• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于電容測定的羅漢果細(xì)胞超低溫保藏快速方法

    2017-07-05 14:12:49李佳瑞王澤建郭美錦郭元昕黃帥宋云飛孫圳孫陽陽孔凡晶莊英萍
    生物工程學(xué)報 2017年5期

    李佳瑞,王澤建,郭美錦,2,郭元昕,黃帥,宋云飛,孫圳,孫陽陽,孔凡晶,莊英萍,2

    ?

    基于電容測定的羅漢果細(xì)胞超低溫保藏快速方法

    李佳瑞1,王澤建1,郭美錦1,2,郭元昕1,黃帥3,宋云飛3,孫圳1,孫陽陽1,孔凡晶1,莊英萍1,2

    1 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室,上海 200237 2 上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200237 3 桂林萊茵生物科技股份有限公司,廣西桂林 541199

    李佳瑞, 王澤建, 郭美錦, 等. 基于電容測定的羅漢果細(xì)胞超低溫保藏快速方法. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(5): 817–827.Li JR, Wang ZJ, Guo MJ, et al. Rapid cryopreservation for Siraitia grosvenorii cells based on cells’ capacitance detection. Chin J Biotech, 2017, 33(5): 817–827.

    建立了一種基于活細(xì)胞電容值定量測定的植物細(xì)胞超低溫保藏的快速評價方法,優(yōu)化了羅漢果細(xì)胞超低溫保藏方法。通過采用活細(xì)胞傳感儀測定凍存后細(xì)胞的存活率并結(jié)合細(xì)胞生活力 (細(xì)胞線粒體活性/TTC) 對羅漢果細(xì)胞的低溫保藏過程進(jìn)行優(yōu)化,確定了羅漢果細(xì)胞較為適宜的冷凍保護(hù)劑組分為基本培養(yǎng)基中添加10%的蔗糖和10%的DMSO。預(yù)處理劑的考察實驗表明,采用0.2 mol/L蔗糖的預(yù)處理劑處理細(xì)胞時凍存后細(xì)胞存活率和細(xì)胞活力較高;采用0.2 mol/L蔗糖預(yù)處理劑處理細(xì)胞時,隨著預(yù)處理時間的增加,細(xì)胞存活率先增加后降低,預(yù)處理時間為9 h時,細(xì)胞存活率和細(xì)胞活力最高。保藏后的細(xì)胞復(fù)蘇實驗結(jié)果表明:細(xì)胞存活率與采用活細(xì)胞電容值得到的細(xì)胞存活率具有很好的一致性,同時經(jīng)過凍存的細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)后,仍保留了原始細(xì)胞的形態(tài)和合成甜苷V的特性,說明該凍存方法適用于羅漢果細(xì)胞的超低溫保藏。因此基于活細(xì)胞傳感儀測得的電容值進(jìn)行細(xì)胞凍存過程細(xì)胞活性的快速評價方法具有較好的可行性和可靠性。

    羅漢果細(xì)胞,活細(xì)胞傳感儀,超低溫保藏,冷凍保護(hù)劑,細(xì)胞電容值

    羅漢果來源于葫蘆科苦瓜屬,為廣西桂林特有的一種珍貴的藥食兩用植物,其中含有的主要有效成分羅漢果甜苷(Mogrosides) 具有清熱潤肺、利咽開音、潤腸通便的生物功能。最近有研究表明羅漢果還具有抗氧化、抗糖尿病和抗癌的功效,是肥胖癥、高血壓、糖尿病患者最好的甜味劑和保健品,具有廣泛的應(yīng)用價值[1]。羅漢果甜苷主要通過羅漢果果實提取得到,目前,隨著市場需求量的大幅度增加,采用植物細(xì)胞愈傷組織懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)羅漢果甜苷逐漸成為研究的熱點[2-3],優(yōu)良的羅漢果愈傷組織細(xì)胞的低溫保藏在穩(wěn)定生產(chǎn)效率方面非常關(guān)鍵,然而,關(guān)于羅漢果細(xì)胞懸浮培養(yǎng)以及其細(xì)胞系的低溫保藏技術(shù)卻鮮少報道。

    現(xiàn)有的植物細(xì)胞系的保藏主要通過以下兩種方式。一種是在生長培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代保存 (Subculture),另一種則是對細(xì)胞進(jìn)行低溫冷凍保藏(Cryopreservation)。冷凍保藏是將培養(yǎng)的愈傷組織細(xì)胞懸浮在加有冷凍保護(hù)劑的溶液中,以一定的冷凍速率降至特定溫度[4](一般是低于–70 ℃的超低溫)。通過長期繼代而保存細(xì)胞存在費時費力、成本昂貴,并且會出現(xiàn)植物細(xì)胞特性消失等缺點[5]。而細(xì)胞在超低溫的條件下,會停止胞內(nèi)的一系列代謝活動,并能夠保持細(xì)胞自身的特性,大大降低細(xì)胞特性消失的風(fēng)險。目前已有多種植物組織的器官和細(xì)胞培養(yǎng)物得到成功保存,例如新疆紫草細(xì)胞[6],玫瑰茄[7]、三分三細(xì)胞[8]等。

    植物細(xì)胞在冷凍保藏過程中會由于內(nèi)部或者外部水結(jié)成冰晶而造成細(xì)胞破裂和細(xì)胞活力降低,不同種類的植物細(xì)胞由于細(xì)胞組成結(jié)構(gòu)的不同,往往低溫保藏的處理方法也大有不同。以往均是采用細(xì)胞線粒體活性測定 (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)[9]或雙醋酸熒光素(Fluorescein diacetate,F(xiàn)DA)[10]的方法來間接反映細(xì)胞在冷凍保藏后的活性情況,也可以采用凍存后將細(xì)胞在固體培養(yǎng)基上復(fù)蘇培養(yǎng)[11]。一般植物細(xì)胞的生長周期都在3–4周,生長較慢的細(xì)胞則需要1–2個月,同時植物細(xì)胞復(fù)蘇過程緩慢,因此在低溫保藏方法的優(yōu)化過程中,單次處理考察要耗費幾個月甚至更長的時間,效率低。建立一種對處理過程中細(xì)胞存活率或者死亡率的快速檢測方法,對于低溫處理工藝條件的優(yōu)化非常關(guān)鍵。

    活細(xì)胞傳感儀(Viable cell mass monitor) 是利用電容法(Capacitance) 測量溶液中活細(xì)胞濃度。其主要原理是:在一定頻率的交變電場作用下,溶液中的離子發(fā)生遷移,而活細(xì)胞具有完整的絕緣性細(xì)胞膜,細(xì)胞中的離子受到束縛導(dǎo)致細(xì)胞膜極化,這使得細(xì)胞成為一個個微小的電容器,測量得到的電容值與溶液中的活細(xì)胞量存在良好的線性關(guān)系。其可以用于細(xì)菌[12]、霉菌[13]、酵母菌[14]、植物細(xì)胞[15]、動物細(xì)胞[16]培養(yǎng)過程中活細(xì)胞濃度的準(zhǔn)確測定,是在生物過程監(jiān)測分析中很有前途的工具。李蘭等[17]在PHA發(fā)酵優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)采用活細(xì)胞傳感儀在線采集的電容值比離線干重和值更能反映細(xì)胞的生長和活性。羅艷霞等[18]采用活細(xì)胞傳感儀測定的活細(xì)胞數(shù)與平板活菌計數(shù)法測定的菌體濃度也有非常好的線性關(guān)系,基于電容值計算出的比生長速率比基于細(xì)胞氧代謝速率和二氧化碳釋放速率計算出的比生長速率更可信。近年來,活細(xì)胞傳感儀也廣泛應(yīng)用于植物細(xì)胞的液態(tài)懸浮培養(yǎng)過程中[19-20]。王澤建等在紅豆杉細(xì)胞放大培養(yǎng)過程中,采用活細(xì)胞傳感儀在線監(jiān)測的細(xì)胞生物量與細(xì)胞干重在一定范圍內(nèi)也存在很好的線性關(guān)系[21]。在植物細(xì)胞紅花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的研究結(jié)果中也表明采用活細(xì)胞傳感儀能夠?qū)罴?xì)胞的濃度和細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行實時精確的監(jiān)控[22]。

    本文考察分析了利用活細(xì)胞傳感儀進(jìn)行羅漢果細(xì)胞凍存處理過程中活細(xì)胞電容值的快速測定,計算得到細(xì)胞存活率 (Viability),并結(jié)合TTC法測定的細(xì)胞線粒體活性 (Activity),對羅漢果細(xì)胞保藏工藝條件的預(yù)處理劑種類、預(yù)處理時間,以及冷凍保護(hù)劑的成分等方法進(jìn)行評價和優(yōu)化,建立了一種新的快速定量的羅漢果細(xì)胞超低溫冷凍保藏的工藝方法。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器和設(shè)備

    活細(xì)胞傳感儀(Biomass Monitor 220,Hamilton瑞士):四環(huán)式探頭,測定范圍為:0.2–150 pF/cm,測量精度:0.05–0.10g/L,超低溫冰箱 (Thermo Scientific),旋轉(zhuǎn)式搖床(上海智誠儀器公司),紫外-可見光分光光度計 (上海棱光),The EVOS?FL自動成像系統(tǒng) (Thermo Fisher)。

    1.2 培養(yǎng)基及細(xì)胞系

    羅漢果懸浮細(xì)胞系是通過羅漢果種胚誘導(dǎo)出胚性松散的愈傷組織,并在液體培養(yǎng)基中經(jīng)過分散、過濾培養(yǎng)得到。培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基添加6-芐氨基嘌呤 (6-BA) 1.0 mg/L,萘乙酸(NAA) 0.5 mg/L,蔗糖30.0 g/L,肌醇100.0 mg/L,聚乙烯吡咯烷酮2.0 g/L。

    1.3 方法

    1.3.1 羅漢果細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立

    將種子在無菌條件下進(jìn)行消毒處理后剝掉外部硬種殼,接入到含有激素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出胚性松散的愈傷組織,經(jīng)過不斷的繼代篩選,選取生長均一的愈傷組織細(xì)胞接種至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

    1.3.2 羅漢果懸浮細(xì)胞的超低溫保存方法

    預(yù)處理:取一定量處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,沉降后去除上清,加入等量的預(yù)處理劑,混勻后在110 r/min、25 ℃的條件下暗培養(yǎng)0–2 d,其目的在于誘導(dǎo)植物組織細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)性脫水,減少細(xì)胞內(nèi)自由水含量,防止細(xì)胞在冰凍過程中結(jié)冰,避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷及死亡。一般預(yù)處理劑為含有一定量濃度的滲透調(diào)節(jié)劑的糖溶液,例如蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇等[23-24]。

    冷凍保存:將預(yù)處理后的細(xì)胞進(jìn)行沉降處理,沉降后去除預(yù)處理劑,再加入等量的冷凍保護(hù)劑,在110 r/min、4 ℃的黑暗條件下孵育45 min。孵育后,先在–20 ℃冰箱內(nèi)放置40 min后,再放到–80 ℃進(jìn)行保存。

    解凍復(fù)蘇:將凍存后的細(xì)胞,置于39 ℃水浴鍋中解凍,直至懸液中沒有冰塊,此過程一般2–3 min為宜,時間太久冷凍保護(hù)劑會對細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒害作用。解凍后迅速將冷凍保護(hù)劑去掉,加入相應(yīng)預(yù)處理劑清洗2–3次,逐步降低細(xì)胞中的DMSO濃度[25]。

    1.3.3 羅漢果甜苷V的提取檢測

    對照品溶液的制備:精確稱取50 mg的對照品溶解至10 mL的容量瓶中,用流動相溶解成濃度為5 mg/mL的對照品原液,并分別稀釋成0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0和5.0 mg/mL后,0.22 μm濾膜過濾,濾液用高效液相色譜儀測定。以峰面積(mAU) 為縱坐標(biāo),以羅漢果甜苷V濃度(mg/mL) 為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到線性方程。

    供試品溶液的制備:取烘干后的細(xì)胞用碾缽將其碾成粉末狀,精密稱取5 g的干重細(xì)胞粉末置于錐形瓶中,以1∶10的固液比加入60%的乙醇超聲破碎提取40 min后,在90 ℃的微沸狀態(tài)下提取2 h。將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5 mL后,采用0.22 μm的濾膜過濾待用。

    羅漢果甜苷V的檢測:色譜柱:Unitary C18柱 (5 μm,100A,4.6 mm×250 mm);流動相:水-乙腈 (78:22);流速:l mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長為203 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

    1.4 過程參數(shù)測定

    1.4.1 活細(xì)胞保存率的測定

    將活細(xì)胞傳感儀的電極沒入羅漢果細(xì)胞懸液中,進(jìn)行全頻掃描,確定活細(xì)胞傳感儀的檢測頻率為473 kHz。在此頻率下取對數(shù)生長期的細(xì)胞,離線測定細(xì)胞干重與電容值,發(fā)現(xiàn)在0.67–10.25 g/L細(xì)胞干重范圍內(nèi),電容值與細(xì)胞干重具有良好的線性關(guān)系,此時活細(xì)胞電容值的測定范圍在7.0–160 pF/cm,所以采用電容值可以更科學(xué)、更方便地定量表征培養(yǎng)體系中活細(xì)胞濃度。

    在此頻率下分別離線測定一定量預(yù)處理后的細(xì)胞懸液、解凍復(fù)蘇后的細(xì)胞懸液,以及經(jīng)過超聲、煮沸處理后的細(xì)胞懸液,混勻后進(jìn)行活細(xì)胞電容值的測定,分別記為Cap1、Cap2、Cap3?;罴?xì)胞保存率 (%)=(Cap2–Cap3)/ (Cap1–Cap3)×100。

    圖1 離線測定干重與活細(xì)胞電容值的關(guān)系

    1.4.2 細(xì)胞線粒體活性檢測

    懸浮細(xì)胞經(jīng)8 μm濾膜抽濾后,取100 mg新鮮細(xì)胞,分別加入2.5 mL 0.4%的2,3,4-氯化三苯基四氮唑(TTC) 溶液和2.5 mL 0.05 mol/L的 Na2HPO4-NaH2PO4的磷酸緩沖液(pH 7.5),混勻后25 ℃暗處理18 h。暗培養(yǎng)后離心去除上清液,細(xì)胞用蒸餾水洗滌3次,加入4 mL甲醇,置于60 ℃水浴50 min,期間振動搖晃細(xì)胞,使底部細(xì)胞充分接觸甲醇,至細(xì)胞脫至無色。室溫靜置后,4 000 r/min離心5 min后取上清液,在485 nm下測定光密度 (485),得到細(xì)胞活力[26]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 活細(xì)胞電容值與細(xì)胞濃度的線性關(guān)系

    取對數(shù)生長期不同濃度的細(xì)胞分別將細(xì)胞稀釋1、2、4、6、10、20倍)測定其相應(yīng)的電容值,結(jié)果顯示在10–100 pF/cm測量值范圍內(nèi)與細(xì)胞濃度有良好的線性關(guān)系 (圖2),其中對照空白 (無植物細(xì)胞) 或?qū)⒓?xì)胞100 ℃高溫殺死后,培養(yǎng)液中只有7 pF/cm電容值,因此,在測定過程中,對于活細(xì)胞濃度測定值的基礎(chǔ)上進(jìn)行對應(yīng)空白培養(yǎng)基質(zhì)電容值的校正后,得到的較正活細(xì)胞電容值能夠很好地表征活細(xì)胞濃度。

    圖2 細(xì)胞相對濃度與活細(xì)胞電容值的線性關(guān)系

    2.2 不同冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞冷凍保存的影響

    常被用作冷凍保護(hù)劑的有甘油、二甲基亞砜 (DMSO)、蔗糖、山梨醇、聚乙二醇 (PEG) 等。其中,甘油和DMSO為滲透性冷凍保護(hù)劑,蔗糖和山梨醇是非滲透性冷凍保護(hù)劑,一些研究提出將滲透性和非滲透性冷凍保護(hù)劑組合使用的效果要優(yōu)于采用一種冷凍保護(hù)劑[27]。但不同的植物細(xì)胞在冷凍保存方法上有非常大的差異。為此,將不同類型冷凍保護(hù)劑對羅漢果組織細(xì)胞的凍存條件進(jìn)行優(yōu)化。向培養(yǎng)基中添加不同濃度的DMSO (5%(/)、10%)、蔗糖(5%、10%)、山梨醇(5%、10%) 考察冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞凍存存活率的影響。將細(xì)胞用含有0.35 mol/L蔗糖的液體培養(yǎng)基預(yù)處理18 h后,進(jìn)行低溫冷凍處理,復(fù)蘇后進(jìn)行細(xì)胞活性的測定,結(jié)果 見表1。

    表1 不同冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞凍存的影響

    結(jié)果表明:不論是活細(xì)胞電容值還是細(xì)胞線粒體活性,加入冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞活性及存活率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不添加冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞。說明冷凍保護(hù)劑在細(xì)胞凍存過程中起到了重要作用,大大提高了細(xì)胞的存活率。活細(xì)胞電容值 (Cap) 和TTC活性值也有較好的對應(yīng)關(guān)系。因此,采用活細(xì)胞電容值可以用來較好地表征細(xì)胞在冷凍保藏后的存活率情況,從而快速地篩選出對細(xì)胞較好的冷凍保護(hù)劑組分及濃度。

    將DMSO、蔗糖、山梨醇各個水平下活細(xì)胞電容值和TTC值進(jìn)行統(tǒng)計分析,各水平冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞低溫保藏后存活率及活性的影響結(jié)果見圖3。從圖3結(jié)果可以看出,10%含量的DMSO對細(xì)胞低溫保藏后的效果要優(yōu)于5% DMSO。而對于山梨醇和蔗糖,不論是細(xì)胞存活率還是線粒體活力,10%的含量對于細(xì)胞低溫保藏的效果都是最好的,且10%的蔗糖對于細(xì)胞保存的效果要優(yōu)于10%的山梨醇。因此確定細(xì)胞低溫保藏較好的冷凍保護(hù)劑成分為:細(xì)胞生長培養(yǎng)基+10% DMSO+10%蔗糖。與經(jīng)過預(yù)處理但是不加冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞相比,此條件下細(xì)胞的活力保存率和線粒體活性(TTC值) 分別提高了224.43%和372.16%。

    2.3 不同預(yù)處理劑對細(xì)胞冷凍保存的影響

    預(yù)處理能降低植物細(xì)胞內(nèi)的含水量,減輕凍存過程中冰晶體形成及狀態(tài)對膜系統(tǒng)的損傷。預(yù)處理劑的種類以及預(yù)處理劑的濃度不同,對于細(xì)胞低溫保藏有很大影響。預(yù)處理劑濃度過高時,雖然脫水效果比較好,但有可能會對細(xì)胞活性產(chǎn)生不可逆的影響,對細(xì)胞結(jié)構(gòu)及內(nèi)部組織造成一定的損傷;但細(xì)胞若不進(jìn)行脫水預(yù)處理,含水量太高則會在冷凍過程中形成大量冰晶刺破細(xì)胞。在前面實驗的基礎(chǔ)上,本實驗選擇蔗糖0.20、0.35、0.50 mol/L以及海藻糖0.20、0.35、0.50 mol/L進(jìn)行考察,對照為不進(jìn)行預(yù)處理、直接進(jìn)行凍存的細(xì)胞。

    在一定量的預(yù)處理劑進(jìn)行處理時 (蔗糖0.20 mol/L,海藻糖0.20、0.35 mol/L),可以提高預(yù)處理后細(xì)胞的存活率,但是隨著蔗糖和海藻糖的濃度增加時 (0.50 mol/L),細(xì)胞的存活率和細(xì)胞活力均出現(xiàn)顯著降低。在預(yù)處理濃度為0.20 mol/L蔗糖時,細(xì)胞的凍存活力保持效果最好。與對照相比,細(xì)胞的活力保存率和線粒體活性(TTC值) 均有大幅度提高,活力保存率和細(xì)胞活性分別提高了29.18.%、36.72%,因此,選擇蔗糖0.20 mol/L作為預(yù)處理細(xì)胞的最佳條件。

    2.4 不同預(yù)處理時間對細(xì)胞冷凍保存的影響

    預(yù)處理時間對細(xì)胞冷凍保藏后活性的影響與預(yù)處理劑的濃度原理相似,若細(xì)胞在具有一定滲透壓的環(huán)境下處理時間過長時,有可能造成細(xì)胞的過度失水,這樣就造成細(xì)胞在預(yù)處理階段的活性大大降低,從而影響細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的活性。在前面實驗的基礎(chǔ)上,以蔗糖0.20 mol/L為預(yù)處理劑,凍存培養(yǎng)基為:液體培養(yǎng)基+10% DMSO+10%蔗糖,對預(yù)處理時間0、1、2、5、9、22、46 h進(jìn)行考察。

    以細(xì)胞生長培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基) +10% DMSO+10%蔗糖作為冷凍保護(hù)劑,隨著預(yù)處理時間的增加,細(xì)胞的存活率和細(xì)胞活力出現(xiàn)鐘形變化曲線,細(xì)胞經(jīng)過蔗糖0.2 mol/L預(yù)處理劑預(yù)處理9 h后進(jìn)行超低溫保藏,細(xì)胞保存效果最好,與對照 (預(yù)處理0 h) 相比,細(xì)胞的活力保存率和線粒體活性(TTC值) 均有大幅度的提高 (圖5)。

    圖5 預(yù)處理時間對細(xì)胞存活率和線粒體活力的影響

    2.5 細(xì)胞復(fù)蘇后的驗證試驗

    為了考察基于活細(xì)胞以及細(xì)胞線粒體活性作為評價細(xì)胞保存效果的可靠性,在進(jìn)行預(yù)處理時間考察的同時,選擇預(yù)處理0、2、9、22、46 h對凍存后的細(xì)胞進(jìn)行解凍復(fù)蘇。將解凍復(fù)蘇后的細(xì)胞重新接種到半固體生長培養(yǎng)基中,在25 ℃的條件下暗培養(yǎng)21 d后,統(tǒng)計相對正常細(xì)胞的細(xì)胞存活率,以公式進(jìn)行計算:細(xì)胞存活率=凍/未凍,凍:經(jīng)過凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后的鮮重,未凍:未經(jīng)過凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后的鮮重。

    從復(fù)蘇結(jié)果 (圖6) 可以看出,預(yù)處理9 h后細(xì)胞計算得出的存活率為33.67%,與采用活細(xì)胞傳感儀得出的結(jié)論相同。其中預(yù)處理22 h和46 h的細(xì)胞存活率相對較低,從復(fù)蘇過程中細(xì)胞生長狀態(tài)來看,可能是因為預(yù)處理時間過長的細(xì)胞脫水比較嚴(yán)重,細(xì)胞凍存過程中滲入到胞內(nèi)的DMSO不易從細(xì)胞中被洗脫出來,從而對細(xì)胞造成了一定的毒害作用,導(dǎo)致細(xì)胞的存活率比較低。從圖7顯微鏡圖上來看,經(jīng)過凍存和沒有經(jīng)過凍存的細(xì)胞形態(tài)相同,表明此條件凍存效果最好。

    圖6 不同預(yù)處理時間復(fù)蘇后細(xì)胞存活率

    圖7 低溫保藏羅漢果細(xì)胞復(fù)蘇后生長圖

    2.6 細(xì)胞凍存后羅漢果甜苷V合成能力的驗證

    根據(jù)方法中所述的羅漢果甜苷V的檢測方法,配置0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mg/mL的7種不同濃度的羅漢果甜苷V對照品溶液,根據(jù)所出峰面積以及相應(yīng)的甜苷V濃度繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用此檢測方法得到的峰面積與甜苷V的濃度具有較好的線性關(guān)系,=248.28+ 16.52。將凍存后的細(xì)胞在B5培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)蘇,繼代2次后,在第22天收獲細(xì)胞進(jìn)行甜苷V的提取和高效液相色譜檢測 (圖9)。結(jié)果顯示凍存后的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后,羅漢果甜苷V的合成能力可達(dá)到2.19 mg/g干重細(xì)胞,與凍存之前細(xì)胞合成羅漢果甜苷V的能力相當(dāng)。實驗結(jié)果表明,經(jīng)凍存后的細(xì)胞很好地保留了其合成甜苷V的特性,該凍存存活率快速測定方法能夠很好地用于植物細(xì)胞的低溫保藏過程評價。

    圖8 羅漢果甜苷V對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

    3 討論

    本文通過采用活細(xì)胞傳感儀建立了一種基于電容測定的羅漢果細(xì)胞超低溫冷凍保藏及存活率的快速評價方法。以往細(xì)胞凍存后的評價方法主要采用的是測定細(xì)胞線粒體活力 (TTC) 或FDA方法來間接反映凍存方法對細(xì)胞凍存的效果,或者采用凍存后細(xì)胞復(fù)蘇的方法。但是這兩種方法都存在一定的缺陷,采用FDA法并不能完全表征細(xì)胞凍存后的存活率[28];TTC法則是TTC溶液進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,與細(xì)胞線粒體上的酶發(fā)生反應(yīng)而顯色,通過顏色的深淺反應(yīng)細(xì)胞生活力強弱,與細(xì)胞呼吸作用直接相關(guān),呼吸作用容易受環(huán)境溫度、空氣、水分等的影響,造成結(jié)果誤差較大。由于植物細(xì)胞具有生長周期長的特點,若采用細(xì)胞復(fù)蘇的方法則會使得方法的建立需要較長周期,效率低。卞福花等曾采用中性紅染色細(xì)胞統(tǒng)計存活率的方式優(yōu)化細(xì)胞凍存的方法,但是由于植物細(xì)胞具有聚團(tuán)生長的特性,使得細(xì)胞在計數(shù)時存在困難,需要對大量的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計,工作量大,易于產(chǎn)生誤差[29]。本文首次采用活細(xì)胞傳感儀建立了量化的評價體系,對細(xì)胞凍存的方法進(jìn)行了優(yōu)化,快速地建立了適于羅漢果細(xì)胞冷凍保藏的方法。

    本文結(jié)果表明向生長培養(yǎng)基中添加10%的蔗糖與10%的DMSO時,細(xì)胞經(jīng)過凍存后的活率比較高,為較好的冷凍保護(hù)劑。在一定的預(yù)處理劑濃度 (蔗糖0.20 mol/L) 和預(yù)處理時間 (9 h) 下,細(xì)胞的存活率相對于不進(jìn)行預(yù)處理細(xì)胞有大大提高,但是隨著預(yù)處理劑濃度的升高以及預(yù)處理時間的延長,細(xì)胞的存活率和細(xì)胞活力均有大幅度的下降,說明一定的脫水處理對于細(xì)胞的保存有利,但是過度脫水的話則會對細(xì)胞造成損傷,降低凍存后的細(xì)胞存活率。

    將預(yù)處理不同時間的細(xì)胞經(jīng)過凍存復(fù)蘇后,測定出來的細(xì)胞存活率與活細(xì)胞電容值測定的存活率相近,表明了此種評價方法的可靠性。采用優(yōu)化后的條件對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后,細(xì)胞存活率可以達(dá)到70%,且顯微鏡觀察其形態(tài)與未經(jīng)過凍存的細(xì)胞形態(tài)幾乎相同,其有效代謝物甜苷V的合成特性也得以繼續(xù)保存,說明此方法對細(xì)胞的保存效果較好,能夠較好地保持凍存后細(xì)胞的特性。

    [1] Zeng XL. The research progress on a specialty plantin Guangxi. Guangxi Med J, 2009, 31(8): 1182–1186 (in Chinese). 曾祥林. 廣西特產(chǎn)植物羅漢果研究進(jìn)展. 廣西醫(yī)學(xué), 2009, 31(8): 1182–1186.

    [2] Liu JH, Zhou H, Wu QW, et al. The influence of different hormone concentration oncallus induction and growth. Anhui Agric Sci Bull, 2014, 20(7): 29–35 (in Chinese). 劉健暉, 周歡, 伍琴文, 等. 不同激素濃度對羅漢果愈傷組織誘導(dǎo)的影響. 安徽農(nóng)學(xué)通報, 2014, 20(7): 29–35.

    [3] Wu QY, Li BL, Li JY. Micro-stem tip tissue culture and rapid propagation ofswingle. Seed, 2013, 32(4): 116–117, 121 (in Chinese). 吳群英, 李伯林, 李景云. 羅漢果微莖尖組織培養(yǎng)與快速繁殖. 種子, 2013, 32(4): 116–117, 121.

    [4] Wu YF, Li Y. Practical Medical Cell Culture Technique. Guangzhou: Zhongshan University Press, 2010 (in Chinese). 吳燕峰, 黎陽. 實用醫(yī)學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù). 廣州: 中山大學(xué)出版社, 2010.

    [5] Deus-Neumann B, Zenk MH. Instability of indole alkaloid production incell suspension cultures. Planta Med, 1984, 50(5): 427–431.

    [6] Li GF, Ye HC, Dong JW, et al. Cryopreservation of calli of. Acta Bot Sin, 1992, 34(12): 962–964 (in Chinese). 李國鳳, 葉和春, 董教望, 等. 新疆紫草愈傷組織超低溫保存. 植物學(xué)報, 1992, 34(12): 962–964.

    [7] Chen THH, Kartha KK, Leung NL, et al. Cryopreservation of alkaloid-producing cell cultures of periwinkle (). Plant Physiol, 1984, 75(3): 726–731.

    [8] Zheng GZ, He JB, Wang SL. Cryopreservation of calli and their suspension culture cells of. Acta Bot Sin, 1983, 25(6): 512–518 (in Chinese). 鄭光植, 何靜波, 王世林. 三分三愈傷組織及其懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的冰凍貯藏. 植物學(xué)報, 1983, 25(6): 512–518.

    [9] Verleysen H, Samyn G, Van Bockstaele E, et al. Evaluation of analytical techniques to predict viability after cryopreservation. Plant Cell Tissue Organ Cult, 2004, 77(1): 11–21.

    [10] Widholm JM. The use of fluorescein diacetate and phenosafranine for determining viability of cultured plant cells. Stain Technol, 1972, 47(4): 189–194.

    [11] ?krlep K, Bergant M, De Winter GM, et al. Cryopreservation of cell suspension cultures of Taxus x media and. Biol Plant, 2008, 52(2): 329–333.

    [12] Hoffmann F, Schmidt M, Rinas U. Simple technique for simultaneous on-line estimation of biomass and acetate from base consumption and conductivity measurements in high-cell density cultures of. Biotechnol Bioeng, 2000, 70(3): 358–361.

    [13] Krairak S, Yamamura K, Nakajima M, et al. On-line monitoring of fungal cell concentration by dielectric spectroscopy. J Biotechnol, 1999, 69(2/3): 115–123.

    [14] Austin GD, Watson RWJ, D' Amore T. Studies of on-line viable yeast biomass with a capacitance biomass monitor. Biotechnol Bioeng, 1994, 43(4): 337.

    [15] Markx GH, Hoopen HT, Meijer JJ, et al. Dielectric spectroscopy as a novel and convenient tool for the study of the shear sensitivity of plant cells in suspension culture. J Biotechnol, 1991, 19(2/3): 145–157.

    [16] Cannizzaro C, Gügerli R, Marison I, et al. On-line biomass monitoring of CHO perfusion culture with scanning dielectric spectroscopy. Biotechnol Bioeng, 2003, 84(5): 597–610.

    [17] Li L, Wang ZJ, Chen XJ, et al. Optimization of polyhydroxyalkanoates fermentations with on-line capacitance measurement. Bioresource Technol, 2014, 156(2): 216–221.

    [18] Luo YX, Huang MZ, Guo YX, et al. The application of viable cell mass monitoring incultivation. Sci Technol Food Ind, 2012, 33(21): 152–155, 159 (in Chinese). 羅艷霞, 黃明志, 郭元昕, 等. 活細(xì)胞傳感儀在嗜酸乳酸桿菌培養(yǎng)過程中的應(yīng)用. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(21): 152–155, 159.

    [19] Nosov AM. Application of cell technologies for production of plant-derived bioactive substances of plant origin. Appl Biochem Microbiol, 2012, 48(7): 609–624.

    [20] Huang TK, Mcdonald KA. Bioreactor engineering for recombinant protein production in plant cell suspension cultures. Biochem Eng J, 2009, 45(3): 168–184.

    [21] Wang ZJ, Zhang W, Zhang JW, et al. Optimization of a broth conductivity controlling strategy directed by an online viable biomass sensor for enhancingcell growth rate and Taxol productivity. Rsc Adv, 2016, 6(47): 40631–40640.

    [22] Liu Y, Wang ZJ, Li L, et al. On-line monitoring of the aggregate size distribution of. cells with multi-frequency capacitance measurements. Rsc Adv, 2016, 6(92):89764–89769.

    [23] Ishikawa K, Harata K, Mii M, et al. Cryopreservation of zygotic embryos of a Japanese terrestrial orchid () by vitrification. Plant Cell Rep, 1997, 16(11): 754–757.

    [24] Towill LE, Jarret RL. Cryopreservation of sweet potato ([L.] Lam.) shoot tips by vitrification. Plant Cell Rep, 1992, 11(4): 175–178.

    [25] Shi R, Wang F, Wang J, et al. Research progress on cryopreservation technology by vitrification. Northern Horticult, 2011, (24): 231–235 (in Chinese). 石茹, 王芳, 王艦, 等. 玻璃化法超低溫保存技術(shù)及其研究進(jìn)展. 北方園藝, 2011, (24): 231–235.

    [26] Towill LE, Mazur P. Studies on the reduction of 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride as a viability assay for plant tissue cultures. Can J Bot, 1975, 53(11): 1097–1102.

    [27] Chen HL. Cell culture and cryopreservation of[D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2012 (in Chinese). 陳慧麗. 厚樸細(xì)胞培養(yǎng)與超低溫保存的研究[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2012.

    [28] Kim SI, Choi HK, Son JS, et al. Cryopreservation ofsuspension cell cultures. Cryo Lett, 2001, 22(1): 43–50.

    [29] Bian FH, Gong XQ, You CR, et al. Cryopreservation ofMill. callus. Chin J Biotech, 2008, 24(3): 504–508 (in Chinese). 卞福花, 龔雪琴, 由翠榮, 等. 仙客來愈傷組織的超低溫保存. 生物工程學(xué)報, 2008, 24(3): 504–508.

    (本文責(zé)編 郝麗芳)

    Rapid cryopreservation forcells based on cells’ capacitance detection

    Jiarui Li1, Zejian Wang1, Meijin Guo1,2, Yuanxin Guo1, Shuai Huang3, Yunfei Song3,Zhen Sun1, Yangyang Sun1, Fanjing Kong1, and Yingping Zhuang1,2

    1 State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China 2 Shanghai Biological Manufacturing Technology Innovation Center, Shanghai 200237, China 3 Guilin Layn Biotechnology Company, Guilin 541199, Guangxi, China

    A rapid quantitative evaluation method forcells was successfully developed based on plant cells’ capacitance value detected by a viable cell mass monitor and the cryopreservation ofsuspension cells was optimized. The survival rate ofcells was quantitatively measured by viable cell mass monitor and 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride (TTC). An optimum cryoprotectant recipe is that the growth medium contained 10% sucrose and 10% DMSO. The experimental results also showed higher cell survival rates and cell viabilities were achieved when suspension cells were treated with pretreatment of 0.2 mol/L sucrose. With the increase of concentration of sucrose, however, the cell survival rate was decreased. And the cell survival rate represented a bell shape with the increase of pretreatment time. The highest cell survival rate and cell viability were obtained with the 9 h’ s pretreatment. In addition, there was a good correlation between the cell survival rate measured by cell recovery test and that measured by viable cell mass monitor, while there were no significant differences in the cell morphology and the ability of mogrosides V production bycells cultured in suspension after cryopreservation. Therefore, the evaluation method developed based on the viable cell mass monitor has good feasibility and reliability.

    cells, viable cell mass monitor, cryopreservation, cryoprotectant, cells’ capacitance

    December 22, 2016; Accepted:March 20, 2017

    Meijin Guo. Tel/Fax: +86-21-64251131; E-mail: guo_mj@ecust.edu.cn

    10.13345/j.cjb.160490

    國家高技術(shù)研究與發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2014AA021705) 資助。

    2017-04-12

    http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170412.1054.002.html

    Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2014AA021705).

    青青草视频在线视频观看| 色播在线永久视频| 手机成人av网站| 亚洲成人免费电影在线观看 | 欧美精品亚洲一区二区| 老司机在亚洲福利影院| 国产精品久久久久久精品电影小说| 手机成人av网站| 久久精品久久久久久久性| 免费看av在线观看网站| 亚洲欧美激情在线| 老司机亚洲免费影院| 在线 av 中文字幕| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 黄片播放在线免费| 91老司机精品| 国产精品一区二区免费欧美 | 国精品久久久久久国模美| 大片免费播放器 马上看| 免费看av在线观看网站| 大香蕉久久网| 精品熟女少妇八av免费久了| 精品高清国产在线一区| 午夜免费成人在线视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久这里只有精品19| 国精品久久久久久国模美| 欧美成人精品欧美一级黄| 尾随美女入室| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 午夜免费鲁丝| 老熟女久久久| 看十八女毛片水多多多| 亚洲国产av新网站| 中文字幕高清在线视频| 十八禁高潮呻吟视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲av综合色区一区| 无遮挡黄片免费观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久人人97超碰香蕉20202| 午夜久久久在线观看| 国产99久久九九免费精品| 亚洲三区欧美一区| 久久精品国产a三级三级三级| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 啦啦啦 在线观看视频| 国产成人精品久久久久久| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 国产在线视频一区二区| 国产黄色免费在线视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| av国产久精品久网站免费入址| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 一区福利在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 性少妇av在线| 9色porny在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 免费看av在线观看网站| 丝袜喷水一区| 午夜福利乱码中文字幕| 国产精品九九99| 母亲3免费完整高清在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 2018国产大陆天天弄谢| 日日爽夜夜爽网站| 下体分泌物呈黄色| 国产在线一区二区三区精| 日韩电影二区| 黄色一级大片看看| 国产精品 国内视频| 少妇人妻 视频| 免费av中文字幕在线| 美国免费a级毛片| 精品人妻1区二区| 黄色一级大片看看| 制服诱惑二区| 国产男女内射视频| 黄色怎么调成土黄色| netflix在线观看网站| 免费日韩欧美在线观看| 久久久久久人人人人人| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲第一av免费看| 久久久欧美国产精品| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 香蕉国产在线看| 国产成人啪精品午夜网站| 午夜91福利影院| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 91字幕亚洲| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产一区二区三区av在线| 大片电影免费在线观看免费| 高清欧美精品videossex| 国产亚洲精品第一综合不卡| 成人亚洲精品一区在线观看| 成人手机av| 国产成人av激情在线播放| 久久久久久久大尺度免费视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 18在线观看网站| 精品国产一区二区久久| 国产男女内射视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| a 毛片基地| 亚洲精品一区蜜桃| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 色94色欧美一区二区| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲av男天堂| 一区二区三区四区激情视频| 欧美日韩av久久| 天天影视国产精品| 天天添夜夜摸| 操出白浆在线播放| 黑人欧美特级aaaaaa片| 又黄又粗又硬又大视频| 国产成人欧美| 亚洲视频免费观看视频| 久久中文字幕一级| av福利片在线| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美日韩av久久| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美97在线视频| 久久精品人人爽人人爽视色| a级毛片在线看网站| 国产97色在线日韩免费| 久久午夜综合久久蜜桃| 咕卡用的链子| 蜜桃国产av成人99| h视频一区二区三区| 老司机影院毛片| 成人手机av| 国产精品免费大片| 脱女人内裤的视频| 久久人人爽人人片av| 久久亚洲精品不卡| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲图色成人| 国产精品av久久久久免费| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲精品国产av成人精品| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 一二三四社区在线视频社区8| 久久精品成人免费网站| 国产成人av教育| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲欧美一区二区三区国产| av欧美777| 国产欧美亚洲国产| 成人黄色视频免费在线看| 搡老乐熟女国产| 在线 av 中文字幕| 国产精品久久久av美女十八| 成在线人永久免费视频| 日韩伦理黄色片| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 嫩草影视91久久| 国产一卡二卡三卡精品| 日本a在线网址| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日韩视频在线欧美| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产一区二区三区av在线| 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产免费又黄又爽又色| 黄色视频不卡| 国产精品国产三级专区第一集| 久久久国产一区二区| 亚洲成人免费电影在线观看 | av福利片在线| 伦理电影免费视频| 精品福利观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产av精品麻豆| 人人妻人人澡人人看| 在线观看国产h片| 色婷婷久久久亚洲欧美| 欧美av亚洲av综合av国产av| 免费观看人在逋| 国产成人免费观看mmmm| 手机成人av网站| 久久av网站| 亚洲五月婷婷丁香| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产主播在线观看一区二区 | 我要看黄色一级片免费的| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产成人一区二区在线| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲欧美色中文字幕在线| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 欧美日韩视频精品一区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 一区二区三区乱码不卡18| 成年av动漫网址| 国产三级黄色录像| 又大又爽又粗| 国产精品三级大全| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 成人手机av| 中文字幕精品免费在线观看视频| 在线天堂中文资源库| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 午夜两性在线视频| 亚洲七黄色美女视频| 日本av手机在线免费观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产精品99久久99久久久不卡| 女性生殖器流出的白浆| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 精品人妻1区二区| 只有这里有精品99| 下体分泌物呈黄色| 性色av乱码一区二区三区2| 日本av手机在线免费观看| 久久狼人影院| 各种免费的搞黄视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 美女大奶头黄色视频| 精品高清国产在线一区| 国产一区二区三区综合在线观看| av天堂久久9| 国产成人系列免费观看| 免费观看a级毛片全部| a级毛片黄视频| 看十八女毛片水多多多| 久久综合国产亚洲精品| av视频免费观看在线观看| 操美女的视频在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲av日韩在线播放| 人人澡人人妻人| 久久精品久久久久久久性| 精品久久久精品久久久| 国产在线观看jvid| 亚洲九九香蕉| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲,欧美精品.| 七月丁香在线播放| 欧美乱码精品一区二区三区| av欧美777| 在线观看免费日韩欧美大片| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产爽快片一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 黄频高清免费视频| 午夜激情久久久久久久| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲,欧美精品.| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产成人免费无遮挡视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 黄频高清免费视频| e午夜精品久久久久久久| 欧美性长视频在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 香蕉国产在线看| 91精品伊人久久大香线蕉| 中文字幕亚洲精品专区| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 狂野欧美激情性xxxx| 成年人午夜在线观看视频| 国产主播在线观看一区二区 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产精品国产av在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久久久久久精品精品| 国产在线一区二区三区精| 最近中文字幕2019免费版| 婷婷丁香在线五月| 日本欧美国产在线视频| 成人午夜精彩视频在线观看| bbb黄色大片| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲成人国产一区在线观看 | 久久人人97超碰香蕉20202| 天天操日日干夜夜撸| 精品欧美一区二区三区在线| 日本色播在线视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 天天影视国产精品| a级毛片在线看网站| 国产成人a∨麻豆精品| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久人妻熟女aⅴ| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 精品国产国语对白av| 青春草亚洲视频在线观看| 精品国产国语对白av| 亚洲精品中文字幕在线视频| 波野结衣二区三区在线| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲专区国产一区二区| 九草在线视频观看| 精品久久蜜臀av无| 久久精品久久久久久久性| 十八禁网站网址无遮挡| 免费不卡黄色视频| 免费日韩欧美在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美成狂野欧美在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产真人三级小视频在线观看| 只有这里有精品99| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲国产精品999| 极品人妻少妇av视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲少妇的诱惑av| 女警被强在线播放| 18禁观看日本| 操出白浆在线播放| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲av国产av综合av卡| 欧美国产精品一级二级三级| 国产高清视频在线播放一区 | 国产亚洲av高清不卡| 国产欧美日韩精品亚洲av| 老司机午夜十八禁免费视频| 九色亚洲精品在线播放| 五月开心婷婷网| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲精品在线美女| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 欧美精品av麻豆av| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲av国产av综合av卡| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 免费在线观看完整版高清| 爱豆传媒免费全集在线观看| 超碰97精品在线观看| 男女免费视频国产| 亚洲色图综合在线观看| 日韩视频在线欧美| 精品熟女少妇八av免费久了| 欧美精品亚洲一区二区| 国产男女超爽视频在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品久久久av美女十八| 最黄视频免费看| 久热爱精品视频在线9| 午夜福利免费观看在线| 中国国产av一级| 午夜影院在线不卡| 欧美日韩一级在线毛片| 国产男人的电影天堂91| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 女人精品久久久久毛片| 亚洲精品第二区| 男女之事视频高清在线观看 | 97精品久久久久久久久久精品| 午夜福利在线免费观看网站| 免费av中文字幕在线| 婷婷成人精品国产| 国产伦人伦偷精品视频| 在线av久久热| 一级黄片播放器| 午夜福利免费观看在线| 夫妻午夜视频| 丝瓜视频免费看黄片| 青草久久国产| 一区二区三区乱码不卡18| 精品人妻熟女毛片av久久网站| xxx大片免费视频| 中文字幕制服av| 亚洲国产欧美一区二区综合| 人妻人人澡人人爽人人| 在线精品无人区一区二区三| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 秋霞在线观看毛片| 男女之事视频高清在线观看 | 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲欧美清纯卡通| 啦啦啦 在线观看视频| 成人影院久久| 国产xxxxx性猛交| 午夜老司机福利片| 亚洲专区国产一区二区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲综合色网址| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 一级毛片 在线播放| 日本欧美视频一区| 久久久久精品国产欧美久久久 | 国产成人精品在线电影| 欧美性长视频在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 飞空精品影院首页| 七月丁香在线播放| 日韩精品免费视频一区二区三区| 两个人看的免费小视频| 黄色视频不卡| 高清欧美精品videossex| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久人人爽人人片av| 亚洲熟女精品中文字幕| av线在线观看网站| 大片电影免费在线观看免费| 无遮挡黄片免费观看| 午夜老司机福利片| 婷婷色综合大香蕉| av国产久精品久网站免费入址| 欧美av亚洲av综合av国产av| 婷婷色综合大香蕉| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产熟女欧美一区二区| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲国产精品999| 国产成人啪精品午夜网站| 一个人免费看片子| 日本一区二区免费在线视频| 热re99久久精品国产66热6| 久久久亚洲精品成人影院| 久久女婷五月综合色啪小说| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲精品一区蜜桃| bbb黄色大片| 欧美日韩亚洲高清精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 又黄又粗又硬又大视频| 免费看十八禁软件| 18禁观看日本| 精品久久蜜臀av无| 亚洲精品一二三| 丁香六月欧美| 啦啦啦 在线观看视频| 精品一区二区三区av网在线观看 | 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲免费av在线视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 岛国毛片在线播放| 精品第一国产精品| 自线自在国产av| 久久精品成人免费网站| 老司机在亚洲福利影院| 大型av网站在线播放| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 夫妻性生交免费视频一级片| 真人做人爱边吃奶动态| av有码第一页| 亚洲,一卡二卡三卡| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 激情五月婷婷亚洲| 赤兔流量卡办理| 欧美国产精品一级二级三级| 在线观看免费视频网站a站| 婷婷丁香在线五月| 午夜影院在线不卡| 久久久久视频综合| 日本欧美视频一区| 成人三级做爰电影| av视频免费观看在线观看| 久久青草综合色| 久久久国产精品麻豆| 国产精品熟女久久久久浪| 一区二区三区精品91| 好男人电影高清在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品二区激情视频| 久久精品国产综合久久久| 天天操日日干夜夜撸| 婷婷成人精品国产| 精品久久蜜臀av无| 99re6热这里在线精品视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 伊人亚洲综合成人网| 飞空精品影院首页| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 男女边摸边吃奶| 好男人电影高清在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久久久精品人妻al黑| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日本色播在线视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久国产精品大桥未久av| 欧美日韩av久久| 欧美日韩福利视频一区二区| 美女午夜性视频免费| 精品少妇久久久久久888优播| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 中文字幕av电影在线播放| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 免费看av在线观看网站| xxx大片免费视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 99国产精品一区二区三区| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 黄片播放在线免费| 国产成人精品久久久久久| 国产一级毛片在线| 2018国产大陆天天弄谢| 女人久久www免费人成看片| 午夜激情av网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 人妻 亚洲 视频| 大片免费播放器 马上看| 亚洲精品自拍成人| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产精品一区二区免费欧美 | 一区在线观看完整版| 免费少妇av软件| 精品少妇久久久久久888优播| 在线看a的网站| 中文字幕制服av| √禁漫天堂资源中文www| 久久久国产精品麻豆| 97精品久久久久久久久久精品| 性少妇av在线| 人妻一区二区av| 热99国产精品久久久久久7| 日本午夜av视频| 在线观看免费视频网站a站| 国产成人a∨麻豆精品| 久久精品成人免费网站| 丁香六月天网| 黄片播放在线免费| 大型av网站在线播放| 久久人人97超碰香蕉20202| www.熟女人妻精品国产| 亚洲av电影在线进入| 五月天丁香电影| 又大又爽又粗| 久久久久久人人人人人| 首页视频小说图片口味搜索 | 婷婷丁香在线五月| 赤兔流量卡办理| 日日爽夜夜爽网站| 免费观看人在逋| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久99精品国语久久久| 午夜精品国产一区二区电影| 成人国产av品久久久| 午夜福利在线免费观看网站| 日韩免费高清中文字幕av| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久精品久久久久久久性| 国产国语露脸激情在线看| 少妇精品久久久久久久| 午夜久久久在线观看| 久久av网站| 真人做人爱边吃奶动态| 国产有黄有色有爽视频| 热99国产精品久久久久久7| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲成人免费电影在线观看 | 一级黄色大片毛片| 国产一区二区三区av在线| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 最新在线观看一区二区三区 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产免费又黄又爽又色| 久久热在线av| 老司机影院毛片| a 毛片基地| 国产熟女午夜一区二区三区| 新久久久久国产一级毛片| 国产精品三级大全| 一二三四社区在线视频社区8| 午夜91福利影院| 电影成人av| 婷婷成人精品国产| 日韩大片免费观看网站| 国产午夜精品一二区理论片| 黄色毛片三级朝国网站| 大话2 男鬼变身卡|