基于電容測(cè)定的羅漢果細(xì)胞超低溫保藏快速方法

李佳瑞，王澤建，郭美錦,2，郭元昕，黃帥，宋云飛，孫圳，孫陽(yáng)陽(yáng)，孔凡晶，莊英萍,2

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基于電容測(cè)定的羅漢果細(xì)胞超低溫保藏快速方法

李佳瑞1，王澤建1，郭美錦1,2，郭元昕1，黃帥3，宋云飛3，孫圳1，孫陽(yáng)陽(yáng)1，孔凡晶1，莊英萍1,2

1 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237 2 上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200237 3 桂林萊茵生物科技股份有限公司，廣西桂林 541199

李佳瑞, 王澤建, 郭美錦, 等. 基于電容測(cè)定的羅漢果細(xì)胞超低溫保藏快速方法. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(5): 817–827.Li JR, Wang ZJ, Guo MJ, et al. Rapid cryopreservation for Siraitia grosvenorii cells based on cells’ capacitance detection. Chin J Biotech, 2017, 33(5): 817–827.

建立了一種基于活細(xì)胞電容值定量測(cè)定的植物細(xì)胞超低溫保藏的快速評(píng)價(jià)方法，優(yōu)化了羅漢果細(xì)胞超低溫保藏方法。通過(guò)采用活細(xì)胞傳感儀測(cè)定凍存后細(xì)胞的存活率并結(jié)合細(xì)胞生活力 (細(xì)胞線粒體活性/TTC) 對(duì)羅漢果細(xì)胞的低溫保藏過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，確定了羅漢果細(xì)胞較為適宜的冷凍保護(hù)劑組分為基本培養(yǎng)基中添加10%的蔗糖和10%的DMSO。預(yù)處理劑的考察實(shí)驗(yàn)表明，采用0.2 mol/L蔗糖的預(yù)處理劑處理細(xì)胞時(shí)凍存后細(xì)胞存活率和細(xì)胞活力較高；采用0.2 mol/L蔗糖預(yù)處理劑處理細(xì)胞時(shí)，隨著預(yù)處理時(shí)間的增加，細(xì)胞存活率先增加后降低，預(yù)處理時(shí)間為9 h時(shí)，細(xì)胞存活率和細(xì)胞活力最高。保藏后的細(xì)胞復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：細(xì)胞存活率與采用活細(xì)胞電容值得到的細(xì)胞存活率具有很好的一致性，同時(shí)經(jīng)過(guò)凍存的細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)后，仍保留了原始細(xì)胞的形態(tài)和合成甜苷V的特性，說(shuō)明該凍存方法適用于羅漢果細(xì)胞的超低溫保藏。因此基于活細(xì)胞傳感儀測(cè)得的電容值進(jìn)行細(xì)胞凍存過(guò)程細(xì)胞活性的快速評(píng)價(jià)方法具有較好的可行性和可靠性。

羅漢果細(xì)胞，活細(xì)胞傳感儀，超低溫保藏，冷凍保護(hù)劑，細(xì)胞電容值

羅漢果來(lái)源于葫蘆科苦瓜屬，為廣西桂林特有的一種珍貴的藥食兩用植物，其中含有的主要有效成分羅漢果甜苷(Mogrosides) 具有清熱潤(rùn)肺、利咽開(kāi)音、潤(rùn)腸通便的生物功能。最近有研究表明羅漢果還具有抗氧化、抗糖尿病和抗癌的功效，是肥胖癥、高血壓、糖尿病患者最好的甜味劑和保健品，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[1]。羅漢果甜苷主要通過(guò)羅漢果果實(shí)提取得到，目前，隨著市場(chǎng)需求量的大幅度增加，采用植物細(xì)胞愈傷組織懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)羅漢果甜苷逐漸成為研究的熱點(diǎn)[2-3]，優(yōu)良的羅漢果愈傷組織細(xì)胞的低溫保藏在穩(wěn)定生產(chǎn)效率方面非常關(guān)鍵，然而，關(guān)于羅漢果細(xì)胞懸浮培養(yǎng)以及其細(xì)胞系的低溫保藏技術(shù)卻鮮少報(bào)道。

現(xiàn)有的植物細(xì)胞系的保藏主要通過(guò)以下兩種方式。一種是在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代保存 (Subculture)，另一種則是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行低溫冷凍保藏(Cryopreservation)。冷凍保藏是將培養(yǎng)的愈傷組織細(xì)胞懸浮在加有冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至特定溫度[4](一般是低于–70 ℃的超低溫)。通過(guò)長(zhǎng)期繼代而保存細(xì)胞存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本昂貴，并且會(huì)出現(xiàn)植物細(xì)胞特性消失等缺點(diǎn)[5]。而細(xì)胞在超低溫的條件下，會(huì)停止胞內(nèi)的一系列代謝活動(dòng)，并能夠保持細(xì)胞自身的特性，大大降低細(xì)胞特性消失的風(fēng)險(xiǎn)。目前已有多種植物組織的器官和細(xì)胞培養(yǎng)物得到成功保存，例如新疆紫草細(xì)胞[6]，玫瑰茄[7]、三分三細(xì)胞[8]等。

植物細(xì)胞在冷凍保藏過(guò)程中會(huì)由于內(nèi)部或者外部水結(jié)成冰晶而造成細(xì)胞破裂和細(xì)胞活力降低，不同種類的植物細(xì)胞由于細(xì)胞組成結(jié)構(gòu)的不同，往往低溫保藏的處理方法也大有不同。以往均是采用細(xì)胞線粒體活性測(cè)定 (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)[9]或雙醋酸熒光素(Fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)[10]的方法來(lái)間接反映細(xì)胞在冷凍保藏后的活性情況，也可以采用凍存后將細(xì)胞在固體培養(yǎng)基上復(fù)蘇培養(yǎng)[11]。一般植物細(xì)胞的生長(zhǎng)周期都在3–4周，生長(zhǎng)較慢的細(xì)胞則需要1–2個(gè)月，同時(shí)植物細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程緩慢，因此在低溫保藏方法的優(yōu)化過(guò)程中，單次處理考察要耗費(fèi)幾個(gè)月甚至更長(zhǎng)的時(shí)間，效率低。建立一種對(duì)處理過(guò)程中細(xì)胞存活率或者死亡率的快速檢測(cè)方法，對(duì)于低溫處理工藝條件的優(yōu)化非常關(guān)鍵。

活細(xì)胞傳感儀(Viable cell mass monitor) 是利用電容法(Capacitance) 測(cè)量溶液中活細(xì)胞濃度。其主要原理是：在一定頻率的交變電場(chǎng)作用下，溶液中的離子發(fā)生遷移，而活細(xì)胞具有完整的絕緣性細(xì)胞膜，細(xì)胞中的離子受到束縛導(dǎo)致細(xì)胞膜極化，這使得細(xì)胞成為一個(gè)個(gè)微小的電容器，測(cè)量得到的電容值與溶液中的活細(xì)胞量存在良好的線性關(guān)系。其可以用于細(xì)菌[12]、霉菌[13]、酵母菌[14]、植物細(xì)胞[15]、動(dòng)物細(xì)胞[16]培養(yǎng)過(guò)程中活細(xì)胞濃度的準(zhǔn)確測(cè)定，是在生物過(guò)程監(jiān)測(cè)分析中很有前途的工具。李蘭等[17]在PHA發(fā)酵優(yōu)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)采用活細(xì)胞傳感儀在線采集的電容值比離線干重和值更能反映細(xì)胞的生長(zhǎng)和活性。羅艷霞等[18]采用活細(xì)胞傳感儀測(cè)定的活細(xì)胞數(shù)與平板活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定的菌體濃度也有非常好的線性關(guān)系，基于電容值計(jì)算出的比生長(zhǎng)速率比基于細(xì)胞氧代謝速率和二氧化碳釋放速率計(jì)算出的比生長(zhǎng)速率更可信。近年來(lái)，活細(xì)胞傳感儀也廣泛應(yīng)用于植物細(xì)胞的液態(tài)懸浮培養(yǎng)過(guò)程中[19-20]。王澤建等在紅豆杉細(xì)胞放大培養(yǎng)過(guò)程中，采用活細(xì)胞傳感儀在線監(jiān)測(cè)的細(xì)胞生物量與細(xì)胞干重在一定范圍內(nèi)也存在很好的線性關(guān)系[21]。在植物細(xì)胞紅花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的研究結(jié)果中也表明采用活細(xì)胞傳感儀能夠?qū)罴?xì)胞的濃度和細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)精確的監(jiān)控[22]。

本文考察分析了利用活細(xì)胞傳感儀進(jìn)行羅漢果細(xì)胞凍存處理過(guò)程中活細(xì)胞電容值的快速測(cè)定，計(jì)算得到細(xì)胞存活率 (Viability)，并結(jié)合TTC法測(cè)定的細(xì)胞線粒體活性 (Activity)，對(duì)羅漢果細(xì)胞保藏工藝條件的預(yù)處理劑種類、預(yù)處理時(shí)間，以及冷凍保護(hù)劑的成分等方法進(jìn)行評(píng)價(jià)和優(yōu)化，建立了一種新的快速定量的羅漢果細(xì)胞超低溫冷凍保藏的工藝方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和設(shè)備

活細(xì)胞傳感儀(Biomass Monitor 220，Hamilton瑞士)：四環(huán)式探頭，測(cè)定范圍為：0.2–150 pF/cm，測(cè)量精度：0.05–0.10g/L，超低溫冰箱 (Thermo Scientific)，旋轉(zhuǎn)式搖床(上海智誠(chéng)儀器公司)，紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) (上海棱光)，The EVOS?FL自動(dòng)成像系統(tǒng) (Thermo Fisher)。

1.2 培養(yǎng)基及細(xì)胞系

羅漢果懸浮細(xì)胞系是通過(guò)羅漢果種胚誘導(dǎo)出胚性松散的愈傷組織，并在液體培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)分散、過(guò)濾培養(yǎng)得到。培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基添加6-芐氨基嘌呤 (6-BA) 1.0 mg/L，萘乙酸(NAA) 0.5 mg/L，蔗糖30.0 g/L，肌醇100.0 mg/L，聚乙烯吡咯烷酮2.0 g/L。

1.3 方法

1.3.1 羅漢果細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立

將種子在無(wú)菌條件下進(jìn)行消毒處理后剝掉外部硬種殼，接入到含有激素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出胚性松散的愈傷組織，經(jīng)過(guò)不斷的繼代篩選，選取生長(zhǎng)均一的愈傷組織細(xì)胞接種至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

1.3.2 羅漢果懸浮細(xì)胞的超低溫保存方法

預(yù)處理：取一定量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，沉降后去除上清，加入等量的預(yù)處理劑，混勻后在110 r/min、25 ℃的條件下暗培養(yǎng)0–2 d，其目的在于誘導(dǎo)植物組織細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)性脫水，減少細(xì)胞內(nèi)自由水含量，防止細(xì)胞在冰凍過(guò)程中結(jié)冰，避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷及死亡。一般預(yù)處理劑為含有一定量濃度的滲透調(diào)節(jié)劑的糖溶液，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇等[23-24]。

冷凍保存：將預(yù)處理后的細(xì)胞進(jìn)行沉降處理，沉降后去除預(yù)處理劑，再加入等量的冷凍保護(hù)劑，在110 r/min、4 ℃的黑暗條件下孵育45 min。孵育后，先在–20 ℃冰箱內(nèi)放置40 min后，再放到–80 ℃進(jìn)行保存。

解凍復(fù)蘇：將凍存后的細(xì)胞，置于39 ℃水浴鍋中解凍，直至懸液中沒(méi)有冰塊，此過(guò)程一般2–3 min為宜，時(shí)間太久冷凍保護(hù)劑會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒害作用。解凍后迅速將冷凍保護(hù)劑去掉，加入相應(yīng)預(yù)處理劑清洗2–3次，逐步降低細(xì)胞中的DMSO濃度[25]。

1.3.3 羅漢果甜苷V的提取檢測(cè)

對(duì)照品溶液的制備：精確稱取50 mg的對(duì)照品溶解至10 mL的容量瓶中，用流動(dòng)相溶解成濃度為5 mg/mL的對(duì)照品原液，并分別稀釋成0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0和5.0 mg/mL后，0.22 μm濾膜過(guò)濾，濾液用高效液相色譜儀測(cè)定。以峰面積(mAU) 為縱坐標(biāo)，以羅漢果甜苷V濃度(mg/mL) 為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到線性方程。

供試品溶液的制備：取烘干后的細(xì)胞用碾缽將其碾成粉末狀，精密稱取5 g的干重細(xì)胞粉末置于錐形瓶中，以1∶10的固液比加入60%的乙醇超聲破碎提取40 min后，在90 ℃的微沸狀態(tài)下提取2 h。將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5 mL后，采用0.22 μm的濾膜過(guò)濾待用。

羅漢果甜苷V的檢測(cè)：色譜柱：Unitary C18柱 (5 μm，100A，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：水-乙腈 (78：22)；流速：l mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4 過(guò)程參數(shù)測(cè)定

1.4.1 活細(xì)胞保存率的測(cè)定

將活細(xì)胞傳感儀的電極沒(méi)入羅漢果細(xì)胞懸液中，進(jìn)行全頻掃描，確定活細(xì)胞傳感儀的檢測(cè)頻率為473 kHz。在此頻率下取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，離線測(cè)定細(xì)胞干重與電容值，發(fā)現(xiàn)在0.67–10.25 g/L細(xì)胞干重范圍內(nèi)，電容值與細(xì)胞干重具有良好的線性關(guān)系，此時(shí)活細(xì)胞電容值的測(cè)定范圍在7.0–160 pF/cm，所以采用電容值可以更科學(xué)、更方便地定量表征培養(yǎng)體系中活細(xì)胞濃度。

在此頻率下分別離線測(cè)定一定量預(yù)處理后的細(xì)胞懸液、解凍復(fù)蘇后的細(xì)胞懸液，以及經(jīng)過(guò)超聲、煮沸處理后的細(xì)胞懸液，混勻后進(jìn)行活細(xì)胞電容值的測(cè)定，分別記為Cap1、Cap2、Cap3?；罴?xì)胞保存率 (%)=(Cap2–Cap3)/ (Cap1–Cap3)×100。

圖1 離線測(cè)定干重與活細(xì)胞電容值的關(guān)系

1.4.2 細(xì)胞線粒體活性檢測(cè)

懸浮細(xì)胞經(jīng)8 μm濾膜抽濾后，取100 mg新鮮細(xì)胞，分別加入2.5 mL 0.4%的2,3,4-氯化三苯基四氮唑(TTC) 溶液和2.5 mL 0.05 mol/L的 Na2HPO4-NaH2PO4的磷酸緩沖液(pH 7.5)，混勻后25 ℃暗處理18 h。暗培養(yǎng)后離心去除上清液，細(xì)胞用蒸餾水洗滌3次，加入4 mL甲醇，置于60 ℃水浴50 min，期間振動(dòng)搖晃細(xì)胞，使底部細(xì)胞充分接觸甲醇，至細(xì)胞脫至無(wú)色。室溫靜置后，4 000 r/min離心5 min后取上清液，在485 nm下測(cè)定光密度 (485)，得到細(xì)胞活力[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 活細(xì)胞電容值與細(xì)胞濃度的線性關(guān)系

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期不同濃度的細(xì)胞分別將細(xì)胞稀釋1、2、4、6、10、20倍)測(cè)定其相應(yīng)的電容值，結(jié)果顯示在10–100 pF/cm測(cè)量值范圍內(nèi)與細(xì)胞濃度有良好的線性關(guān)系 (圖2)，其中對(duì)照空白 (無(wú)植物細(xì)胞) 或?qū)⒓?xì)胞100 ℃高溫殺死后，培養(yǎng)液中只有7 pF/cm電容值，因此，在測(cè)定過(guò)程中，對(duì)于活細(xì)胞濃度測(cè)定值的基礎(chǔ)上進(jìn)行對(duì)應(yīng)空白培養(yǎng)基質(zhì)電容值的校正后，得到的較正活細(xì)胞電容值能夠很好地表征活細(xì)胞濃度。

圖2 細(xì)胞相對(duì)濃度與活細(xì)胞電容值的線性關(guān)系

2.2 不同冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞冷凍保存的影響

常被用作冷凍保護(hù)劑的有甘油、二甲基亞砜 (DMSO)、蔗糖、山梨醇、聚乙二醇 (PEG) 等。其中，甘油和DMSO為滲透性冷凍保護(hù)劑，蔗糖和山梨醇是非滲透性冷凍保護(hù)劑，一些研究提出將滲透性和非滲透性冷凍保護(hù)劑組合使用的效果要優(yōu)于采用一種冷凍保護(hù)劑[27]。但不同的植物細(xì)胞在冷凍保存方法上有非常大的差異。為此，將不同類型冷凍保護(hù)劑對(duì)羅漢果組織細(xì)胞的凍存條件進(jìn)行優(yōu)化。向培養(yǎng)基中添加不同濃度的DMSO (5%(/)、10%)、蔗糖(5%、10%)、山梨醇(5%、10%) 考察冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞凍存存活率的影響。將細(xì)胞用含有0.35 mol/L蔗糖的液體培養(yǎng)基預(yù)處理18 h后，進(jìn)行低溫冷凍處理，復(fù)蘇后進(jìn)行細(xì)胞活性的測(cè)定，結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 不同冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞凍存的影響

結(jié)果表明：不論是活細(xì)胞電容值還是細(xì)胞線粒體活性，加入冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞活性及存活率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不添加冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞。說(shuō)明冷凍保護(hù)劑在細(xì)胞凍存過(guò)程中起到了重要作用，大大提高了細(xì)胞的存活率。活細(xì)胞電容值 (Cap) 和TTC活性值也有較好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此，采用活細(xì)胞電容值可以用來(lái)較好地表征細(xì)胞在冷凍保藏后的存活率情況，從而快速地篩選出對(duì)細(xì)胞較好的冷凍保護(hù)劑組分及濃度。

將DMSO、蔗糖、山梨醇各個(gè)水平下活細(xì)胞電容值和TTC值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各水平冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞低溫保藏后存活率及活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3結(jié)果可以看出，10%含量的DMSO對(duì)細(xì)胞低溫保藏后的效果要優(yōu)于5% DMSO。而對(duì)于山梨醇和蔗糖，不論是細(xì)胞存活率還是線粒體活力，10%的含量對(duì)于細(xì)胞低溫保藏的效果都是最好的，且10%的蔗糖對(duì)于細(xì)胞保存的效果要優(yōu)于10%的山梨醇。因此確定細(xì)胞低溫保藏較好的冷凍保護(hù)劑成分為：細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基+10% DMSO+10%蔗糖。與經(jīng)過(guò)預(yù)處理但是不加冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞相比，此條件下細(xì)胞的活力保存率和線粒體活性(TTC值) 分別提高了224.43%和372.16%。

2.3 不同預(yù)處理劑對(duì)細(xì)胞冷凍保存的影響

預(yù)處理能降低植物細(xì)胞內(nèi)的含水量，減輕凍存過(guò)程中冰晶體形成及狀態(tài)對(duì)膜系統(tǒng)的損傷。預(yù)處理劑的種類以及預(yù)處理劑的濃度不同，對(duì)于細(xì)胞低溫保藏有很大影響。預(yù)處理劑濃度過(guò)高時(shí)，雖然脫水效果比較好，但有可能會(huì)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生不可逆的影響，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及內(nèi)部組織造成一定的損傷；但細(xì)胞若不進(jìn)行脫水預(yù)處理，含水量太高則會(huì)在冷凍過(guò)程中形成大量冰晶刺破細(xì)胞。在前面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選擇蔗糖0.20、0.35、0.50 mol/L以及海藻糖0.20、0.35、0.50 mol/L進(jìn)行考察，對(duì)照為不進(jìn)行預(yù)處理、直接進(jìn)行凍存的細(xì)胞。

在一定量的預(yù)處理劑進(jìn)行處理時(shí) (蔗糖0.20 mol/L，海藻糖0.20、0.35 mol/L)，可以提高預(yù)處理后細(xì)胞的存活率，但是隨著蔗糖和海藻糖的濃度增加時(shí) (0.50 mol/L)，細(xì)胞的存活率和細(xì)胞活力均出現(xiàn)顯著降低。在預(yù)處理濃度為0.20 mol/L蔗糖時(shí)，細(xì)胞的凍存活力保持效果最好。與對(duì)照相比，細(xì)胞的活力保存率和線粒體活性(TTC值) 均有大幅度提高，活力保存率和細(xì)胞活性分別提高了29.18.%、36.72%，因此，選擇蔗糖0.20 mol/L作為預(yù)處理細(xì)胞的最佳條件。

2.4 不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)細(xì)胞冷凍保存的影響

預(yù)處理時(shí)間對(duì)細(xì)胞冷凍保藏后活性的影響與預(yù)處理劑的濃度原理相似，若細(xì)胞在具有一定滲透壓的環(huán)境下處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，有可能造成細(xì)胞的過(guò)度失水，這樣就造成細(xì)胞在預(yù)處理階段的活性大大降低，從而影響細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的活性。在前面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蔗糖0.20 mol/L為預(yù)處理劑，凍存培養(yǎng)基為：液體培養(yǎng)基+10% DMSO+10%蔗糖，對(duì)預(yù)處理時(shí)間0、1、2、5、9、22、46 h進(jìn)行考察。

以細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基) +10% DMSO+10%蔗糖作為冷凍保護(hù)劑，隨著預(yù)處理時(shí)間的增加，細(xì)胞的存活率和細(xì)胞活力出現(xiàn)鐘形變化曲線，細(xì)胞經(jīng)過(guò)蔗糖0.2 mol/L預(yù)處理劑預(yù)處理9 h后進(jìn)行超低溫保藏，細(xì)胞保存效果最好，與對(duì)照 (預(yù)處理0 h) 相比，細(xì)胞的活力保存率和線粒體活性(TTC值) 均有大幅度的提高 (圖5)。

圖5 預(yù)處理時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率和線粒體活力的影響

2.5 細(xì)胞復(fù)蘇后的驗(yàn)證試驗(yàn)

為了考察基于活細(xì)胞以及細(xì)胞線粒體活性作為評(píng)價(jià)細(xì)胞保存效果的可靠性，在進(jìn)行預(yù)處理時(shí)間考察的同時(shí)，選擇預(yù)處理0、2、9、22、46 h對(duì)凍存后的細(xì)胞進(jìn)行解凍復(fù)蘇。將解凍復(fù)蘇后的細(xì)胞重新接種到半固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在25 ℃的條件下暗培養(yǎng)21 d后，統(tǒng)計(jì)相對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞存活率，以公式進(jìn)行計(jì)算：細(xì)胞存活率=凍/未凍，凍：經(jīng)過(guò)凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后的鮮重，未凍：未經(jīng)過(guò)凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后的鮮重。

從復(fù)蘇結(jié)果 (圖6) 可以看出，預(yù)處理9 h后細(xì)胞計(jì)算得出的存活率為33.67%，與采用活細(xì)胞傳感儀得出的結(jié)論相同。其中預(yù)處理22 h和46 h的細(xì)胞存活率相對(duì)較低，從復(fù)蘇過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)來(lái)看，可能是因?yàn)轭A(yù)處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的細(xì)胞脫水比較嚴(yán)重，細(xì)胞凍存過(guò)程中滲入到胞內(nèi)的DMSO不易從細(xì)胞中被洗脫出來(lái)，從而對(duì)細(xì)胞造成了一定的毒害作用，導(dǎo)致細(xì)胞的存活率比較低。從圖7顯微鏡圖上來(lái)看，經(jīng)過(guò)凍存和沒(méi)有經(jīng)過(guò)凍存的細(xì)胞形態(tài)相同，表明此條件凍存效果最好。

圖6 不同預(yù)處理時(shí)間復(fù)蘇后細(xì)胞存活率

圖7 低溫保藏羅漢果細(xì)胞復(fù)蘇后生長(zhǎng)圖

2.6 細(xì)胞凍存后羅漢果甜苷V合成能力的驗(yàn)證

根據(jù)方法中所述的羅漢果甜苷V的檢測(cè)方法，配置0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mg/mL的7種不同濃度的羅漢果甜苷V對(duì)照品溶液，根據(jù)所出峰面積以及相應(yīng)的甜苷V濃度繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用此檢測(cè)方法得到的峰面積與甜苷V的濃度具有較好的線性關(guān)系，=248.28+ 16.52。將凍存后的細(xì)胞在B5培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)蘇，繼代2次后，在第22天收獲細(xì)胞進(jìn)行甜苷V的提取和高效液相色譜檢測(cè) (圖9)。結(jié)果顯示凍存后的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后，羅漢果甜苷V的合成能力可達(dá)到2.19 mg/g干重細(xì)胞，與凍存之前細(xì)胞合成羅漢果甜苷V的能力相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)凍存后的細(xì)胞很好地保留了其合成甜苷V的特性，該凍存存活率快速測(cè)定方法能夠很好地用于植物細(xì)胞的低溫保藏過(guò)程評(píng)價(jià)。

圖8 羅漢果甜苷V對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

本文通過(guò)采用活細(xì)胞傳感儀建立了一種基于電容測(cè)定的羅漢果細(xì)胞超低溫冷凍保藏及存活率的快速評(píng)價(jià)方法。以往細(xì)胞凍存后的評(píng)價(jià)方法主要采用的是測(cè)定細(xì)胞線粒體活力 (TTC) 或FDA方法來(lái)間接反映凍存方法對(duì)細(xì)胞凍存的效果，或者采用凍存后細(xì)胞復(fù)蘇的方法。但是這兩種方法都存在一定的缺陷，采用FDA法并不能完全表征細(xì)胞凍存后的存活率[28]；TTC法則是TTC溶液進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與細(xì)胞線粒體上的酶發(fā)生反應(yīng)而顯色，通過(guò)顏色的深淺反應(yīng)細(xì)胞生活力強(qiáng)弱，與細(xì)胞呼吸作用直接相關(guān)，呼吸作用容易受環(huán)境溫度、空氣、水分等的影響，造成結(jié)果誤差較大。由于植物細(xì)胞具有生長(zhǎng)周期長(zhǎng)的特點(diǎn)，若采用細(xì)胞復(fù)蘇的方法則會(huì)使得方法的建立需要較長(zhǎng)周期，效率低。卞福花等曾采用中性紅染色細(xì)胞統(tǒng)計(jì)存活率的方式優(yōu)化細(xì)胞凍存的方法，但是由于植物細(xì)胞具有聚團(tuán)生長(zhǎng)的特性，使得細(xì)胞在計(jì)數(shù)時(shí)存在困難，需要對(duì)大量的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，工作量大，易于產(chǎn)生誤差[29]。本文首次采用活細(xì)胞傳感儀建立了量化的評(píng)價(jià)體系，對(duì)細(xì)胞凍存的方法進(jìn)行了優(yōu)化，快速地建立了適于羅漢果細(xì)胞冷凍保藏的方法。

本文結(jié)果表明向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加10%的蔗糖與10%的DMSO時(shí)，細(xì)胞經(jīng)過(guò)凍存后的活率比較高，為較好的冷凍保護(hù)劑。在一定的預(yù)處理劑濃度 (蔗糖0.20 mol/L) 和預(yù)處理時(shí)間 (9 h) 下，細(xì)胞的存活率相對(duì)于不進(jìn)行預(yù)處理細(xì)胞有大大提高，但是隨著預(yù)處理劑濃度的升高以及預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的存活率和細(xì)胞活力均有大幅度的下降，說(shuō)明一定的脫水處理對(duì)于細(xì)胞的保存有利，但是過(guò)度脫水的話則會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，降低凍存后的細(xì)胞存活率。

將預(yù)處理不同時(shí)間的細(xì)胞經(jīng)過(guò)凍存復(fù)蘇后，測(cè)定出來(lái)的細(xì)胞存活率與活細(xì)胞電容值測(cè)定的存活率相近，表明了此種評(píng)價(jià)方法的可靠性。采用優(yōu)化后的條件對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后，細(xì)胞存活率可以達(dá)到70%，且顯微鏡觀察其形態(tài)與未經(jīng)過(guò)凍存的細(xì)胞形態(tài)幾乎相同，其有效代謝物甜苷V的合成特性也得以繼續(xù)保存，說(shuō)明此方法對(duì)細(xì)胞的保存效果較好，能夠較好地保持凍存后細(xì)胞的特性。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Rapid cryopreservation forcells based on cells’ capacitance detection

Jiarui Li1, Zejian Wang1, Meijin Guo1,2, Yuanxin Guo1, Shuai Huang3, Yunfei Song3,Zhen Sun1, Yangyang Sun1, Fanjing Kong1, and Yingping Zhuang1,2

1 State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China 2 Shanghai Biological Manufacturing Technology Innovation Center, Shanghai 200237, China 3 Guilin Layn Biotechnology Company, Guilin 541199, Guangxi, China

A rapid quantitative evaluation method forcells was successfully developed based on plant cells’ capacitance value detected by a viable cell mass monitor and the cryopreservation ofsuspension cells was optimized. The survival rate ofcells was quantitatively measured by viable cell mass monitor and 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride (TTC). An optimum cryoprotectant recipe is that the growth medium contained 10% sucrose and 10% DMSO. The experimental results also showed higher cell survival rates and cell viabilities were achieved when suspension cells were treated with pretreatment of 0.2 mol/L sucrose. With the increase of concentration of sucrose, however, the cell survival rate was decreased. And the cell survival rate represented a bell shape with the increase of pretreatment time. The highest cell survival rate and cell viability were obtained with the 9 h’ s pretreatment. In addition, there was a good correlation between the cell survival rate measured by cell recovery test and that measured by viable cell mass monitor, while there were no significant differences in the cell morphology and the ability of mogrosides V production bycells cultured in suspension after cryopreservation. Therefore, the evaluation method developed based on the viable cell mass monitor has good feasibility and reliability.

cells, viable cell mass monitor, cryopreservation, cryoprotectant, cells’ capacitance

December 22, 2016; Accepted:March 20, 2017

Meijin Guo. Tel/Fax: +86-21-64251131; E-mail: guo_mj@ecust.edu.cn

10.13345/j.cjb.160490

國(guó)家高技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2014AA021705) 資助。

2017-04-12

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170412.1054.002.html

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2014AA021705).