飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)及其在植物多酚鑒定中的應(yīng)用

李葦舟 - 明 建,2 ,2 肖星凝 - 石 芳 李 謠

(1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2. 重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)及其在植物多酚鑒定中的應(yīng)用

李葦舟1LIWei-zhou1明 建1,2MINGJian1,2肖星凝1XIAOXing-ning1石 芳1SHIFang1李 謠1LIYao1

(1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2. 重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)因具有檢測(cè)精度高、使用范圍廣、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品、生物醫(yī)藥、環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域，飛行時(shí)間質(zhì)譜與多種技術(shù)串聯(lián)使用在多酚結(jié)構(gòu)鑒定中發(fā)揮著重要作用。文章綜述了飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在植物多酚結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用，以期為植物多酚研究提供一定參考。

飛行時(shí)間質(zhì)譜；多酚；結(jié)構(gòu)鑒定

植物多酚是一類廣泛存在于植物中，具有一個(gè)或多個(gè)酚羥基結(jié)構(gòu)的次生代謝產(chǎn)物[1-3]。多酚由于能有效地清除體內(nèi)過(guò)多自由基，從而表現(xiàn)出較強(qiáng)抗氧化活性[2-4]。但各植物多酚結(jié)構(gòu)組成不同，導(dǎo)致其抗氧化能力不同，因此，研究植物多酚成分及結(jié)構(gòu)對(duì)于研究其生理功能和作用機(jī)制具有重要意義。

常用鑒定多酚組分及結(jié)構(gòu)的方法有高效液相色譜、核磁共振、質(zhì)譜等，高效液相色譜(High performance liquid chromatography，HPLC)因靈敏度和檢測(cè)限的限制而只能用于分析低分子量的多酚，對(duì)高分子量、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多酚分析效果不理想；核磁共振(Nuclear magnetic resonance，NMR)雖具有鑒定分離出單寧聚合物的強(qiáng)大結(jié)構(gòu)解析能力，但由于成本高、樣品處理復(fù)雜、測(cè)定結(jié)果會(huì)被糖配體干擾，且靈敏度低，導(dǎo)致其使用受到限制[5]。質(zhì)譜(Mass spectrum，MS)技術(shù)作為一種主要分析分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的技術(shù)，具有分辨率高、分析速度快、檢測(cè)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是分析植物多酚的理想工具和手段，飛行時(shí)間質(zhì)譜(Time of flight mass spectrometry，TOF-MS)作為其中重要的一類，在多酚研究中有不可替代的作用。

本文概述了飛行時(shí)間質(zhì)譜工作原理及其串聯(lián)技術(shù)應(yīng)用的必要性，從酚酸、黃酮、原花色素3個(gè)方面綜述了飛行時(shí)間質(zhì)譜及其串聯(lián)技術(shù)在植物多酚結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用。

1 飛行時(shí)間質(zhì)譜及其串聯(lián)技術(shù)

1.1 飛行時(shí)間質(zhì)譜工作原理

飛行時(shí)間質(zhì)譜(Time of flight mass spectrometry，TOF-MS)是利用動(dòng)能相同而質(zhì)荷比不同的離子在恒定電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)，經(jīng)過(guò)恒定距離所需時(shí)間不同，對(duì)物質(zhì)成分或結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析的一種分析方法。其在理論上對(duì)分析對(duì)象沒(méi)有質(zhì)量范圍限制，有較高分辨能力(55 000 FWHM)和微秒級(jí)采集速度(4 GHz/s)[6]，能夠獲得樣品的全掃描質(zhì)譜圖和精確質(zhì)量數(shù)(精度達(dá)5～10 mg/kg)[7]，并能通過(guò)精確質(zhì)量數(shù)推測(cè)獲得化合物分子式[5]。

常見(jiàn)的飛行時(shí)間質(zhì)譜儀有線性式和反射式兩種[8]。線性式飛行時(shí)間質(zhì)譜的工作原理[見(jiàn)圖1(a)]：被測(cè)樣品離子化后經(jīng)過(guò)電場(chǎng)加速，不同質(zhì)量的離子獲得相同的動(dòng)能E[式(1)]，然后憑慣性穿越長(zhǎng)為L(zhǎng)的無(wú)場(chǎng)區(qū)到達(dá)檢測(cè)器，根據(jù)式(2)，質(zhì)荷比m/q大的飛行時(shí)間比m/q小飛行時(shí)間長(zhǎng)，從而將不同質(zhì)量數(shù)的離子分離并檢測(cè)[9]15-16。

圖1 飛行時(shí)間質(zhì)譜工作原理圖Figure 1 Working principle of TOF-MS

(1)

(2)

式中：

E——離子在加速電場(chǎng)中獲得的動(dòng)能，J；

m——離子質(zhì)量，g；

v——進(jìn)入無(wú)場(chǎng)區(qū)時(shí)離子速度，m/s；

q——離子電荷量，C；

U——加速電場(chǎng)電壓，V；

T——離子在無(wú)場(chǎng)區(qū)中的飛行時(shí)間，s；

L——離子在無(wú)場(chǎng)區(qū)中的飛行距離，m。

然而，由于線性式飛行時(shí)間質(zhì)譜分辨率不高，不易得到精確分子量，為了改善線性式的不足，人們運(yùn)用反射式飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，提高了分辨率和分子量測(cè)定的精度。其原理[見(jiàn)圖1(b)]：高動(dòng)能離子比低動(dòng)能離子穿入反射器更深一些，適當(dāng)?shù)姆瓷淦麟妷海墒瓜嗤|(zhì)量數(shù)動(dòng)能不同的離子經(jīng)反射后同時(shí)到達(dá)檢測(cè)器，從而使其分辨率和分子量測(cè)定的精度都得到了提高。許多儀器同時(shí)具備線性式和反射式兩種工作方式。

1.2 飛行時(shí)間質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)

飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)首先需要離子源使樣品離子化再進(jìn)入電場(chǎng)中加速。早期飛行時(shí)間質(zhì)譜由于分辨率較低，離子化時(shí)如何使粒子分流與霧化、如何盡可能去除溶劑等問(wèn)題未得到解決，導(dǎo)致其發(fā)展受到限制[9]16-18。20世紀(jì)90年代以來(lái)，新型軟電離技術(shù)電噴霧離子化電離(Electrospray ionization ionization，ESI)、大氣壓下碰撞電離或大氣壓化學(xué)電離(Atmospheric pressure chmical iosziaa-lion，APCI)和基質(zhì)(體)輔助激光解吸電離(Matrix assisted laser desorption ionization，MALDI)技術(shù)的產(chǎn)生促進(jìn)了飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的發(fā)展[10]。其中，電噴霧離子源(ESI)在快速無(wú)損分析方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[11]，不僅可以產(chǎn)生多電荷離子，而且可以產(chǎn)生多電荷母離子的子離子，從而獲得更多結(jié)構(gòu)信息。

飛行時(shí)間質(zhì)譜與離子源結(jié)合后，再與氣相色譜(Gas chromatography，GC)、超高效液相色譜(Ultra performance liquid chromatography，UPLC)、四極桿(Quadrupole，Q)等儀器技術(shù)串聯(lián)，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，從而更全面地鑒定樣品成分，飛行時(shí)間質(zhì)譜的多級(jí)聯(lián)用技術(shù)已成為基因及基因組學(xué)、蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)組學(xué)、病毒學(xué)等研究領(lǐng)域中的重要分析手段[12]。其串聯(lián)方式及相關(guān)應(yīng)用見(jiàn)表1。

表1 飛行時(shí)間質(zhì)譜與其他檢測(cè)儀器串聯(lián)方式及應(yīng)用Table 1 Modes and applications of TOF-MS with other testing instruments in tandem

2 飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在植物多酚類化合物鑒定中的應(yīng)用

目前，各種分離技術(shù)(高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法)同飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)串聯(lián)作為一種有效的識(shí)別方法，被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于多酚結(jié)構(gòu)鑒定中[26]。研究[27-28]表明，液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(LC—TOF-MS)技術(shù)已成為多酚成分分析的強(qiáng)大解析工具，通過(guò)液相初步得出多酚的成分組成，然后對(duì)于出現(xiàn)的特殊峰利用飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)得到的離子碎片信息鑒定多酚的結(jié)構(gòu)。如利用液相色譜電噴霧電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC—ESI—TOF-MS)技術(shù)在杏仁皮的提取物中共檢測(cè)到23種多酚類化合物[29]；利用超高效液相色譜—四級(jí)桿—飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC—Q—TOF-MS/MS)技術(shù)在印度綠葉蔬菜Merremiaemarginata中檢測(cè)到29種已知和19種未知的多酚類化合物[30]；通過(guò)液相色譜混合動(dòng)力飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC—IT—TOF-MS)技術(shù)在桑白皮葉中檢測(cè)到22種酚類化合物，其中11種酚類化合物在桑白皮葉中為首次報(bào)道[31]。

2.1 酚酸類化合物的鑒定

植物中富含酚酸類物質(zhì)，在對(duì)其成分進(jìn)行分析鑒定時(shí)，最常用到的方法是HPLC(UPLC)—TOF—MS，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間比較及分析質(zhì)譜圖給出的一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)等，最終得到成分具體類別。

在全谷物中，酚酸是最具代表性的多酚類物質(zhì)，尤其是阿魏酸，在小麥中約占總酚酸含量的70%～90%[32-35]。利用HPLC—ESI—TOF-MS技術(shù)在意大利22種小麥中共鑒定出34類(共104種異構(gòu)體)多酚類物質(zhì)，其中阿魏酸的同分異構(gòu)體共有9種，二氫阿魏酸的同分異構(gòu)體8種，丁香酸的同分異構(gòu)體有2種且大部分存在于結(jié)合酚的部分[26]。在Carosello小麥中發(fā)現(xiàn)了分子質(zhì)量為224.061 2(C11H12O5)的物質(zhì)，并初步鑒定為芥子酸[26]。

通過(guò)Q—TOF-MS提供的質(zhì)荷比和離子碎片信息并結(jié)合相應(yīng)的文獻(xiàn)資料，在西瓜果肉里發(fā)現(xiàn)30種酚酸類物質(zhì)，并含有間苯三酚-葡萄糖醛酸[36]。同樣，利用該技術(shù)從朝鮮淫羊藿中共鑒定出18種酚酸類物質(zhì)，其中有7種酚酸是首次發(fā)現(xiàn)，均為咖啡酰己酸的同分異構(gòu)體[37]。

松蘿具有清熱解毒、止咳化痰等功效，多酚類物質(zhì)是其中的主要藥效成分。通過(guò)超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(UPLC—Triple-TOF-MS)在松蘿中鑒定出17種酚酸類物質(zhì)，主要為二苯并呋喃類化合物、多取代單苯環(huán)類化合物、縮酚酸類及其衍生物等[38]。

2.2 黃酮類化合物的鑒定

黃酮類化合物是通過(guò)兩個(gè)苯環(huán)和一個(gè)吡喃環(huán)相互連接而形成的一系列化合物。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能給出圖譜中記錄的物質(zhì)精確的分子質(zhì)量，甚至能夠給出黃酮類物質(zhì)裂解途徑的信息，大多數(shù)記錄的A型和B型離子碎片為這些化合物的取代模式提供了極為重要的信息[27,39-40]，因此，對(duì)研究未知黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)提供了依據(jù)。

利用反向高效液相色譜電噴霧電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(RP-HPLC-ESI-TOF-MS)技術(shù)在苦蕎中檢測(cè)到28種黃酮類物質(zhì)，其中2-羥基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-苯甲酸、1-O-咖啡酰-6-α-吡喃鼠李糖基-β-葡萄糖苷、表兒茶素-3-(3''-O-甲基)是首次在苦蕎中被發(fā)現(xiàn)[41]。在南美亞馬遜雨林棕櫚樹(shù)葉中利用UPLC—ESI-MS/MS串聯(lián)技術(shù)鑒定出的黃酮類化合物主要有槲皮素、柚皮素、兒茶素和表兒茶素、蘆丁、矢車菊素-3-蕓香糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖苷[42]。

通過(guò)ESI-IT-TOF/MSn多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)21種黃酮類化合物的裂解規(guī)律進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，異黃酮和黃酮丟失C2H2O2碎片的先決條件是5,7-二羥基或5-羥基-7-甲氧基取代，異黃酮、黃酮和黃酮醇失去C3O2的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是A環(huán)具有5,7-二羥基取代，若A環(huán)含有其他取代基，則不會(huì)失去C3O2[43]。葛根素-4’-O-β-D-葡萄糖苷在質(zhì)譜中給出的離子峰的測(cè)定值為577.156 2，可推斷其分子式為C27H30O14，以m/z577.15 62為母離子，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，其可能的裂解途徑見(jiàn)圖2，與2-苯基色原酮8號(hào)碳位鏈接的官能團(tuán)(C6H11O5)中，環(huán)上相間的C—O鍵、C—O鍵斷裂脫落C4H8O4部分(Mv=120)，留下的C2H3O形成一個(gè)新C—C雙鍵，并以該離子形式(m/z457)保持穩(wěn)定[44]。

圖2 葛根素-4’-O-β-D-葡萄糖苷可能的裂解途徑Figure 2 Possible fragmentation mechanism of puerain- 4’-O-β-D-glucoside

2.3 原花色素類化合物的鑒定

原花色素，又稱縮合單寧，是一類結(jié)構(gòu)與花青素相似，味澀而無(wú)色的高聚物，其基本結(jié)構(gòu)單元是黃烷-3-醇，因結(jié)構(gòu)中起始單元或延伸單元黃烷-3-醇組成單元的連接位置、羥化部分以及聚合度的不同使原花色素結(jié)構(gòu)具有多樣性和復(fù)雜性，導(dǎo)致對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析比較困難[45]，運(yùn)用親核試劑(如間苯三酚或甲苯α-硫醇)催化的酸降解原花色素，其延伸和末端結(jié)構(gòu)單元可被檢測(cè)，從而測(cè)定其聚合度[46]。

輔助激光電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)是一種靈敏且有效的不揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，能對(duì)同一樣品進(jìn)行重復(fù)分析且具有最佳兼容性[47]，被認(rèn)為是對(duì)多酚聚合物和原花青素分析的有效方法[48-52]。Mané等[53]分別在MALDI-TOF-MS中使用[M+Na]+和[M+K]+兩種陽(yáng)離子模式，測(cè)得蘋(píng)果中原花色素的聚合度分別為DP15和DP13；Takahata等[54]利用[M+K]+在線模式檢測(cè)出棕色大豆種皮中的原花色素最高聚合度為DP30。

陳小鑫[55]運(yùn)用MALDI-TOF-MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)構(gòu)成黃葛樹(shù)葉、樹(shù)皮和果實(shí)原花色素，魚(yú)尾葵果皮原花色素和印度塔樹(shù)葉原花色素的黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)單元(U288)的質(zhì)量數(shù)與原花青素結(jié)構(gòu)單元C/EC(兒茶素/表兒茶素)的相對(duì)分子質(zhì)量恰好相等，并能分別檢測(cè)到黃葛樹(shù)葉、樹(shù)皮和果實(shí)原花色素，魚(yú)尾葵果皮和果肉原花色素，印度塔樹(shù)葉原花色素存在從三聚體到六聚體、十五聚體、十二聚體和十四聚體的聚物。相似的，在木欖花萼原花色素的MALDI-TOF質(zhì)譜圖中，主要離子峰系列的相鄰離子峰間距均為m/z288，顯示了構(gòu)成花萼原花色素的黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)單元(U288)的質(zhì)量數(shù)，通過(guò)計(jì)算結(jié)構(gòu)單元U288個(gè)數(shù)得知其中從三聚體到十六聚體的均聚物都存在[56]。

3 結(jié)語(yǔ)

植物多酚因成分與結(jié)構(gòu)的不同而具有多種生理功能，在疾病控制和保健方面發(fā)揮著重要作用。因此，分析植物多酚的結(jié)構(gòu)對(duì)研究植物多酚生理功能具有重要的意義，飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在分析多酚成分及結(jié)構(gòu)鑒定方面發(fā)揮著巨大作用。但由于飛行時(shí)間質(zhì)譜是通過(guò)質(zhì)譜圖提供的離子碎片信息對(duì)多酚類物質(zhì)做初步的鑒定，所以單一使用具有一定的局限性。將多種電離技術(shù)與多級(jí)質(zhì)譜連用，能使飛行時(shí)間質(zhì)譜在全面鑒定和分析多酚類化合物成分中發(fā)揮重要作用。

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The time of flight mass spectrometry technology and its application in plant polyphenols identification

(1.CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China;2.ChongqingEngineeringResearchCenterforSpecialFoods,Chongqing400715,China)

Time of flight mass spectrometry (TOF-MS) has been widely applied in food, biological medicine, environmental monitoring for its great precision, wide range of detection and high speed of analysis. TOF-MS with various techniques in tandem plays an important role in the structure identification of polyphenols. In this review, it was outlined the application of time of flight mass spectrometry in the structure identification of plant polyphenols to provide some references for the study of plant polyphenol.

time of flight mass spectrometry; polyphenols; structure identification

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.04.039

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：41601573)；安徽省公益性技術(shù)應(yīng)用研究聯(lián)動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：1604f0704050)；滁州學(xué)院實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(編號(hào)：SWSP201507KF)

張磊(1983—)，男，滁州學(xué)院講師，博士。 E-mail：leizhang2014@163.com

2017—01—20