tǒng)包括水體和土壤中多個分子標記基因組成進行了解析，揭示出稻田生態(tài)系統(tǒng)中病毒也含有與寄主功能相似的輔助代謝基因 psbA 和 phoH，發(fā)現(xiàn)稻田噬菌體群落結構組成與海洋海水和湖泊淡水環(huán)境完全不同，發(fā)現(xiàn)和建立了多個稻田獨特的噬菌體類群。由此可見，我們有限的研究結果已表明在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，特別是土壤中，生存著遺傳信息獨特的病毒類群，土壤中的病毒是一個尚待挖掘的寶貴基因庫。

3 環(huán)境病毒宏基因組學研究

隨著測序技術的發(fā)展，高通量測序技術越來越多地應用到環(huán)境微生物生態(tài)學研究工作中。鑒于目前在病毒中沒有發(fā)現(xiàn)通用引物，所以不依賴于特定引物擴增的病毒宏基因組學研究是近年來國際上一個研究熱點[53-57]。事實上，與其他環(huán)境微生物宏基因組學相比較，病毒是最適宜研究其宏基因組的一類生命體。這一方面歸因于環(huán)境病毒體積小（除巨大病毒外），易于將其從環(huán)境中分離出來，且病毒外部包裹著牢固的蛋白質外殼，保護內部遺傳物質不被外部核酸酶降解，從而便于分離提純病毒遺傳物質；另一方面也與病毒基因組?。ㄌ貏e是噬菌體），在基因序列拼接組裝和基因信息分析上具有明顯的優(yōu)勢有關[58-60]。環(huán)境病毒不僅包含侵染原核生物的噬菌體，還含有侵染真核生物，如植物、動物、原生生物和真菌等的病毒，所以對環(huán)境病毒宏基因組學的解析就不單純只是噬菌體，還含有其他病毒。但由于環(huán)境中原核生物相對其他生物而言數(shù)量巨大，所以在環(huán)境病毒中，以侵染細菌和古菌的噬菌體占絕大部分。

環(huán)境病毒宏基因組學研究的關鍵是如何確保獲得的病毒遺傳物質不含寄主遺傳物質的污染。為此，許多學者進行了多種研究方法上的探討，包括微孔濾膜過濾法、DNase和RNase消解病毒濃縮液中寄主游離遺傳物質法、PEG病毒濃縮、FeCl3或CsCl超離心收集病毒等[56,61,62]。Thurber等[59]在 Nature Protocols 雜志上撰文，歸納介紹了如何從水體樣品中收集、濃縮病毒遺傳物質以用于病毒宏基因組學研究的方法。該文以及后續(xù)陸續(xù)報道的新的研究方法為環(huán)境病毒宏基因組學研究提供了有價值的參考。病毒宏基因組學研究另一個需要考慮的問題是提取到的病毒遺傳物質量很少，不能直接用于高通量測序。因此，必須經(jīng)過體外擴增以增加病毒遺傳物質的含量，通常采用的方法：一是采用 Phi29 DNA 聚合酶進行擴增，即多重置換擴增（MDA）技術[57,59]；二是采用連接擴增（LASL）技術。Kim 和 Bae[63]發(fā)現(xiàn)這兩種擴增技術在解析病毒宏基因組組成存在差異，采用 MDA 得到的病毒數(shù)據(jù)多是來自單鏈 DNA 病毒，只有極小部分屬于雙鏈 DNA 病毒；而采用 LASL 得到的病毒數(shù)據(jù)全部來自于雙鏈 DNA 病毒。

對環(huán)境病毒宏基因組數(shù)據(jù)的解析和分析是目前制約該領域研究的另一個瓶頸問題。由于環(huán)境病毒數(shù)據(jù)庫的匱乏，研究者獲得的絕大多數(shù)數(shù)據(jù)來源不清，為未知序列。即使在剩下的已知序列中，也只有很小一部分被歸為病毒范疇，大部分屬于細菌，還有一部分屬于真核生物和古菌范圍[53,55,57]。得到這樣結果并不奇怪，因為病毒在進化過程中不斷地從寄主處獲得新基因，以利于其生存；同時病毒也將自身攜帶的遺傳基因，通過水平移動的方式傳遞給寄主，從而促進寄主的進化或獲得新的功能。雖然只有部分宏基因組序列可歸為已知病毒序列，但目前對這些序列的分析還僅限于不同病毒家族所占的相對比例，深度分析還很缺乏。國際上對環(huán)境病毒基因組學研究多是針對水體環(huán)境[64-66]，針對土壤環(huán)境中病毒宏基因組研究還很少報道。

4 土壤病毒的生態(tài)功能

盡管土壤中病毒豐度很高，但科學界對土壤病毒的生態(tài)功能知之甚少，對土壤病毒生態(tài)功能的推測主要是基于海洋生態(tài)系統(tǒng)的相關研究發(fā)現(xiàn)。從大的方面來講，環(huán)境病毒的生態(tài)功能主要有 3 方面：（1）調控寄主群落結構。眾所周知，自然生態(tài)系統(tǒng)中有兩種主要現(xiàn)象調控微生物群落結構，即從底向上（Bottom-up）和從上而下（Top-down）的兩個生態(tài)過程[67,68]。噬菌體調控細菌群落結構是一種經(jīng)典的 Top-down 調控，雖然學術界意識到該調控作用的重要性，但對這一調控過程的研究還處于黑箱狀態(tài)，已有的報道主要是針對特定噬菌體及其寄主的動態(tài)變化[69]，尚缺乏群落水平的研究結果。唯一見到的一篇相關文章是 Allen 等人[70]以茶提取物作為噬菌體抑制劑添加到阿拉斯加土壤中，發(fā)現(xiàn)添加茶提取物顯著地降低了土壤中噬菌體數(shù)量，但增加了微生物生物量和土壤呼吸速率，但該文對細菌群落結構是否產(chǎn)生影響沒有報道。（2）直接或間接參與元素地球化學循環(huán)。病毒的這種作用體現(xiàn)在它的感染率、致死率、病毒的周轉時間和巨大的病毒數(shù)量上。病毒感染在引起寄主細胞死亡裂解的同時，也促發(fā)寄主細胞營養(yǎng)元素釋放到環(huán)境中去，進而促進了元素的生物化學循環(huán)，這種由病毒介導的食物鏈傳遞方式叫做 Viral loop。有報道指出，在海洋中由病毒推動的碳循環(huán)量占該生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)總量的 6%—26%[9]。與此相對應，土壤病毒，特別是土壤噬菌體在多大程度上促進了元素循環(huán)還未見報道。（3）作為基因水平移動的媒介。這個功能不難理解，正是病毒與寄主的共進化推動了地球生物群落不斷演替，形成了如此多樣性的地球生態(tài)系統(tǒng)[71]。

5 展望

自從 1915 年英國細菌學家 Frederick Twort 和 1917 年法裔加拿大微生物學家 Felix d’Herelle 發(fā)現(xiàn)噬菌體至今，有關病毒的研究工作經(jīng)歷了整整百年的歷程。最初的研究工作主要是針對特定病毒或噬菌體，研究的目的多是從實用角度出發(fā)，如防控植物和動物類病毒性疾病，采用噬菌體療法防治細菌性疾病或病害，等等。進入 21 世紀，伴隨著研究技術的進步，海洋科學家發(fā)現(xiàn)，病毒特別是噬菌體是海洋生態(tài)系統(tǒng)中最豐富的生命體，病毒在海洋生態(tài)系統(tǒng)物質循環(huán)、能量流動，以及維持海洋生物多樣性和生物進化等方面起到重要的作用。與火熱的海洋病毒生態(tài)學研究相反，有關陸地生態(tài)系統(tǒng)，特別是土壤環(huán)境中病毒生態(tài)學的研究卻遠遠滯后。鑒于土壤種類的多樣性和土壤環(huán)境的高度異質性，土壤中病毒組成可能比海洋流動的水體環(huán)境更復雜、更多樣。近 20 年來，我國土壤微生物生態(tài)學研究進展迅速，取得了許多具有顯示度的研究成果，這些微生物包括細菌、真菌和古菌，以及一些功能性的微生物，但很少涉及到土壤中病毒生態(tài)學研究。伴隨著研究手段的進步和人們對環(huán)境病毒生態(tài)功能認識的逐步深化，土壤病毒生態(tài)學研究將是下一階段土壤微生物生態(tài)學研究的熱點領域之一，我國應該迎頭趕上，搶占先機。通過學術界的共同努力，揭示出土壤病毒多樣性、群落結構組成，以及與寄主群體協(xié)同進化關系，明確病毒在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的地位和作用，從而掀開土壤生物“暗物質”——土壤病毒的面紗，促進土壤病毒生態(tài)學的發(fā)展。

1 Suttle C A. Viruses in the sea. Nature, 2005, 437(7057): 356-361.

2 Pennisi E. Ever-bigger viruses shake tree of life. Science, 2013, 341(6143): 226-227.

3 Brüssow B. The not so universal tree of life or the place of viruses in the living world. Philosophical Transactions of Royal Society B, 2009, 364(1527): 2263-2274.

4 Rohwer F, Edwards R. The phage proteomic tree: a genome based taxonomy for phage. Journal of Bacteriology, 2002, 184(16): 4529-4535.

5 生物探索. 噬菌體: 開啟生物宇宙暗物質研究大門. [2013-09-13]. http://www.biodiscover.com/news/research/105866.html.

6 Kimura M, Jia Z J, Nakayama N, et al. Ecology of viruses in soils: past, present and future perspectives. Soil Science and Plant Nutrition, 2008, 54(1): 1-32.

7 Ratti C, Budge G, Ward L, et al. Detection and relative quantitation of soil-borne cereal mosaic virus (SBCMV) and polymyxa graminis in winter wheat using real-time PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods, 2005, 122(1): 95-103.

8 Williamson K E, Wommack K E, Radosevich M. Sampling natural viral communities from culture-independent analyses. Applied Environmental Microbiology, 2003, 69(11): 6628-6633. 9 Weinbauer M G. Ecology of prokaryotic viruses. FEMS Microbiology Reviews, 2004, 28(2), 127-181.

10 Wommack K E, Colwell R R. Virioplankton: viruses in aquatic ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2000, 64(1): 69-114.

11 Hennes J E, Suttle C A. Direct of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnology and Oceanography, 1995, 40: 1050-1055.

12 Reavy B, Swanson M M, Taliansky M. Viruses in soil. In: Dighton J, Krumins J A. (eds.). Interactions in Soil: Promoting Plant Growth. Netherlands: Springer, 2014. 163-180.

13 Williamson K E, Radosevich M, Wommack K E. Abundance and diversity of viruses in six Delaware soils. Applied Environmental Microbiology, 2005, 71(6): 3119-3125.

14 Chen L, Xun W B, Sun L, et al. Effect of different long-term fertilization regimes on the viral community in an agriculturalsoil of Southern China. European Journal of Soil Biology, 2014, 62(6): 121-126.

15 Williamson K E, Radosevich M, Smith D W, et al. Incidence of lysogeny within temperate and extreme soil environments. Environmental Microbiology, 2007, 9(10): 2563-2574.

16 Fuhrman J A. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects. Nature, 1999, 399(6736): 541-548.

17 Nakayama N, Okumura M, Inoue K, et al. Seasonal variations in abundances of virus-like particles and bacteria in the floodwater of a Japanese paddy field. Soil Science and Plant Nutrition, 2007, 53(4): 420-429.

18 Gonzalez-Martin C, Teigell-Perez N, Lyles M, et al. Epifluorescent direct counts of bacteria and viruses from topsoil of various desert storm regions. Research in Microbiology, 2013, 164(1): 17-21.

19 Swanson M M, Fraser G, Daniell T J, et al. Viruses in soils: morphological diversity and abundance in the rhizosphere. Annals of Applied Biology, 2009, 155(1): 51-60.

20 Williamson K E, Helton R R, Wommack K E. Bias in bacteriophage morphological classification by transmission electron microscopy due to breakage or loss of tail structures. Microscopy Research and Technique, 2012, 75(4): 452-457.

21 Proctor L M. Advances in the study of marine viruses. Microscopy Research Technique, 1997, 37(2): 136-161.

22 Nakayama N, Okumura M, Inoue K, et al. Morphological analysis of viral communities in the floodwater of a Japanese paddy field. Soil Biology & Biochemistry, 2008(12), 39: 3187-3190.

23 Van Etten J L, Lane K C, Meints R H. Viruses and virus like particles of eukaryotic algae. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1991, 55(4): 586-620.

24 Philippe N, Legendre M, Doutre G, et al. Pandoraviruses: Amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic Eukaryotes. Science, 2013, 341 (6143): 281-286.

25 Stewart F M, Levin B R. The population biology of bacterial viruses: why be temperate. Theoretical Population Biology, 1984, 26(1): 93-117.

26 Marsh P, Wellington E M H. Phage-host interactions in soil. FEMS Microbiology Ecology, 1994, 15(1-2): 99-107.

27 Pantastico-Caldas M, Duncan K E, Lstock C A, et al. Population dynamics of bacteriophage and bacillus subtilis in soil. Ecology, 1992, 73(5): 1888-1902.

28 Williamson S J, Houchin L A, McDaniel L, et al. Seasonal variation in lysogeny as depicted by prophage induction in Tampa Bay, Florida. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68: 4307-4314.

29 Williamson K E, Schnitker J B, Radosevich M, et al. Cultivationbased assessment of lysogeny among soil bacteria. Microbial Ecology, 2008, 56(3):437-447.

30 Prigent M, Leroy M, Confalonieri F, et al. A diversity of bacteriophage forms and genomes can be isolated from the surface sands of the Sahara desert. Extremophiles, 2005, 9(4): 289-296.

31 Srividhya K V, Krishnaswamy S. Identification and analysis of prophages and phage remnants in soil bacteria. In: Witzany G. (ed.). Biocommunication in Soil Microorganisms, Soil Biology 23. Berlin Heidelberg: Springer Verlag, 2010. 137-160.

32 Barksdale L, Arden S B. Persisting bacteriophage infections, lysogeny, and phage conversions. Annual Review of Microbiology, 1974, 28(4): 265-299.

33 Barondess J J, Beckwith J. Bor gene of phage lambda, involved in serum resistance, encodes a widely conserved outer membrane. Journal of Bacteriology, 1995, 177(5): 1247-1253.

34 Waldor M K, Mekalanos J J. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin. Science, 1996, 272: 1910-1914.

35 Wommack K E, Ravel J, Hill R T, et al. Population dynamics of Chesapeake Bay virioplankton: total-community analysisby pulsed-field gel electrophoresis. Applied Environmental Microbiology, 1999, 65(1): 231-240.

36 Steward G F, Montiel J L, Azam F. Genome size distributions indicate variability and similarities among marine viral assemblages from diverse environments. Limnology and Oceanography, 2000, 45(8): 1697-1706.

37 Parada V, Baudoux A C, Sintes E, et al. Dynamics and diversity of newly produced virioplankton in the North Sea. The ISME Journal, 2008, 2(9): 924-936.

38 Winget D, Wommack K E. Randomly amplified polymorphic DNA PCR as a tool for assessment of marine viral richness. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(9): 2077-2092.

39 Srinivasiah S, Lovett J, Polson S, et al. Direct assessment of viral diversity in soils by random PCR amplification of polymorphic DNA. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79(18): 5450-5457.

40 Paul J H, Sullivan M B, Segall A M, et al. Marine phage genomics. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2002, 133(4): 463-476.

41 Filée J, Tétart F, Suttle C A, et al. Marine T4 type bacteriophages, a ubiquitous component of the dark matter of the biosphere. Proceeding National Academy of Science the USA, 2005, 102(35): 12471-12476.

42 Jia Z, Ishihara R, Nakajima Y, et al. Molecular characterization of T4-type bacteriophages in a rice field. Environmental Microbiology, 2007, 9(4): 1091-1096.

43 Zhong Y, Chen F, Wilhelm S W, et al. Phylogenetic diversity of marine cyanophage isolates and natural virus communities as revealed by sequences of viral capsid assembly protein gene g20. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(4): 1576-1584.

44 Short C M, Suttle C A. Nearly identical bacteriophage structural gene sequences are widely distributed in both marine and freshwater environments. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(1): 480-486.

45 Sullivan M B, Lindell D, Lee J A, et al. Prevalence and evolution of core photosystem II genes in marine cyanobacterial viruses and their hosts. PLoS Biology, 2006, 4(8): 1344-1357

46 Chénard C, Suttle C A. Phylogenetic diversity of sequences of cyanophage photosynthetic gene psbA in marine and freshwaters. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(17): 5317-5324.

47 Breitbart M, Miyake J H, Rohwer F. Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences. FEMS Microbiology Letters, 2004, 236(2): 249-256.

48 Labonté J M, Reid K E, Suttle C A. Phylogenetic analysis indicates evolutionary diversity and environmental segregation of marine podovirus DNA polymerase gene sequences. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(11): 3634-3640.

49 Adriaenssens E M, Cowan D A. Using signature genes as tools to assess environmental viral ecology and diversity. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(15): 4470-4480.

50 Srinivasiah S, Bhavsar J, Thapar K, et al. Phages across the biosphere: contrasts of viruses in soil and aquatic environments. Research in Microbiology, 2008, 159(5): 349-357.

51 Wang G, Yu Z, Liu J, et al. Molecular analysis of the major capsid genes (g23) of T4-type bacteriophages in an upland black soil in Northeast China. Biology and Fertility of Soils, 2011, 47(3): 273-282.

52 Liu J, Wang G, Zheng C, et al. Specific assemblages of major capsid genes (g23) of T4-type bacteriophages isolated from upland black soils in Northeast China, Soil Biology and Biochemistry, 2011, 43(9): 1980-1984.

53 Books D J, Smith D L, McDonald J E, et al. 454-pyrosequencing: a molecular battiscope for freshwater viral ecology. Genes, 2010, 1(2): 210-226.

54 Roossinck M J, Saha P, Wiley G B, et al. Ecogenomics: usingmassively parallel pyrosequencing to understand virus ecology. Molecular Ecology, 2010, 19 (Supplement 1): 81-88.

55 Alhamlan F S, Ederer M M, Brown C J, et al. Metagenomicsbased analysis of viral communities in dairy lagoon wastewater. Journal of Microbiological Methods, 2013, 92(2): 183-188.

56 Hurwitz B L, Sullivan M B. The Pacific Ocean Virome (POV): a marine viral metagenomic dataset and associated protein clusters for quantitative viral ecology. PLoS One, 2013, 8(2): 269-284.

57 Fancello L, Trape S, Robert C, et al. Viruses in the desert: a metagenomic survey of viral communities in four perennial ponds of the Mauritanian Sahara. The ISME Journal, 2012, 7(2): 359-369.

58 Angly F E, Felts B, Breitbart M, et al. The marine viromes of four oceanic regions, PLoS Biology, 2006, 4(11): e368.

59 Thurber R V, Haynes M, Breitbart M, et al. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols, 2009, 4(4): 470-483.

60 Bibby K, Viau E, Peccia J. Viral metagenome analysis to guide human pathogen monitoring in environmental samples. Letters in Applied Microbiology, 2011, 52(4): 386-392.

61 John S G, Mendez C B, Deng L, et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environmental Microbiology Reports, 2011, 3(2): 195-202.

62 Hall R J, Wang J, Todd A K, et al. Evaluation of rapid and simple techniques for the enrichment of viruses prior to metagenomic virus discovery. Journal of Virological Methods, 2014, 195(1): 194-204.

63 Kim K H, Bae J W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(21): 7663-7668.

64 Winter C, Garcia J A L, Weinbauer M G, et al. Comparison of deep-water viromes from the Atlantic ocean and the Mediterranean sea. PLoS One, 2014, 9(6): e100600.

65 Martinez J M, Swan B K, Wilson W H. Marine viruses, a genetic reservoir revealed by targeted viromics. The ISME Journal, 2014, 8(5): 1079-1088.

66 Aw T G, Howe A, Rose J B. Metagenomic approaches for direct and cell culture evaluation of thevirological quality of wastewater. Journal of Virological Methods, 2014, 210: 15-21.

67 Lenoir L, Persson T, Bengtsson J, et al. Bottom–up or top–down control in forest soil microcosms? Effects of soil fauna on fungal biomass and C/N mineralization. Biology and Fertility of Soils, 2007, 43(3): 281-294.

68 Thomas W C, David W G S, Stephen M T, et al. Top-down control of soil fungal community composition by a globally distributed keystone consumer. Ecology, 2013, 94(11): 2518-2528.

69 Ashelford K E, Fry J C, Bailey M J, et al. Characterization of six bacteriophages of Serratia liquefaciens CP6 isolated from sugar beet phytosphere. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(5): 1959-1965.

70 Allen B, Willner D, Oechel W C, et al. Top-down control of microbial activity and biomass in an Arctic soil ecosystem. Environmental Microbiology, 2009, 12(3): 642-648.

71 Thingstad T F, Lignell R. Theoretical models for the control of bacterial growth rate, abundance, diversity and carbon demand. Aquatic Microbial Ecology, 1997, 13(1): 19-27.

Lift Mysterious Veil of Soil Virus: ‘Dark Matter’ of Soil Biota

Wang Guanghua
（Northeast Institute of Geography and Agroecology, Chinese Academy of Sciences, Harbin 150081, China）

Viruses are the most abundant biological entities on the Earth, they play important roles in altering their host community structures, driving global biogeochemical cycles, and promoting the biological evolution. Viruses are commonly regarded as ‘dark matter’ of biota. Recently, the researches on viral ecology are progressing rapidly in marine environments, while the corresponding studies in terrestrial ecosystem especially in soil environments were largely lagged. In this paper, the recent research progress on soil virus, such as viral abundance, morphological and genetic diversity, research methodology, and ecological functions were briefly reviewed from the viewpoint of ecology. The purpose of this paper aims at calling for scientists who engaged in soil microorganism and soil ecology research to pay attention on the study of soil virus, and finally promote the development of soil viral ecology.

soil virus, bacteriophage, diversity, metagenome, viral ecology

ghua

B.S. and M.S. degrees from Heilongjiang Bayi Agricultural University, and Ph.D. degree from Harbin Institute of Technology. He was elected as the Hundred Talents Program of Chinese Academy of Sciences (CAS) in 2010. Now he is the Professor and research group leader of molecular ecology of farmlands in Northeast Institute of Geography and Agroecology, CAS. He also serves as the vice director of Key Laboratory of Mollisols Agroecology, CAS, and the vice president of Microbiology Society of Heilongjiang Province. His major research fields include soil microbial ecology in black soils, environmental viral ecology, and biocontrol of plant diseases. He has published more than 60 SCI papers. E-mail: wanggh@iga.ac.cn

*資助項目：中科院戰(zhàn)略性先導科技專項（B類）（XD B15010103），國家自然科學基金項目（41271262、41571246）

修改稿收到日期：2017年5月2日

王光華 中科院東北地理與農業(yè)生態(tài)所研究員。2010年入選中科院“百人計劃”項目，目前擔任中科院黑土區(qū)農業(yè)生態(tài)重點實驗室副主任、農田分子生態(tài)學科組組長，黑龍江省微生物學會副理事長。主要從事黑土土壤微生物生態(tài)、環(huán)境病毒生態(tài)和植物病害生物防治等方面研究工作，發(fā)表SCI學術論文60多篇。E-mail: wanggh@iga.ac.cn