血清反應(yīng)因子-早期即刻基因在慢性束縛應(yīng)激模型大鼠內(nèi)臟高敏感形成中的作用

汪之沫，侯曉華，康文全

（1.深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東深圳518052；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科）

血清反應(yīng)因子-早期即刻基因在慢性束縛應(yīng)激模型大鼠內(nèi)臟高敏感形成中的作用

汪之沫1，2，侯曉華2，康文全1*

（1.深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東深圳518052；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科）

目的：探討血清反應(yīng)因子（serum response factor，SRF）-早期即刻基因（immediateearly gene，IEG）在慢性束縛應(yīng)激模型大鼠內(nèi)臟高敏感形成中的作用。方法：將18只大鼠隨機(jī)分成不給予束縛對(duì)照組、束縛模型組1和束縛模型組2（無結(jié)腸直腸擴(kuò)張），每組6只。用束縛前后結(jié)直腸擴(kuò)張引起的腹壁回撤反射評(píng)分（AWR評(píng)分）3分時(shí)最小擴(kuò)張球囊壓力（即痛閾）來評(píng)價(jià)大鼠內(nèi)臟敏感性的變化，采用Western blot法檢測(cè)各組SRF和IEG（c-fos和Arc）及SRF-IEG下游的突觸變化相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：（1）模型組1束縛后痛閾顯著低于束縛前和對(duì)照組（P＜0.05）。（2）模型組1和模型組2的SRF、c-fos和Arc表達(dá)比對(duì)照組顯著增強(qiáng)（P＜0.05），而2個(gè)模型組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（3）2個(gè)模型組的突觸素、PSD-95、NMDA-R1、p-CaMKⅡ4個(gè)因子表達(dá)比對(duì)照組顯著增強(qiáng)（P＜0.05），而2個(gè)模型組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：SRF-IEG通路在慢性束縛應(yīng)激所致大鼠內(nèi)臟高敏感形成中發(fā)揮一定作用。

束縛應(yīng)激；內(nèi)臟高敏感；血清反應(yīng)因子（SRF）；早期即刻基因（IEG）

腸易激綜合征（IBS）是一種常見的功能性胃腸病，其一大病理生理特點(diǎn)即是內(nèi)臟高敏感，較小的腸道刺激即可使患者產(chǎn)生明顯感覺［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟敏感性增強(qiáng)涉及神經(jīng)傳遞中的突觸可塑性變化［3］，包括突觸形態(tài)以及突觸傳遞的變化［4-5］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，一些早期即刻基因（immediate early gene，IEG）參與了突觸形態(tài)和突觸傳遞的變化，與突觸可塑性相關(guān)的IEG主要包括c-fos和活性調(diào)節(jié)的細(xì)胞骨架蛋白（activityregulated cytoskeletal protein，Arc）［6］。Arc參與神經(jīng)突觸塑形，活化后可促進(jìn)actin的產(chǎn)生及改變actin的排列方式［7］；c-fos與突觸傳遞改變相關(guān)，活化后可以增加MAPK/ERK蛋白和NMDA受體的表達(dá)［8］。血清反應(yīng)因子（serum response factor，SRF）為動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在的一種基因調(diào)控因子，隸屬于MADSbox家族［9-10］，參與突觸可塑性相關(guān)IEG的調(diào)控，有多種生物學(xué)功能，參與多種生物學(xué)活動(dòng)，如細(xì)胞分化、生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)傳遞等，與功能基因調(diào)控區(qū)的血清反應(yīng)元件結(jié)合后，影響這些功能基因的表達(dá)。SRF-IEG信號(hào)通路下游與突觸可塑性變化相關(guān)蛋白因子有突觸素、PSD-95、NMDA-R1和p-CaMKⅡ。本研究使用慢性束縛應(yīng)激動(dòng)物模型，研究SRF-IEG通路在束縛所致內(nèi)臟高敏感模型大鼠內(nèi)臟感覺一級(jí)傳入神經(jīng)元，即背根神經(jīng)節(jié)（dorsal rootganglion，DRG）的作用，深入挖掘內(nèi)臟敏感變化的機(jī)制，為將來探索IBS治療的新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組18只雄性SD大鼠購(gòu)自華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（鄂）2010-0057，體重230～260 g，常規(guī)飼養(yǎng)，隨機(jī)分成3組，模型組1和模型組2及對(duì)照組，各6只大鼠，2個(gè)模型組給予連續(xù)3 d的慢性束縛應(yīng)激，對(duì)照組不給予束縛，置于籠中自由活動(dòng)；對(duì)照組和模型組1給予結(jié)直腸擴(kuò)張（colorectal distension，CRD），模型組2不給予CRD。

1.2 CRD用薄聚乙烯袋制作氣囊，不充氣時(shí)大小約5 cm×3 cm。用長(zhǎng)約20 cm輸液管作為導(dǎo)管，一頭連接氣囊，另一頭連三通管后再連接壓力表和注射器。大鼠吸入1%七氟醚麻醉后，氣囊導(dǎo)管插至降結(jié)腸，氣囊遠(yuǎn)端距離肛門口約1 cm，固定好導(dǎo)管防止滑脫，導(dǎo)管的另一端連接著壓力表和一注射器（50ml）。插管大鼠置于玻璃容器內(nèi)（大小約8 cm×8 cm×20 cm），清醒后先休息約20 min，然后進(jìn)行CRD實(shí)驗(yàn)。取4個(gè)時(shí)間點(diǎn)行CRD：d0，d1，d3和d4，即造模前1天、第1次束縛后當(dāng)天、第3次束縛后當(dāng)天和第3次束縛后第24 h。

1.3 內(nèi)臟感覺評(píng)估一實(shí)驗(yàn)者緩慢充氣，另一實(shí)驗(yàn)者仔細(xì)觀察，當(dāng)大鼠腹部剛剛抬起時(shí)（相對(duì)于AWR 3分時(shí)）記錄壓力值即為痛閾，重復(fù)3次計(jì)算均值。

1.4 Western blot于d4時(shí)間點(diǎn)，將大鼠處死，于冰上快速摘取腰骶部（L6-S2節(jié)段）DRG保存?zhèn)溆?。按常?guī)方法提取DRG中總蛋白，RIPA裂解液和磷酸酶抑制劑均購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)公司；采用BCA kit法測(cè)蛋白濃度；按常規(guī)方法進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)印，分離膠購(gòu)自武漢碧云天公司，所有指標(biāo)的一抗購(gòu)自Santa Cruz公司；使用ECL發(fā)光試劑盒（SuperSignal?RWestPico，ThermoSCIENTIFIC）進(jìn)行顯像反應(yīng)，按說明書操作。對(duì)于Western blot結(jié)果，采用Quantity One 4.62進(jìn)行定量分析，相對(duì)量為目標(biāo)蛋白光密度值／內(nèi)參蛋白光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痛閾比較模型組1束縛后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的痛閾接近，但均比束縛前及對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)明顯降低（P＜0.05）；對(duì)照組d0，d1，d3和d4 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)和模型組1束縛前痛閾接近，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 慢性束縛應(yīng)激后產(chǎn)生的痛閾壓力變化

2.2 SRF、IEG（Arc和c-fos）的表達(dá)比較模型組1和模型組2的SRF、Arc及c-fos表達(dá)均比對(duì)照組顯著增強(qiáng)（P＜0.05），而2個(gè)模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

2.3 突觸素、PSD-95、NMDAR1和p-CaMKⅡ的表達(dá)比較2個(gè)模型組的4個(gè)蛋白因子表達(dá)與對(duì)照組比較均顯著增強(qiáng)（P＜0.05），而2個(gè)模型組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

3 討論

內(nèi)臟高敏感的產(chǎn)生原因眾多，常見原因之一是精神創(chuàng)傷。給予大鼠束縛應(yīng)激可以造成精神創(chuàng)傷，這一動(dòng)物模型由Williams等［11］建立，可模擬在人類發(fā)生的精神創(chuàng)傷。此模型可激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，導(dǎo)致機(jī)體某些應(yīng)激激素水平的變化，甚至還可導(dǎo)致情緒變化，如驚恐、抑郁、焦慮等，有這些情況的個(gè)體其內(nèi)臟敏感性存在變化。

本研究提示在束縛后的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組1其痛閾顯著低于束縛前和對(duì)照組，這表明模型組內(nèi)臟敏感性提高并持續(xù)了一段時(shí)間。其根本原因在于神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)傳遞通路發(fā)生了結(jié)構(gòu)功能變化，即產(chǎn)生了突觸可塑性的變化。

圖2 Western blot檢測(cè)SRF、Arc、c-fos的表達(dá)

圖3 Westernblot檢測(cè)突觸素Synaptophysin、PSD-95、NMDAR1和p-CaMKⅡ的表達(dá)

突觸可塑性變化牽涉到很多基因和蛋白的改變，如IEG、SRF、NMDAR1、突觸素等，這些基因蛋白可相互影響，形成一個(gè)調(diào)控網(wǎng)，SRF-IEG（c-fos和Arc）通路位于調(diào)控鏈的上游。突觸素參與構(gòu)成突觸囊泡，是囊泡標(biāo)志蛋白，其分布及濃度反映了突觸囊泡的數(shù)量和分布，突觸素變化與突觸結(jié)構(gòu)變化相關(guān)［12］。PSD-95是PSD的重要組分［13］，在其蛋白結(jié)構(gòu)中存在很多結(jié)構(gòu)域，具有獨(dú)特功能，是多種信號(hào)分子和興奮性受體的聚集地，整合各個(gè)分子形成信號(hào)復(fù)合體參與信號(hào)傳遞，加工處理前膜來的信息。PSD-95的變化既影響突觸結(jié)構(gòu)，又影響突觸傳遞。NMDA-R1作為結(jié)構(gòu)組分加入了信號(hào)傳遞復(fù)合體，其并不是始終位于突觸后膜，而是不斷變動(dòng)位置，有時(shí)嵌入后膜，有時(shí)離開，與神經(jīng)元活性有關(guān)，這就形成了一種突觸功能調(diào)節(jié)的機(jī)制［14］。p-CaMKⅡ即磷酸化的Ca2+-CaM依賴的蛋白激酶［15］，CaMKⅡ是存在于突觸前軸漿中的一種蛋白，當(dāng)Ca2+升高時(shí)，Ca2+與鈣調(diào)蛋白結(jié)合成Ca2+-CaM復(fù)合物，使得CaMKⅡ磷酸化形成p-CaMKⅡ，具有解離突觸囊泡和細(xì)胞骨架的作用，使突觸囊泡脫離細(xì)胞骨架移向前膜活化區(qū)并融合，然后釋放信號(hào)物質(zhì)到前后膜間隙，這就是神經(jīng)信號(hào)傳遞的基本環(huán)節(jié)，突觸傳遞增強(qiáng)時(shí)，p-CaMKⅡ量亦會(huì)增多。

DRG負(fù)責(zé)接收內(nèi)臟感覺刺激的起始信號(hào)，并加工后向上傳導(dǎo)［16-19］，是機(jī)體內(nèi)臟感覺傳入路徑的一級(jí)神經(jīng)元，在突觸可塑性和內(nèi)臟敏感性方面發(fā)揮重要作用，因此研究DRG在SRF-IEG（Arc和c-fos）通路的變化。

本研究發(fā)現(xiàn)無論是調(diào)控鏈上游的SRF、IEG（Arc、c-fos），還是其下游的突觸素、PSD-95、NMDAR1和p-CaMKⅡ這4個(gè)因子，2個(gè)模型組表達(dá)顯著強(qiáng)于對(duì)照組。而2個(gè)模型組之間各個(gè)因子表達(dá)差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這就排除了CRD本身的影響?？梢酝茰y(cè)SRF-IEG通路的活化上調(diào)了其下游信號(hào)因子的表達(dá)，通過某種機(jī)制產(chǎn)生一系列的連鎖反應(yīng)，改變了神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)和傳遞，最終形成內(nèi)臟高敏感。

當(dāng)然，神經(jīng)突觸可塑性和內(nèi)臟敏感性變化也許還牽涉其他信號(hào)傳遞通路，但本研究認(rèn)為SRFIEG有可能是一條重要的信號(hào)通路，其變化趨勢(shì)和內(nèi)臟敏感性的變化趨勢(shì)具有一致性，也許可以作為將來靶向治療研究的一個(gè)切入點(diǎn)。SRF-IEG通路的意義與價(jià)值還需進(jìn)行更為細(xì)致深入的研究。

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Roleof SRF-IEG Pathway in Ratsw ith VisceralHypersensitivity Caused by Chronic Restraint Stress

WANGZhimo1，2，HOUXiaohua2，KANGWenquan1*
（1.Department of Gastroenterology，The People's Hospital of Nanshan District of Shenzhen，Shenzhen 518052，China；2.Department of Gastroenterology，Union Hospital，TongjiMedicalCollegeofHuazhong University ofScienceand Technology）

Objective：To investigate the role of SRF-IEG pathway in rats with visceral hypersensitivity caused by chronic restraint stress.Methods：A total of 18 rats were random ly allocated to three groups equally，including control group，restraint group 1 and restraintgroup 2 without colorectal distension（CRD）.Controlgroup and restraintgroup 1

CRD.Theminimum pressure was recorded as pain threshold when the AWR score was three.The formation of visceral hypersensitivity was evaluated by pain threshold changes.The expression of SRF，IEG（including Arc and c-fos），synaptophysin，PSD-95，NMDAR1 and p-CaMK II in dorsal rootganglion（DRG）of ratswere detected byWestern blot.Results：（1）The pain threshold in restraintgroup 1 wasmarkedly lower than that in control group and before restrtraimt（P＜0.05）.（2）The expressions of SRF，Arc and c-foswere significantly higher in two restraint groups than those in control group（P＜0.05）.No significant difference was found between the restraint group 1and the restraint group 2.（3）The expressions of synaptophysin，PSD-95，NMDAR1 and p-CaMK II were significamtly higher in two restraint groups than those in control group（P＜0.05）.No significant difference was found between the restraint group 1 and the restraint group 2.Conclusion：The SRF-IEG pathway possibly plays roles in the formation of visceral hypersensitivity caused by significamtly chronic restraintstress.

restraintstress；visceralhypersensitivity；serum response factor（SRF）；immediate early gene（IEG）

R574.62

A

1008-2344（2017）03-0204-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.03.006

2016-10-30

（文敏編輯）

深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)2014年知識(shí)創(chuàng)新計(jì)劃基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（No.JCYJ20140411094549459）;深圳市南山區(qū)衛(wèi)生和計(jì)劃生育局2015年南山區(qū)衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.南科研衛(wèi)2015036號(hào)）

汪之沫（1978—），男（漢），博士，主治醫(yī)師，研究方向：功能性胃腸病.E-mail：wangzhimo@163.com

康文全（1963—），男（漢），碩士，主任醫(yī)師，研究方向：功能性胃腸病.E-mail：kangkwq@163.com