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    龍須菜多酚提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性

    2017-07-05 14:46:29陳洪彬宋露露
    食品與機(jī)械 2017年4期
    關(guān)鍵詞:龍須菜抗壞血酸液料

    陳洪彬 - 楊 敏 宋露露 - 董 樂

    (1. 泉州師范學(xué)院海洋與食品學(xué)院,福建 泉州 362002;2. 福建省海洋藻類活性物質(zhì)與功能開發(fā)重點實驗室,福建 泉州 362002)

    龍須菜多酚提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性

    陳洪彬1,2CHENHong-bin1,2楊 敏1YANGMin1宋露露1SONGLu-lu1董 樂1,2DONGLe1,2

    (1. 泉州師范學(xué)院海洋與食品學(xué)院,福建 泉州 362002;2. 福建省海洋藻類活性物質(zhì)與功能開發(fā)重點實驗室,福建 泉州 362002)

    以龍須菜為原料,研究超聲波輔助提取龍須菜多酚的工藝條件及其抗氧化活性。單因素考察液料比、提取溫度、超聲時間對龍須菜多酚含量的影響,在此基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明,液料比40∶1 (mL/g)、提取溫度60 ℃、超聲時間40 min為龍須菜多酚提取最佳工藝條件(龍須菜多酚提取量為1.62 mg GAE/g)。體外抗氧化活性研究表明,龍須菜多酚具有一定清除DPPH自由基和羥自由基的能力,其IC50值分別為56.67,18.78 μg/mL,分別相當(dāng)于15.89,536.4 μg/mL的抗壞血酸。

    龍須菜;多酚;超聲波輔助;抗氧化活性

    龍須菜(Gracilarialemaneiformis)屬紅藻門江蘺屬,是中國重要的大型養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)海藻,在中國福建、廣東、浙江、山東、遼寧等沿海地區(qū)大量養(yǎng)殖,其中福建養(yǎng)殖量占全國養(yǎng)殖總量一半以上[1]。龍須菜含有豐富的蛋白質(zhì)和碳水化合物,是制備瓊膠的重要原料,也是鮑魚等水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要餌料之一[2-4]。近年來,有關(guān)龍須菜的研究大多集中在糖類方面[5-6],如龍須菜多糖、龍須菜寡糖以及利用龍須菜來制備瓊脂等,尤其是對制備瓊脂的龍須菜,其加工的副產(chǎn)物有待進(jìn)一步開發(fā)利用,以期實現(xiàn)瓊脂清潔生產(chǎn)。海藻多酚是海藻植物中所含多酚類化合物的總稱,多為間苯三酚衍生物和聚合物,具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫機(jī)能等多種生理活性和藥用功能[7-8]。目前,有關(guān)海藻多酚研究主要集中在褐藻多酚,如海帶[9]、羊棲菜[10]、鼠尾藻[11]等褐藻中多酚類物質(zhì)的提取、分離及生物活性研究,而有關(guān)紅藻多酚的相關(guān)研究較少,僅在紫菜多酚的提取及應(yīng)用方面有初步研究報道[12-15],在龍須菜多酚的提取工藝優(yōu)化方面的研究缺乏。裘晨陽等[15]雖然對龍須菜多酚的抗氧化活性進(jìn)行測定,但其萃取的多酚未經(jīng)大孔樹脂純化,雜質(zhì)相對較多,抗氧化評價也不夠深入。福建擁有豐富的龍須菜資源,很有必要對其含有的多酚進(jìn)行研究,較系統(tǒng)地評價其體外抗氧化活性,以提高龍須菜資源的利用率。提取海藻多酚主要方式有溶劑浸提[10]、微波輔助[9,12]、超聲波輔助[11,13-14]等方法,其中超聲波輔助法在提取活性物質(zhì)方面的應(yīng)用較廣泛,能有效提高提取率[16]。因此,利用超聲波輔助提取龍須菜以提高多酚的得率具有可行性。本研究擬以福建莆田沿海養(yǎng)殖的龍須菜為原料,在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上,以70%乙醇為提取溶劑,考察液料比、提取溫度、超聲時間對龍須菜多酚含量的影響,通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波輔助提取龍須菜多酚的工藝參數(shù);在最優(yōu)提取工藝下制備龍須菜粗多酚,再經(jīng)大孔樹脂純化,以抗壞血酸為陽性對照,用DPPH自由基和羥自由基清除率較為系統(tǒng)地評價龍須菜多酚的體外抗氧化能力,旨在為龍須菜高值化利用提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料、儀器與試劑

    龍須菜:采自福建省莆田市平海鎮(zhèn)某龍須菜養(yǎng)殖廠,烘干粉碎后備用;

    紫外可見分光光度計:T6型,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;

    精密天平:CP213型,奧豪斯儀器(上海)有限公司;

    超聲波清洗器:KQ-200VDE型,昆山市超聲儀器有限公司;

    高速冷凍離心機(jī):GL-20G-II型,上海安亭科學(xué)儀器廠;

    恒溫水浴鍋:HH-4型,常州國華電器有限公司;

    鼓風(fēng)干燥箱:DHG-9246A型,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;

    萬能粉碎機(jī):ZN-02型,北京興時利儀器有限公司;

    1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH):分析純,東京化成工業(yè)株式會社;

    沒食子酸、福林酚、抗壞血酸、鄰二氮菲、硫酸亞鐵等:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 龍須菜多酚的提取

    龍須菜粉→過80目篩→超聲輔助提取→離心(4 000 r/min,20 min)→龍須菜多酚提取液

    1.2.2 多酚含量的測定 參考李穎暢等[13]的方法,用福林酚法測定提取液中多酚的含量,以沒食子酸計,y=0.013 1x-0.004 8(R2=0.999 5)為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出多酚的含量,用mg GAE/g表示。

    1.2.3 龍須菜多酚抗氧化活性的測定

    (1) DPPH自由基清除能力測定:參照文獻(xiàn)[1]。

    (2) 羥基自由基清除能力測定:采用鄰二氮菲法[1]。

    (3)IC50:指DPPH自由基清除率、羥自由基清除率為50%時所需多酚溶液的濃度。以多酚濃度(mg/mL)為自變量,抗氧化活性指標(biāo)(%)為因變量進(jìn)行一次或二次曲線擬合,根據(jù)擬合方程計算IC50。

    1.2.4 單因素試驗設(shè)計

    (1) 液料比:在提取溫度60 ℃,超聲時間40 min的條件下,分別考察液料比[20∶1,30∶1,40∶1,50∶1,60∶1(mL/g)] 對龍須菜多酚含量的影響,重復(fù)3次,取平均值。

    (2) 提取溫度:在液料比40∶1 (mL/g),超聲時間40 min的條件下,分別考察提取溫度(30,40,50,60,70 ℃)對龍須菜多酚含量的影響,重復(fù)3次,取平均值。

    (3) 超聲時間:在液料比40∶1 (mL/g),提取溫度60 ℃的條件下,分別考察超聲時間(10,20,30,40,50 min)對龍須菜多酚含量的影響,重復(fù)3次,取平均值。

    1.2.5 龍須菜多酚提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化 采用Central Composite Design響應(yīng)面優(yōu)化分析法,結(jié)合單因素試驗的結(jié)果,考察液料比、提取溫度、超聲時間對龍須菜多酚含量的影響,根據(jù)試驗結(jié)果確定最佳提取工藝。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

    2.1.1 液料比對龍須菜多酚含量的影響 由圖1可知,在液料比為40∶1 (mL/g)時,龍須菜多酚的含量達(dá)到最大值,為1.63 mg GAE/g。當(dāng)液料比超過40∶1 (mL/g)時,龍須菜多酚的含量趨于平穩(wěn)。說明此時龍須菜多酚的溶出量已基本飽和,再增加溶劑的量,無法增加龍須菜多酚的含量,同時過高的液料比將增加乙醇用量,增加濃縮負(fù)荷,成本也大幅度增加。這與李穎暢等[13]對紫菜多酚提取的研究結(jié)果相似。

    圖1 液料比對龍須菜多酚含量的影響

    Figure 1 Effects of liquid-material ratio on the contents of polyphenols fromGracilarialemaneiformis

    2.1.2 提取溫度對龍須菜多酚含量的影響 由圖2可知,在30~60 ℃時,龍須菜多酚的含量隨溫度的增加而逐漸升高,到60 ℃時,龍須菜多酚含量達(dá)到最大值(1.51 mg GAE/g),之后龍須菜多酚含量有所下降。隨著溫度升高,龍須菜多酚提取液黏度下降,分子間運動加劇,氫鍵更易斷裂,溶解、擴(kuò)散速度更快,龍須菜多酚類物質(zhì)更易溶出。但溫度過高,多酚易發(fā)生氧化或降解等一些不可逆反應(yīng),破壞龍須菜多酚的結(jié)構(gòu),從而降低其提取量。這與呂成林等[10]對羊棲菜多酚的研究結(jié)果相似。

    圖2 提取溫度對龍須菜多酚含量的影響

    Figure 2 Effects of extract temperature on the contents of polyphenols fromGracilarialemaneiformis

    2.1.3 超聲時間對龍須菜多酚含量的影響 由圖3可知,隨著超聲時間的增加,龍須菜浸出的多酚含量也不斷提高,在超聲時間為40 min時,龍須菜多酚含量達(dá)到最大值,為1.63 mg GAE/g,之后龍須菜多酚含量略有下降。說明超聲40 min后,龍須菜多酚已基本溶出,再增加超聲時間不僅無法增加其含量,還會破壞龍須菜多酚的結(jié)構(gòu),從而降低其提取量。

    圖3 超聲時間對龍須菜多酚含量的影響

    Figure 3 Effects of ultrasonic times on the contents of polyphenols fromGracilarialemaneiformis

    2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果與分析

    2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果 試驗因素水平表見表1,試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

    對響應(yīng)面試驗的結(jié)果進(jìn)行分析,可得以龍須菜多酚含量(Y)為響應(yīng)值的回歸方程:

    Y=-3.074 03+0.125 4A+0.085 22B+0.076 52C+2.883 6×10-4AB-9.994×10-5AC-2.197 2×10-4BC-2.86×10-4A2-6.808 1×10-4B2-6.759 5×10-4C2。

    (1)

    進(jìn)一步分析可知,A、B、C、A2、B2和C2項對龍須菜多酚含量的影響極顯著(P<0.01),AB和BC項對龍須菜多酚的影響顯著(P<0.05),AC項對龍須菜多酚的影響不顯著(P>0.05)。

    表2 龍須菜多酚提取響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

    表3 方差分析?Table 3 ANOVA of the constructed regression model

    2.2.2 響應(yīng)面試驗因素間的相互影響 進(jìn)一步分析表3可知,液料比與提取溫度的交互項和提取溫度與超聲時間的交互項對龍須菜多酚浸出的含量影響顯著(P<0.05),并對其作響應(yīng)曲面圖和等高線圖(圖4、5)。響應(yīng)曲面的平緩和陡峭程度可以反映因素值變化對響應(yīng)值的影響大小,若曲面坡度平緩,則因素值的變化對響應(yīng)值影響較?。环粗?,則影響較大。等高線的形狀可以反映出兩因素間交互作用的強(qiáng)弱,橢圓扁平程度表示兩因素的交互作用強(qiáng)弱,越扁平說明相互作用越強(qiáng)。由圖4可知,液料比和提取溫度之間的等高線形狀呈橢圓形,響應(yīng)曲面坡度非常陡峭,等高線圖也較扁平,說明液料比和提取溫度間的交互作用較強(qiáng),對龍須菜多酚含量的影響大。

    圖4 液料比和提取溫度對龍須菜多酚含量的交互作用Figure 4 Interaction effects of liquid-material ratio and extract temperature on the contents of polyphenols

    圖5 提取溫度和超聲時間對龍須菜多酚含量的交互作用Figure 5 Interaction effects of extract temperature and ultrasonic times on the contents of polyphenols

    2.2.3 最佳工藝參數(shù)的確定及驗證性試驗 對式(1)進(jìn)一步分析可知,理論超聲輔助提取龍須菜多酚的最佳參數(shù)條件為:液料比47.72∶1 (mL/g)、提取溫度65.86 ℃、超聲時間42.37 min。根據(jù)實際可操作情況,修正最佳提取工藝條件為:液料比48∶1 (mL/g)、提取溫度66 ℃、超聲時間42 min,并進(jìn)行驗證性實驗(n=3),得到龍須菜多酚含量為(1.58±0.07) mg GAE/g,與中心試驗組條件下獲得的龍須菜多酚含量(1.62±0.02) mg GAE/g相比較低,其理論最佳參數(shù)并非提取的最優(yōu)條件。因此,在本試驗中,超聲輔助提取龍須菜多酚的最優(yōu)工藝條件為:液料比40∶1 (mL/g)、提取溫度60 ℃、超聲時間40 min。

    2.2.4 抗氧化活性評價 制備一定量的龍須菜多酚提取液,用大孔樹脂初步純化,得龍須菜粗多酚,濃度為0.104 mg/mL。由圖6可知,經(jīng)初步純化后的龍須菜多酚具有一定的抗氧化活性。隨著多酚濃度的增加,其DPPH自由基清除率和羥自由基清除率均增大,并且呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。對其效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行回歸擬合,根據(jù)擬合方程計算IC50值,以抗壞血酸為陽性對照(圖7),結(jié)果見表4。由表4可知,龍須菜多酚的DPPH自由基清除率IC50為56.67 μg/mL,相當(dāng)于15.89 μg/mL的抗壞血酸;龍須菜多酚的羥自由基清除率IC50為18.78 μg/mL,相當(dāng)于536.4 μg/mL的抗壞血酸。因此,該試驗制備的龍須菜粗多酚清除DPPH自由基能力略弱于同濃度下的抗壞血酸,而清除羥自由基的能力強(qiáng)于同濃度下的抗壞血酸。

    3 結(jié)論

    (1) 龍須菜多酚提取的最佳工藝條件為:液料比40∶1(mL/g)、提取溫度60 ℃、超聲時間40 min,在此條件下提取的龍須菜多酚含量為(1.62±0.02) mg GAE/g。

    圖6 多酚濃度對DPPH自由基和羥自由基的影響Figure 6 Effects of scavenging DPPH free radical and hydroxy free radical on the concentration of polyphenols preparing by Gracilaria lemaneiformis

    圖7 抗壞血酸濃度對DPPH自由基和羥自由基的影響Figure 7 Effects of scavenging DPPH free radical and hydroxy free radical on the concentration of ascorbic acid表4 龍須菜多酚和抗壞血酸對DPPH自由基、羥自由基的IC50值Table 4 IC50 values of polyphenols from Gracilaria lemaneiformis and ascorbic acid for DPPH free radical, hydroxy free radical

    評價指標(biāo)抗氧化劑回歸方程R2IC50/(μg·mL-1)DPPH自由基龍須菜多酚y=0.003x+0.3270.99956.67抗壞血酸 y=-0.059x2+5.547x-23.260.99915.89羥自由基 龍須菜多酚y=0.018x+0.1620.98318.78抗壞血酸 y=0.000038x2+0.0835x-5.63790.991536.40

    (2) 體外抗氧化活性研究表明,龍須菜多酚具有一定抗氧化活性,能有效清除DPPH自由基和羥自由基,其IC50值分別為56.67,18.78 μg/mL,分別相當(dāng)于15.89,536.4 μg/mL的抗壞血酸。

    (3) 本研究不足之處在于對龍須菜多酚的抗氧化評價為體外化學(xué)抗氧化,下一步需采用細(xì)胞抗氧化試驗和體內(nèi)小鼠試驗對龍須菜多酚進(jìn)行抗氧化評價。

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    Optimizationon extraction of polyphenols and its antioxidant activityinVitrofromGracilarialemaneiformis

    (1.CollegeofOceanologyandFoodSciences,QuanzhouNormalUniversity,Quanzhou,Fujian362002,China;2.FujianProvinceKeyLaboratoryfortheDevelopmentofBioactiveMaterialfromMarineAlgae,Quanzhou,Fujian362002,China)

    Optimization of the ultrasonic-assisted extraction of polyphenols and its antioxidant activityinVitrofromGracilarialemaneiformiswere studied. The effects of liquid-material ratio, extract temperature, ultrasonic times on the contents of polyphenols fromGracilarialemaneiformiswere investigated. Based on this, the response surface analysis method was applied to determine the optimization of the extraction. Results showed that the optimum condition for the ultrasonic-assisted extraction of polyphenols weres as followed: ratio of liquid-material 40∶1 (mL/g), extraction temperature 60 ℃, ultrasonic times 40 min. Under the optimum condition, the contents of polyphenols fromGracilarialemaneiformiswas 1.62 mg GAE/g. Research of its antioxidant activityinvitroshows that the polyphenols fromGracilarialemaneiformishave scavenging capabilities of DPPH free radical and hydroxyl free radical, and theirIC50are 56.67 and 18.78 μg/mL, equivalent to 15.89 and 536.4 μg/mL of ascorbic acid.

    Gracilarialemaneiformis; polyphenols; ultrasonic-assisted; antioxidant activity

    10.13652/j.issn.1003-5788.2017.04.027

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