RTCA實(shí)時(shí)監(jiān)控SAHA對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

周偉強(qiáng)

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng)110034）

RTCA實(shí)時(shí)監(jiān)控SAHA對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

周偉強(qiáng)

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng)110034）

目的：應(yīng)用實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記動(dòng)態(tài)細(xì)胞分析（RTCA）技術(shù)研究SAHA抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的情況。方法：采用RTCA系統(tǒng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同劑量（0、0.5、1、2、5、10、20、50μmol/L）SAHA對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果：5、10μmol/L的SAHA孵育48 h后可顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，為SAHA抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳實(shí)驗(yàn)劑量和作用時(shí)長(zhǎng)；而相關(guān)劑量的DMSO無(wú)抑制作用。結(jié)論：RTCA系統(tǒng)可準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)SAHA抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的情況。

乳腺癌；MCF-7；SAHA；RTCA

xCELLigence RTCA（real-time cell analysis）是應(yīng)用實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記動(dòng)態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)，實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、定量跟蹤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及浸潤(rùn)的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。該系統(tǒng)將微電子細(xì)胞傳感器芯片整合到特制16孔板內(nèi)（E Plate-16）的微孔膜下層，從而實(shí)時(shí)并精確地監(jiān)測(cè)細(xì)胞的各種變化［1-3］。

表觀遺傳學(xué)（Epigenetics）又稱(chēng)“表遺傳學(xué)”、“后遺傳學(xué)”，是指在沒(méi)有細(xì)胞核DNA序列改變的情況時(shí)，基因功能發(fā)生的可逆、可遺傳的改變。這些改變包括DNA的修飾（如甲基化修飾）和組蛋白的各種修飾等［4-5］。近年研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌發(fā)生過(guò)程中，乳房腺上皮細(xì)胞在多種致癌因子作用下發(fā)生了表觀遺傳的改變而致使細(xì)胞增殖失控，其中乙?；腿ヒ阴；鹆撕艽蟮淖饔?，而對(duì)于組蛋白乙?；腿ヒ阴；{(diào)控是由一組蛋白酶完成的，分別為組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）。

SAHA（Suberoylanilide Hydroxamic Acid）作為一種HDAC抑制劑，可抑制組蛋白去乙?；^(guò)程，造成癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過(guò)程異常，阻滯其細(xì)胞周期進(jìn)程并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［6-7］。因此其在臨床上有非常良好的應(yīng)用前景。因此，本文選取乳腺癌MCF-7細(xì)胞，利用RTCA技術(shù)研究SAHA抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的情況。

1 材料與方法

1.1 材料RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)購(gòu)自艾森生物（杭州）有限公司；人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由本實(shí)驗(yàn)室凍存；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素以及鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；SAHA、DMSO及其它的化學(xué)試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 RTCA系統(tǒng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)SAHA對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響將1×104/ml乳腺癌MCF-7細(xì)胞接種于RTCA系統(tǒng)的E-Plate 16孔板中。無(wú)血清同步化處理后，各孔分別加入0、0.5、1、2、5、10、20、50μmol/L不同劑量的SAHA。并以相關(guān)劑量DMSO作為對(duì)照。設(shè)定監(jiān)控時(shí)長(zhǎng)為72 h，時(shí)間間隔為1 h進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察。隨著時(shí)間的推移，通過(guò)RTCA系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)變化反應(yīng)曲線反映各孔0～72 h間MCF-7的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果

2.1 SAHA顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)從T1時(shí)段（從將培養(yǎng)瓶中的MCF-7細(xì)胞消化后接種到RTCA系統(tǒng)的E Plate-16孔后繼續(xù)培養(yǎng)24 h）的各個(gè)細(xì)胞曲線來(lái)看，各孔的細(xì)胞生長(zhǎng)良好，體現(xiàn)在細(xì)胞曲線隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞曲線不斷上升，無(wú)明顯停滯和下降的情況發(fā)生。T2時(shí)段（無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞同步化階段）內(nèi)細(xì)胞的培養(yǎng)液換成不含胎牛血清的培養(yǎng)液，其目的是抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，而將RTCA各孔的細(xì)胞全部停留在G1期，以便下一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。T2時(shí)段的同步化的細(xì)胞曲線都有不同程度的下降，而在同步化培養(yǎng)10 h后，細(xì)胞曲線趨于平行，細(xì)胞增殖受到了抑制，達(dá)到了同步化的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

從總時(shí)段的41 h開(kāi)始，細(xì)胞重新?lián)Q上含胎牛血清培養(yǎng)液，并加入不同濃度的SAHA和DMSO與MCF-7細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)加入SAHA和DMSO開(kāi)始的5 h時(shí)段內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)由于新培養(yǎng)液的加入發(fā)生了一定的變化，這直接體現(xiàn)在以細(xì)胞形態(tài)為主要采集目標(biāo)的RTCA細(xì)胞曲線的變化上。各孔細(xì)胞曲線都發(fā)生了急劇的變化，細(xì)胞曲線發(fā)生大幅度上升。但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞狀態(tài)趨于平穩(wěn)，細(xì)胞曲線反映了細(xì)胞真實(shí)的狀態(tài)。

從SAHA的藥效方面，小劑量SAHA對(duì)MCF-7細(xì)胞影響不大，0.5、1μmol/L SAHA在培養(yǎng)接近60 h后對(duì)MCF-7的抑制作用非常有限；而大劑量SAHA則明顯顯示出抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的特性，20、50 μmol/L SAHA在培養(yǎng)不到20 h就明顯抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)；而中劑量（5、10μmol/L）SAHA則在培養(yǎng)30～40 h明顯顯現(xiàn)出抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。見(jiàn)圖1A。

2.2 實(shí)驗(yàn)劑量的DMSO對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用對(duì)于DMSO來(lái)說(shuō)，無(wú)論小劑量還是大劑量的DMSO對(duì)MCF-7細(xì)胞的影響均不十分顯著。在各種實(shí)驗(yàn)劑量DMSO的作用下，MCF-7細(xì)胞仍能隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷生長(zhǎng)，RTCA曲線表現(xiàn)為持續(xù)延長(zhǎng)并在培養(yǎng)40 h后到達(dá)生長(zhǎng)平臺(tái)期。但同時(shí)也可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)成分的不斷喪失，細(xì)胞在孵育65 h后開(kāi)始出現(xiàn)死亡，表現(xiàn)在RTCA曲線下降。見(jiàn)圖1B。

3 討論

RTCA系統(tǒng)通過(guò)新穎的電子傳感芯片設(shè)計(jì)，可連續(xù)監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)的全過(guò)程，并且其監(jiān)測(cè)是無(wú)標(biāo)記、無(wú)創(chuàng)傷型的數(shù)據(jù)獲取和分析平臺(tái)，這種高準(zhǔn)確度、高精確度的定量衡量細(xì)胞生長(zhǎng)方法，可最大限度地模仿細(xì)胞自然狀態(tài)下的生長(zhǎng)發(fā)育情況，對(duì)于腫瘤藥敏實(shí)驗(yàn)是十分適合的［8-9］。本實(shí)驗(yàn)就是利用了RTCA系統(tǒng)實(shí)時(shí)觀察了SAHA對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。

SAHA具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞分化的作用［6］，且具有抗腫瘤廣譜性，具有潛在的臨床應(yīng)用前景［10-13］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高劑量SAHA（20、50μmol/L）對(duì)MCF-7細(xì)胞抑制作用明顯，可在孵育開(kāi)始后即發(fā)揮明顯地抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果，沒(méi)有留給細(xì)胞一個(gè)生長(zhǎng)與抑制并存的環(huán)境，其毒性作用過(guò)強(qiáng)，不利用其它細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的實(shí)施。而低劑量SAHA對(duì)MCF-7細(xì)胞基本沒(méi)有體現(xiàn)出抑制生長(zhǎng)的作用。因此通過(guò)RTCA系統(tǒng)可以很直觀地篩查出中劑量SAHA，尤其是5、10μmol/LSAHA孵育48 h可顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，是SAHA抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳實(shí)驗(yàn)劑量和作用時(shí)長(zhǎng)。

本文通過(guò)RTCA實(shí)時(shí)觀察了不同劑量的SAHA對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生的作用效果，并非常直觀地篩查出SAHA作用MCF-7細(xì)胞的最佳實(shí)驗(yàn)劑量和作用時(shí)長(zhǎng)，對(duì)于傳統(tǒng)增殖實(shí)驗(yàn)篩查有著不可比擬的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，是一個(gè)很好的替代手段。

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圖1 RTCA實(shí)時(shí)監(jiān)控不同劑量SAHA和DMSO對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（μm為μmol/L）

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RTCAM onitorsthe Inhibitory Effecton Proliferation of BreastCancer MCF-7Cellsw ith SAHA Treatment

ZHOUWeiqiang
（Shenyang MedicalCollege，Key Laboratory of EnvironmentalPollution and M icroecology of Liaoning Province，Shenyang 110034，China）

Objective：To observe the inhibitory effect on proliferation of breast cancer MCF-7 cellswith SAHA treatment by real-time cell analysis（RTCA）system.Method：RTCA was used tomonitor the proliferation ofbreast cancerMCF-7 cells treated with different doses of SAHA（0，0.5，1，2，5，10，20，50μmol/L）.Results：With 5，10μmol/L dose for 48 h treatment，SAHA significantly inhibited the proliferation of MCF-7 cells，while no dose-dependent effect in the same doses for the DMSO.Conclusion：RTCA system accurately monitors the inhibitory effect on proliferation of breast cancer MCF-7 cells with SAHA treatment.

breastcancer；MCF-7；SAHA；RTCA

R394.3

A

1008-2344（2017）03-0193-03

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.03.002

2017-03-06

（文敏編輯）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81172509）

周偉強(qiáng)（1970—），男（漢），教授.研究方向：乳腺癌發(fā)生與調(diào)控.E-mail：zhouwq@hotmail.com