構(gòu)巢曲霉內(nèi)切纖維素酶A10在畢赤酵母中的表達及重組蛋白質(zhì)的表征

李建軍，李小連，王自強，杜昱光

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構(gòu)巢曲霉內(nèi)切纖維素酶A10在畢赤酵母中的表達及重組蛋白質(zhì)的表征

李建軍1,2，李小連1，王自強1，杜昱光1,2

1 中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室國家生化工程技術(shù)研究中心 (北京)，北京 100190 2 中國科學(xué)院過程工程研究所全軍生物藥制造與劑型工程重點實驗室，北京 100190

李建軍, 李小連, 王自強, 等. 構(gòu)巢曲霉內(nèi)切纖維素酶A10在畢赤酵母中的表達及重組蛋白質(zhì)的表征. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(5): 757–765.Li JJ, Li XL, Wang ZQ, et al. Overexpression and characterization of endo-cellulase A10 from Aspergillus nidulans in Pichia pastoris. Chin J Biotech, 2017, 33(5): 757–765.

內(nèi)切纖維素酶是纖維素酶高效降解纖維素的一個關(guān)鍵因子，已廣泛應(yīng)用于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。對來源于腐生真菌構(gòu)巢曲霉的一個內(nèi)切纖維素酶進行過表達及詳細的酶學(xué)性質(zhì)研究，研究結(jié)果表明：該內(nèi)切纖維素酶在搖瓶和發(fā)酵罐條件下都成功獲得表達，發(fā)酵罐條件下的蛋白質(zhì)表達量達到0.89 mg/mL；該酶的最適反應(yīng)pH和溫度分別為4.0和80 ℃，在pH 2.0–12.0之間表現(xiàn)出了很好的穩(wěn)定性；在溫度￡60 ℃時，該酶非常穩(wěn)定，當(dāng)溫度370℃，酶的穩(wěn)定性大大降低；Co2+、Mn2+和Fe2+促進了CMCase活性，而Pb2+、Ni2+和Cu2+等金屬離子表現(xiàn)出了一定的抑制作用。因此，該構(gòu)巢曲霉內(nèi)切纖維素酶表現(xiàn)出了非常好的耐酸、耐堿以及一定的耐熱性等性能，具有開發(fā)為商品酶的潛力，為深入開發(fā)構(gòu)巢曲霉來源糖苷酶的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

構(gòu)巢曲霉，內(nèi)切纖維素酶，酶學(xué)性質(zhì)，二價金屬離子，發(fā)酵

植物細胞壁主要由木質(zhì)素、纖維素和半纖維素組成，其中纖維素大約占40%–50%，是植物細胞壁的主要成分。纖維素酶是所有能參與纖維素降解并最終將其轉(zhuǎn)化為葡萄糖的酶類的總稱[1-4]。纖維素酶酶系主要包括：內(nèi)切-b-1,4-葡聚糖酶或內(nèi)切纖維素酶 (EC 3.2.1.4，bg)，隨機水解纖維素鏈的內(nèi)部連接；纖維二糖水解酶或外切纖維素酶或 外切-b-1,4-葡聚糖酶 (Cellulose 1,4-β-cellobiosidaseor exo-cellobiohydrolase) 特異地從纖維素鏈的還原端 (EC 3.2.1.176，cellulose 1,4-β-cellobiosidase，reducing end，CBH I) 或非還原端 (EC 3.2.1.91，cellulose 1,4-β-cellobiosidase，non-reducing end，CBH II) 降解纖維二糖單位；β-D-葡萄糖苷酶 (EC 3.2.1.21，β-glucosidase) 將纖維二糖水解為葡萄糖基[1–4]。內(nèi)切纖維素酶的剪切是纖維素酶水解的第一步，同時也是整個纖維素水解反應(yīng)的限速步驟[1,4]。內(nèi)切-b-1,4-葡聚糖酶已被廣泛用于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，包括生物燃料、發(fā)酵、釀造、紡織、洗滌劑和改善紙漿性能及脫墨處理，在動物飼料中提高植物材料的利用效率等，具有很大的應(yīng)用價值[1–4]。

內(nèi)切-b-1,4-葡聚糖酶或纖維素酶主要存在于細菌和真菌中[1–3]，除此之外，還存在于一些動物 (包括軟體動物、白蟻、鯉魚、紫貽貝和玻璃海鞘等) 中[5–6]。微生物是內(nèi)切-b-1,4-葡聚糖酶的重要來源，具有活力高、成本低、來源穩(wěn)定、提取方便等優(yōu)點。但天然菌所產(chǎn)的內(nèi)切-b-1,4-葡聚糖酶產(chǎn)量低，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，許多內(nèi)切-b-1,4-葡聚糖酶基因已被成功克隆并進行了異源表達[5,7–10]。根據(jù)氨基酸序列及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點，內(nèi) 切-b-1,4-葡聚糖酶可劃分為糖苷水解酶家族5、6、7、8、9、10、12、26、44、45、48、51、74和124等[11–12]。

腐生真菌構(gòu)巢曲霉能降解多種多糖，和基因組測序的結(jié)果一致：該真菌編碼許多種降解多糖的基因[13–14]。來源于構(gòu)巢曲霉的72個糖苷酶已被Bauer等克隆并成功在畢赤酵母X-33中表達，但是Bauer等只對部分糖苷酶進行了簡單表征[13–14]。

由于內(nèi)切-b-1,4-葡聚糖酶的廣泛應(yīng)用，尋找新型、高效、穩(wěn)定的內(nèi)切-b-1,4-葡聚糖酶是工業(yè)酶制劑的熱點之一。構(gòu)巢曲霉一共編碼了4個內(nèi)切-b-1,4-葡聚糖酶，其中內(nèi)切-b-1,4-葡聚糖酶A10 (GenBank Accession No. AN1285.2) 對可溶性羧甲基纖維素鈉表現(xiàn)出了最高活性[14]。本文對該內(nèi)切纖維素酶進行了表達 (搖瓶與發(fā)酵罐) 與詳細表征 (最優(yōu)pH與反應(yīng)溫度，pH與熱穩(wěn)定性，二價金屬離子對CMCase活性的影響，動力學(xué)參數(shù)等)。另外，雖然構(gòu)巢曲霉編碼了72個糖苷酶基因，但是對構(gòu)巢曲霉來源糖苷酶研究的報道還比較少。因此，本文對內(nèi)切纖維素酶A10的酶學(xué)性質(zhì)研究，將為構(gòu)巢曲霉來源糖苷酶的深入研究與應(yīng)用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

無氨基酸酵母氮源 (Yeast nitrogen base W/O amino acid，YNB) 來自Difco公司；羧基甲纖維素鈉 (CMC-Na) 購自百靈威公司；其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

過表達來源于構(gòu)巢曲霉的內(nèi)切-b-1,4-葡聚糖酶A10 (GenBank Accession No. AN1285.2) 的畢赤酵母來自美國真菌遺傳保藏中心 (Fungal Genetics Stock Center，F(xiàn)GSC)。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母提取物10；YPD平板 (g/L)：YPD培養(yǎng)基添加瓊脂15。

BMGY生長培養(yǎng)基 (g/L)：YNB 13.4，甘油10，生物素0.000 4，磷酸鉀緩沖溶液0.1 mol/L，pH 6.0。

BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (g/L)：YNB 13.4，甲醇0.5% (/)，生物素0.000 4，磷酸鉀緩沖溶液 (0.1 mol/L，pH 6.0)。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基：采用無機鹽培養(yǎng)基，配方參考(http://tools.thermofisher.com/content/ sfs/manuals/pichiaferm_prot.pdf) (mL，g/L)：H3PO426.7，CaSO40.93，K2SO418.2，MgSO4·7H2O 14.9，KOH 4.13，甘油40，PTM1 4.35，pH 5.0，121 ℃，0.1 Mpa，30 min滅菌。

PTM1微量元素溶液 (g/L)：CuSO4·5H2O 6.0, KI 0.08, MnSO4·H2O 0.5, NaMoO4·2H2O 0.2, H3BO30.02, CoCl20.5, ZnCl220.0, FeSO4·7H2O 65, Biotin 0.2, H2SO45，混勻過濾除菌，4 ℃避光保存。

甘油補料培養(yǎng)基：甘油50%，PTM1 4.35 mL/L。

甲醇補料培養(yǎng)基：甲醇100%，PTM1 4.35 mL/L。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)的搖瓶表達

平板培養(yǎng)：從甘油管中接菌并在YPD平板上劃線，30 ℃培養(yǎng)3–4 d。

種子培養(yǎng)：從YPD平板上挑單菌落并接種到BMGY中，250 mL三角瓶裝50 mL培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min回轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)過夜。

誘導(dǎo)產(chǎn)酶：當(dāng)600達到3–4左右時，離心收集全部菌體，轉(zhuǎn)入BMMY中，使600至1.0左右，250 mL擋板三角瓶 (Baffled flasks) 裝50 mL培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)，每24 h補加0.5 % (/) 甲醇，誘導(dǎo)120 h。

1.2.2 蛋白質(zhì)的發(fā)酵罐表達

種子培養(yǎng)：從YPD平板上挑單菌落并接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)20 h，得到一級種子，再將一級種子10%接種到1 L的YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)10 h，得到二級種子。

A10的發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：將二級種子按10%的接種量接種至10 L發(fā)酵罐中，初始培養(yǎng)參數(shù)為：轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)溫度30 ℃，pH 5.0。隨著菌體的生長，DO (Dissolved oxygen，溶氧量) 逐漸下降，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量和罐壓，使DO維持在20%–30%，發(fā)酵過程中采用氨水自動控制pH值在5.0。當(dāng)DO回升時，按照20–36 mL/min的速度流加甘油，使菌體繼續(xù)生長至濕重約200 g/L，停止流加甘油。當(dāng)DO回升至100%時，繼續(xù)饑餓培養(yǎng)30 min，然后流加甲醇進行誘導(dǎo)，流加速度為：0–4 h，3.5 mL/(L·h)；5–24 h，逐漸提高流加速度到10 mL/(L·h)，并一直維持該速度至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程中，每隔一定時間取樣檢測，測定發(fā)酵液的光密度600及菌體濕重，并留上清用于蛋白質(zhì)的SDS-PAGE及CMCase活性分析和觀察。

1.2.3600及細胞濕重的測定

發(fā)酵液稀釋后于波長600 nm處進行比色測定，600=600讀數(shù)×稀釋倍數(shù)；取4 mL發(fā)酵液在10 000 r/min離心10 min，吸盡上清液后，稱得的細胞重量換算為每升的克數(shù)即細胞 濕重。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE檢測

為了檢測內(nèi)切-b-1,4-葡聚糖酶A10的表達情況，采用SDS-PAGE檢測，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，用考馬斯亮藍G-250染色。

1.2.5 蛋白質(zhì)濃度測定

參照Bradford 的方法采用考馬斯亮藍G-250法進行可溶性蛋白質(zhì)含量測定。以牛血清白蛋白 (BSA) 作為標準蛋白質(zhì)，配制標準溶液，制作標準曲線[15]。

1.2.6 CMCase活性分析

參考飼料行業(yè)對內(nèi)切纖維素酶的CMCase活性分析方法 (NY/T 912-2004)，對表達的內(nèi)切纖維素酶A10進行CMCase活性分析。使用5 mg/mL的羧甲基纖維素鈉 (CMC-Na) 作為底物，加入一定量、稀釋過的酶，反應(yīng)體積為1 mL，在37 ℃、pH值為5.5 (0.1 mol/L醋酸鈉) 的條件下反應(yīng)15 min，加入1.5 mL DNS (3,5-二硝基水楊酸) 試劑終止反應(yīng)，沸水浴加熱5 min，用自來水冷卻至室溫，然后加入2.5 mL蒸餾水，以標準空白樣為空白對照，在540 nm處測定吸光度。根據(jù)葡萄糖的標準曲線，計算還原糖的含量，并計算內(nèi)切纖維素酶比酶活。一個酶活單位U定義為每分鐘釋放的還原糖等同1mmol葡萄糖所需要的酶量。

1.2.7 最適反應(yīng)pH與pH穩(wěn)定性

使用5 mg/mL的CMC-Na作為底物，在 50 mmol/L、pH 2.0–12.0的B & R (Britton and Robinson) 緩沖溶液中測定A10的最優(yōu)反應(yīng)pH。不同pH條件下的CMCase活性分析都在37 ℃下反應(yīng)15 min，分別計算比酶活。

A10的pH穩(wěn)定性按照下面的過程測定：首先把A10在4 ℃、不同pH值 (pH 2.0–11.0) 分別孵育1 h、5 h、24 h及120 h，然后立即在標準條件下 (最優(yōu)pH 4.0、37 ℃，反應(yīng)15 min) 進行CMCase活性分析。把A10在最優(yōu)pH 4.0時的初始比酶活作為100%，在不同pH、時間點的殘余比酶活和pH 4.0時的初始比酶活進行比較，即得到不同pH、時間點的殘余CMCase活性的百分比。

1.2.8 最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性

使用5 mg/mL的CMC-Na作為底物，在 50 mmol/L、最優(yōu)pH 4.0的B & R緩沖溶液中測定A10的最優(yōu)反應(yīng)溫度。不同溫度下的CMCase活性分析都反應(yīng)15 min，分別計算比酶活。

A10的熱穩(wěn)定性按照下面的過程測定：首先把A10在不同溫度 (50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃及90 ℃) 分別孵育15 min、30 min、1 h及2 h，然后立即在標準條件下 (最優(yōu)pH 4.0、37 ℃，反應(yīng)15 min) 進行CMCase活性分析。如果A10在某一溫度失活速度太快，將在該溫度孵育5 min和10 min。把A10在標準條件下的初始比酶活作為100%，在不同溫度、時間點的殘余比酶活和標準條件時的初始比酶活進行比較，即得到不同溫度、時間點殘余CMCase活性的百分比。

1.2.9 二價金屬離子對CMCase活性的影響

二價金屬離子對A10 CMCase活性影響的分析過程：在上述標準CMCase活性分析體系中，分別加入1 mmol/L的二價金屬離子 (Pb(CH3COO)2，NiSO4，MnSO4，CuSO4，BaCl2，ZnSO4，CoCl2，CaCl2，MgCl2，F(xiàn)eSO4)，在標準條件下 (最優(yōu)pH 4.0、37 ℃，反應(yīng)15 min) 進行CMCase活性分析。把A10在標準條件下的初始比酶活作為100%，在添加不同金屬離子時的比酶活和標準條件時的初始比酶活進行比較，即得到添加不同金屬離子時比酶活的百 分比。

1.2.10 動力學(xué)參數(shù)測定

使用0.15%–2% (/) 的CMC-Na作為底物，在50 mmol/L、最優(yōu)pH 4.0的B & R緩沖溶液中測定A10的動力學(xué)參數(shù)，根據(jù)Lineweaver-Burk方程推算m和max。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)的搖瓶表達

首先在搖瓶中培養(yǎng)過表達內(nèi)切纖維素酶A10 (GenBank Accession No. AN1285.2) 的畢赤酵母，用0.5%的甲醇連續(xù)誘導(dǎo)120 h，進行SDS-PAGE分析 (圖１)。結(jié)果表明，在44 kDa左右出現(xiàn)明顯條帶?；谠摰鞍踪|(zhì)的氨基酸序列預(yù)測該蛋白質(zhì)的分子量為35.8 kDa，44 kDa條帶的分子量遠高于預(yù)測分子量，可能是由于在畢赤酵母中表達蛋白質(zhì)時的糖基化所致。隨著誘導(dǎo)時間的延長，主要蛋白質(zhì)的表達量也逐漸增加，并通過CMCase活性分析進一步驗證。

圖1 搖瓶表達A10的SDS-PAGE分析w

2.2 蛋白質(zhì)的發(fā)酵罐表達

我們用10 L發(fā)酵罐 (5 L發(fā)酵液) 對內(nèi)切纖維素酶A10進行了大量表達。過表達內(nèi)切纖維素酶A10畢赤酵母工程菌株的生長曲線如圖2所示，菌體濕重和600的結(jié)果一致，隨著發(fā)酵時間的延長，兩者都呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢。當(dāng)菌體濕重達到238 g/L即第37 h時開始用甲醇誘導(dǎo)，連續(xù)誘導(dǎo)70 h。

從蛋白質(zhì)的濃度變化來看 (圖2)，隨著誘導(dǎo)時間的延長，蛋白質(zhì)的表達量呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢，117 h時發(fā)酵產(chǎn)量達到0.89 mg/mL。并進行了CMCase活性分析。

2.3 蛋白質(zhì)的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 最適反應(yīng)pH與pH穩(wěn)定性

pH-活性曲線的結(jié)果表明 (圖3)：pH 4.0時A10表現(xiàn)出了最高CMCase活性，pH 2.0–8.0時CMCase活性為最高CMCase活性的50%以上，而pH 9.0–12.0時CMCase活性大大降低，僅為最高CMCase活性的10%左右。因此pH對A10的CMCase活性有非常大的影響，該酶為一酸性內(nèi)切纖維素酶。

圖2 過表達A10工程菌體的生長曲線、蛋白質(zhì)濃度與CMCase活性

圖3 pH對CMCase活性的影響

pH穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn) (圖4)，A10在pH 2–12表現(xiàn)出了非常高的穩(wěn)定性，在pH 9–12孵育10 d后，CMCase活性也僅僅失去10%左右。

2.3.2 最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性

研究了溫度對A10 CMCase活性的影響 (圖5)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，80℃時A10表現(xiàn)出了最高CMCase活性；20℃時CMCase活性也比較高，為最高CMCase活性的70%左右；在100℃時，CMCase活性為最高CMCase活性的80%左右。

同時也考察了A10的熱穩(wěn)定性 (圖6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A10在50℃和60℃時非常穩(wěn)定，在50℃孵育2 h后，幾乎沒有丟失CMCase活性，在60℃孵育2 h后，僅僅丟失5%左右的CMCase活性。但是，在70℃時，A10孵育15 min后，僅保留20%左右的初始CMCase活性，而孵育1 h后，A10幾乎完全失活。在80℃和90℃時，A10的失活速度加快，孵育5 min后，丟失95%左右的CMCase活性。

圖4 A10的pH穩(wěn)定性

2.3.3 金屬離子對CMCase活性的影響

研究了二價金屬離子對A10 CMCase活性的影響 (圖7)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Co2+、Mn2+、Fe2+促進了A10的CMCase活性，尤其Co2+，將CMCase活性提高了25%左右。Pb2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+和Mg2+表現(xiàn)出了一定的抑制作用。Ba2+和Ca2+對CMCase活性沒有太大影響。

圖5 溫度對CMCase活性的影響

圖6 A10的熱穩(wěn)定性

圖7 二價金屬離子對CMCase活性的影響

2.3.4 動力學(xué)參數(shù)測定

使用0.15%–2% (/) 的CMC-Na作為底物，根據(jù)Lineweaver-Burk方程計算了A10的 動力學(xué)參數(shù)，m和max分別為6 mg/mL和 45.4mmol/(min×mg)。

3 討論

由于來源于里氏木霉纖維素酶在第二代生物乙醇生產(chǎn)中的重要性，目前對里氏木霉纖維素酶的研究非常多，包括異源表達、酶學(xué)性質(zhì)研究、規(guī)?；囵B(yǎng)以及蛋白質(zhì)工程改造等[4,7–10,16]。相比而言，對來源于構(gòu)巢曲霉的纖維素酶及其他糖苷酶的研究比較少。構(gòu)巢曲霉也是一種重要的絲狀真菌，按照基因組序列，至少編碼了72種糖苷酶基因。雖然學(xué)者已經(jīng)克隆、表達、純化了一些來源于構(gòu)巢曲霉的糖苷酶，但是針對這些糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)研究 (包括最優(yōu)pH與溫度、pH與熱穩(wěn)定性，金屬離子對CMCase活性的影響等) 方面的報道還比較少[14,17–19]。本文比較系統(tǒng)研究了構(gòu)巢曲霉來源的內(nèi)切-b-1,4-葡聚糖酶A10 (GenBank Accession No. AN1285.2) 的酶學(xué)性質(zhì)。

來源于構(gòu)巢曲霉的內(nèi)切-b-1,4-葡聚糖酶A10在搖瓶及發(fā)酵罐中都成功獲得表達，在10 L發(fā)酵罐中的最高表達量達到了0.89 mg/mL。針對內(nèi)切-b-1,4-葡聚糖酶A10的酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶的最適pH為4.0，和文獻報道的一致，屬于酸性內(nèi)切纖維素酶[14]；該酶的最適反應(yīng)溫度為80 ℃，在100 ℃時仍保留了較高的CMCase活性，而文獻報道的最優(yōu)溫度為57 ℃[14]。該酶在很寬的pH范圍內(nèi) (pH 2.0–12.0) 表現(xiàn)出了非常高的穩(wěn)定性，孵育10 d后，仍保留90%以上的CMCase活性，該酶表現(xiàn)出了非常強的耐酸、耐堿能力；該蛋白質(zhì)在50 ℃和60 ℃時表現(xiàn)出了非常高的穩(wěn)定性，但是在370 ℃時，其耐熱性大大降低。和里氏木霉的內(nèi)切纖維素酶Cel5A相比，兩種酶的最適pH及熱穩(wěn)定性很接近，但二者的最適反應(yīng)溫度差別比較大：Cel5A在60 ℃時CMCase活性最高[10]，而構(gòu)巢曲霉內(nèi) 切-b-1,4-葡聚糖酶A10在80 ℃時CMCase活性最高。來自木霉C-4的天然內(nèi)切纖維素酶在pH 2.0–8.0之間也表現(xiàn)出了很高的穩(wěn)定性[20]。內(nèi)切酶A10的m和里氏木霉來源內(nèi)切纖維素酶Cel5A的m(4.93 mg/mL) 相當(dāng)，但是max比Cel5M的[275.9mmol/(min×mg)] 低很多[10]。需要指出的是：我們是在37 ℃時測定的動力學(xué)參數(shù)，而Cel5A的動力學(xué)參數(shù)是在60 ℃時測定的[10]。

眾所周知，金屬離子作為一種輔酶因子或抑制因子對酶的水解有很大影響[21]。本研究發(fā)現(xiàn)：Co2+、Mn2+和Fe2+促進了A10的CMCase活性，而Pb2+、Ni2+和Cu2+等金屬離子對A10有一定的抑制作用。同樣有研究報道Co2+和Mn2+提高了一些纖維素內(nèi)切酶的CMCase活性[22–23]；Fe2+既能促進纖維素內(nèi)切酶的CMCase活性，也能抑制其他纖維素酶的CMCase活性[22,24]；Pb2+提高了來源于類芽胞桿菌屬sp. BME-1的Cel9的CMCase活性[23]，但是抑制了來源于酵母的內(nèi)切纖維素酶的CMCase活性[25]；Ni2+抑制纖維素酶的CMCase活性[24]；Cu2+也對一些內(nèi)切纖維素酶表現(xiàn)出了抑制作用[22–23]。因此，綜合金屬離子對內(nèi)切纖維素酶CMCase活性影響的結(jié)果表明：不同的金屬離子對CMCase活性有不同的影響，同一種金屬離子對不同微生物來源的內(nèi)切纖維素酶有不同的影響。

目前市場上的纖維素酶產(chǎn)品通常是內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、b-葡萄糖苷酶等的復(fù)合酶，而市售的單一內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)品還比較少。構(gòu)巢曲霉內(nèi)切-b-1,4-葡聚糖酶A10表現(xiàn)出了非常好的性能 (耐酸、耐堿及一定的耐熱性)，因此具有開發(fā)為商品酶的潛力。同時，本研究也拓寬了人們對構(gòu)巢曲霉來源糖苷酶的認識，將為構(gòu)巢曲霉糖苷酶的深入研究以及應(yīng)用開發(fā)提供指導(dǎo)。

[1] Himmel ME, Xu Q, Luo Y, et al. Microbial enzyme systems for biomass conversion: emerging paradigms. Biofuels,2010, 1(2): 323–341.

[2] Dashtban M, Schraft H, Qin W.Fungal bioconversion of lignocellulosic residues; opportunities & perspectives. Int J Biol Sci,2009, 5(6): 578–595.

[3] Maki M, Leung KT, Qin W. The prospects of cellulase-producing bacteria for the bioconversion of lignocellulosic biomass. Int J Biol Sci,2009, 5(5): 500–516.

[4] Zhang YHP, Himme ME, Mielenz JR. Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies. Biotechnol Adv, 2006, 24(5): 452–481.

[5] Ni J, Takehara M, Watanabe H. Heterologous overexpression of a mutant termite cellulase gene inby DNA shuffling of four orthologous parental cDNAs. Biosci Biotechnol Biochem, 2005, 69(9): 1711–1720.

[6] Kim D, Baik KS, Park SC, et al. Cellulase production fromsp. NO3isolated from the sea squirt. J Ind Microbiol Biotechnol, 2009, 36(11): 1375–1382.

[7] Qin Y, Wei X, Liu X, et al. Purification and characterization of recombinant endoglucanase ofexpressed inwith higher glycosylation and stability. Protein Expr Purif, 2008, 58(1): 162–167.

[8] Akbarzadeh A, Ranaei Siadat SO, Motallebi M, et al. Characterization and high level expression of acidic endoglucanase in. Appl Biochem Biotechnol, 2014, 172(4): 2253–2265.

[9] Boonvitthya N, Bozonnet S, Burapatana V, et al. Comparison of the heterologous expression ofendoglucanase Ⅱand cellobiohydrolase Ⅱin the yeastsand. Mol Biotechnol, 2013, 54(2): 158–169.

[10] Bai RH, Zhang YB, Wang CD, et al. Gene optimization and efficient expression ofCel5A inChin J Biotech, 2016, 32(10): 1381–1394 (in Chinese).白仁惠, 張云博, 王春迪, 等. 里氏木霉Cel5A基因優(yōu)化及其在畢赤酵母中的高效表達. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(10): 1381–1394

[11] Cantarel BL, Coutinho PM, Rancurel C, et al. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy): an expert resource for glycogenomics. Nucleic Acids Res, 2009, 37: D233–D238.

[12] Henrissat BA. Classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem J, 1991, 280 (Pt 2): 309–316.

[13] Galagan JE, Calvo SE, Cuomo C, et al. Sequencing ofand comparative analysis withandNature, 2005, 438:1105–1115.

[14] Bauer S, Vasu P, Persson S, et al. Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(30): 11417–11422.

[15] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

[16] Qin Y, Wei X, Song X, et al. Engineering endoglucanase II fromto improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum. J Biotechnol, 2008, 135(2): 190–195.

[17] Bauer S, Vasu P, Mort AJ, et al. Cloning, expression, and characterization of an oligoxyloglucan reducing end-specific xyloglucano- biohydrolase from. Carbohydr Res, 2005, 340(17): 2590–2597.

[18] Pérez-González JA, van Peij NNME, Bezoen A, et al. Molecular cloning and transcriptional regulation of thegene encoding a β-xylosidase. Appl Environ Microbiol, 1998, 64(4): 1412–1419.

[19] Pérez-Gonzalez JA, De Graaff LH, Visser J, et al. Molecular cloning and expression inof twoxylanase genes. Appl Environ Microbiol, 1996, 62(6): 2179–2182.

[20] Sul OJ, Kim JH, Park SJ, et al. Characterization and molecular cloning of a novel endoglucanase fromsp. C-4. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 66(1): 63–70.

[21] Jabbar A, Rashid MH, Javed MR, et al. Kinetics and thermodynamics of a novel endoglucanase (CMCase) fromproduced under solidstate condition. J Ind Microbiol Biotechnol, 2008, 35(6): 515–524.

[22] Yang J, Dang H. Cloning and characterization of a novel cold-active endoglucanase establishing a new subfamily of glycosyl hydrolase family 5 from a psychrophilic deep-sea bacterium. FEMS Microbiol Lett, 2011, 325(1): 71–76.

[23] Fu X, Liu P, Lin L, et al. A novel endoglucanase (Cel9P) from a marine bacteriumsp. BME-14. Appl Biochem Biotechnol, 2010, 160(6): 1627–1636.

[24] Tejirian A, Xu F. Inhibition of cellulase-catalyzed lignocellulosic hydrolysis by iron and oxidative metal ions and complexes. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(23): 7673–7682.

[25] Oikawa T, Tsukagawa Y, Soda K. Endo-β-glucanase secreted by a psychrotrophic yeast: purification and characterization. Biosci Biotechnol Biochem, 1998, 62(9):1751–1756.

(本文責(zé)編郝麗芳)

Overexpression and characterization of endo-cellulase A10 fromin

Jianjun Li1,2, Xiaolian Li1, Ziqiang Wang1, and Yuguang Du1,2

1 National Key Laboratory of Biochemical Engineering, National Engineering Research Center for Biotechnology (Beijing),Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China 2Key Laboratory of Biopharmaceutical Production & Formulation Engineering, The People’s Liberation Army,Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China

Endo-cellulases are important to efficiently hydrolyze cellulose, and widely used in biotechnology. In this study, we overexpressed and characterized an endo-cellulase from. This endo-cellulase was successfully overexpressed in flasks and fermentor, and its concentration in fermentor reached 0.89 mg/mL. The optimal pH and temperature of the were 4.0 and 80℃ respectively, and it was very stable between pH 2.0 and 12.0. It was thermally stable below 60 ℃, whereas it was inactivated very quickly above 70 ℃. Its CMCase activity could be enhanced by Co2+, Mn2+and Fe2+, whereas it was inhibited byPb2+, Ni2+and Cu2+. Therefore, this endo-cellulase exhibited good pH stability and thermostability below 60 ℃, and has the potential as commercial enzymes.

,endo-cellulase, enzymological properties, divalent metal ion, fermentation

November 11, 2016; Accepted:February 6, 2017

Jianjun Li. Tel/Fax: +86-10-82545039; E-mail: jjli@ipe.ac.cn Yuguang Du. Tel: +86-10-82545070; Fax: +86-10-82545039; E-mail: ygdu@ipe.ac.cn

10.13345/j.cjb.160442

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2014AA093511).

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃) (No. 2014AA093511) 資助。

2017-02-16

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170216.1027.003.html