番茄紅素對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

趙孟雷

番茄紅素對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

趙孟雷

目的 研究番茄紅素(Lycopene，LP)對人肝癌HepG2細(xì)胞生長的影響并初探其機(jī)制。方法 取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞設(shè)空白對照組、LP(5 μg/mL)組、LP(10 μg/mL)組、LP(20 μg/mL)組和順鉑(40 μg/mL)組，每組設(shè)10個復(fù)孔；各組分別給藥干預(yù)48 h后，噻唑藍(lán)(MTT)比色法測定細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡狀況，RT-PCR法檢測Bax mRNA和Bcl-2 mRNA表達(dá)，Western blot法檢測Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果 與空白對照組比較，經(jīng)LP(10 μg/mL、20 μg/mL)或順鉑40 μg/mL干預(yù)48 h能夠顯著提高HepG2細(xì)胞增殖抑制率，延長細(xì)胞周期中G0/G1期而縮短G2/M期，提高細(xì)胞凋亡率，上調(diào)促凋亡Bax mRNA表達(dá)并下調(diào)抑凋亡Bcl-2 mRNA表達(dá)，提高Bax/Bcl-2比值，上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，LP上述作用具有一定的劑量依賴性。結(jié)論 LP具有抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的作用，其機(jī)制可能與LP干預(yù)細(xì)胞周期分布和調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)有關(guān)。

番茄紅素；肝細(xì)胞癌；HepG2細(xì)胞；增殖；凋亡

1 材料與方法1.1 細(xì)胞、藥物與試劑

人肝癌HepG2細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物研究室惠贈；LP購自南京澤朗生物科技有限公司(批號：20150724，純度≥96%)；順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司(規(guī)格：6 mL：30 mg)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibco公司；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國BD公司；MTT購自Sigma公司；Caspase-3單抗購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器

超凈工作臺(江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Electron公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)；電泳儀和轉(zhuǎn)印泳槽(北京六一儀器廠)；RT-PCR(新未來儀器技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與給藥 人肝癌HepG2細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇后植入DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)并取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)：0.25%胰酶消化、調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL后隨機(jī)分組，因研究發(fā)現(xiàn)LP對肝癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為10 μg/mL，因此設(shè)LP(5、10、20 μg/mL)組和順鉑(40 μg/mL)組以及空白對照組，每組設(shè)10個復(fù)孔(n=10)；各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后分別給予相應(yīng)濃度藥物進(jìn)行干預(yù)，48 h后行各指標(biāo)檢測。

1.3.2 細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的測定 藥物干預(yù)48 h后調(diào)整細(xì)胞為5×104/mL，轉(zhuǎn)移至96孔板，每孔滴加濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后去上清，加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL，于自動震蕩儀振蕩10 min后通過酶標(biāo)儀測定570 nm處吸光度(OD)值，細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。各組細(xì)胞經(jīng)藥物干預(yù)48 h后PBS洗滌3次、滴加70%乙醇5 mL混勻并置4℃環(huán)境48 h后離心取細(xì)胞，PBS洗滌、滴加濃度為10 mg/mL的水解酶RNAse 5 μL，置于37℃環(huán)境1 h，加入碘化丙啶染液后避光孵育30 min，然后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，采用CELL Quest軟件分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期時相及凋亡情況。

1.3.4 各組HepG2細(xì)胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)的檢測及Bax/Bcl-2比值的計(jì)算 通過基因文庫查詢并設(shè)計(jì)合成Bcl-2、Bax、β-actin基因上、下游引物；各組細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后離心并收集細(xì)胞，依次進(jìn)行提取總RNA、測定總RNA濃度、反轉(zhuǎn)錄為cDNA、行PCR反應(yīng)處理后，取PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像儀觀察并照相保存。以β-actin為內(nèi)參，以灰度值進(jìn)行半定量分析Bcl-2 mRNA、Bax mRNA相對表達(dá)量并計(jì)算Bax/Bcl-2比值。

雖然現(xiàn)場試驗(yàn)樁身軸力測試所采用的方法與傳統(tǒng)的鋼筋計(jì)法、應(yīng)變計(jì)法及光纖測試法不同，但該試驗(yàn)方法得到了與傳統(tǒng)方法相近的試驗(yàn)結(jié)果，即沉樁過程靜壓PHC管樁貫入阻力與樁端土層軟硬程度有關(guān)，樁端阻力在硬質(zhì)土層界面大幅增長，樁側(cè)摩阻力增幅遠(yuǎn)小于樁端阻力，樁身軸力在未進(jìn)入硬土層時變化不大.靜載試驗(yàn)過程樁側(cè)摩阻力先于樁端阻力發(fā)揮作用，且發(fā)揮程度遠(yuǎn)大于樁端阻力，上部土層摩阻力先于下部土層發(fā)揮，隨著荷載增加樁端阻力所占比例逐漸提高.

1.3.5 各組HepG2細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的檢測 各組細(xì)胞經(jīng)PBS溶液洗滌后行超聲裂解，低溫離心(4℃，12 000 rpm，20 min)取沉淀，采用BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性(沸水浴加熱5 min)、上樣(每孔上樣30 μg)，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜、室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(Caspase-3，β-actin)4℃過夜，洗膜、二抗(1∶100)室溫孵育1 h后經(jīng)ECL系統(tǒng)顯影；以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值測定Caspase-3相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用軟件SPSS 15.0進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組人肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制率

經(jīng)LP(5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL)或順鉑40 μg/mL干預(yù)48 h能夠顯著提高人肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制率，且LP對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用具有一定的劑量依賴性；而與順鉑組比較，LP(20 μg/mL)組HepG2細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(表1)。

2.2 各組人肝癌HepG2細(xì)胞周期

經(jīng)LP(10 μg/mL、20 μg/mL)干預(yù)48 h能夠顯著延長人肝癌HepG2細(xì)胞周期G0/G1期、縮短G2/M期，其中LP(20 μg/mL)組與空白對照組和順鉑組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示LP能夠阻滯細(xì)胞周期而起到抑制細(xì)胞增殖的作用(表2)。

2.3 各組人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡狀況

經(jīng)LP(5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL)或順鉑干預(yù)48 h能夠誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，LP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用具有一定的劑量依賴性(圖1)。經(jīng)LP(5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL)或順鉑(40 μg/mL)干預(yù)48 h能夠有效提高人肝癌HepG2細(xì)胞AI，且LP 20 μg/mL組人肝癌HepG2細(xì)胞AI顯著高于順鉑組(表3)。

表1 各組人肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制率

Note：**P<0.01，compared to blank control group；△P<0.05，compared to Cisplatin group.

表2 各組人肝癌HepG2細(xì)胞周期

Note：*P<0.05，**P<0.01，compared to blank control group；△P<0.05，compared to Cisplatin group.

圖1 各組人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡狀況Figure 1 The apoptosis of human HepG2 cells in each groupNote：A.blank control group；B.LP 5 μg/mL group；C.LP 10 μg/mL group；D.LP 20 μg/mL group；E.Cisplatin 40 μg/mL group.

GroupNumberAI(%)Blankcontrol103.6±1.7LP5μg/mL1019.5±4.8*LP10μg/mL1042.8±8.5*LP20μg/mL1067.6±10.1*△Cisplatin40μg/mL1036.9±6.8*F15.167P<0.001

Note：*P<0.01，compared to blank control group； △P<0.05，compared to Cisplatin group.

2.4 各組人肝癌HepG2細(xì)胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)和Bax/Bcl-2比值

經(jīng)LP(10 μg/mL、20 μg/mL)或順鉑(40 μg/mL)干預(yù)48 h能夠顯著下調(diào)人肝癌HepG2細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)，上調(diào)Bax mRNA表達(dá)，顯著提高Bax/Bcl-2比值；其中LP 20 μg/mL組Bcl-2 mRNA表達(dá)較順鉑組顯著降低、Bax/Bcl-2比值顯著升高(表4)。

2.5 各組人肝癌HepG2細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)

經(jīng)LP(5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL)或順鉑(40 μg/mL)干預(yù)48 h能夠顯著上調(diào)HepG2細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)量；與順鉑組比較，LP 20 μg/mL組Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(圖2，表5)。

GroupNumberBcl-2(×10-3)Bax(×10-3)Bax/Bcl-2Blankcontrol1051.8±13.527.9±24.10.54±0.21LP5μg/mL1035.3±10.932.9±32.80.93±0.30LP10μg/mL1028.9±8.0**74.3±34.5*2.57±0.75**LP20μg/mL1017.8±5.1**△89.9±38.6**5.05±1.09**△Cisplatin40μg/mL1031.5±7.1**100.6±34.7**3.19±1.13*F6.10810.6175.664P0.012<0.0010.015

Note：*P<0.05，**P<0.01，compared to blank control group；△P<0.05，compared to Cisplatin group.

Table 5 The expression of Caspase-3

Note：*P<0.05，**P<0.01，compared to blank control group；△P<0.05，compared to Cisplatin group.

圖2 將總Caspase-3調(diào)整到一致的程度上檢測Caspase-3剪切體表達(dá)水平Western blot檢測結(jié)果Figure 2 The total Caspase-3 level was adjusted to the same amount to detect the cleaved level of Caspase-3 by Western blotNote：A.blank control group；B.LP 5 μg/mL group；C.LP 10 μg/mL group；D.LP 20 μg/mL group；E.Cisplatin 40 μg/mL group.

3 討論

肝癌是發(fā)病率致死率均較高的惡性腫瘤之一[9]；我國每年約11萬人死于肝癌，居惡性腫瘤致死率第二位。肝癌具有發(fā)病隱匿、發(fā)展迅速、轉(zhuǎn)移及侵襲能力強(qiáng)、惡性度高的特點(diǎn)[10-11]，肝癌按最基本的分類原則可分為肝細(xì)胞肝癌、膽管細(xì)胞肝癌以及肝母細(xì)胞瘤等。目前，手術(shù)切除后輔以放化療仍是臨床上治療肝癌的首選方案[12]，但目前臨床上手術(shù)切除率僅為20%[13]，且5年復(fù)發(fā)率高達(dá)60%以上[14]，嚴(yán)重危害著人類的生命健康。隨著病理生理學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)以抑制增殖和促進(jìn)凋亡為切入點(diǎn)，或許是研究新型抗腫瘤藥物的新思路。

既往研究發(fā)現(xiàn)，LP能夠通過抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移而對人肺癌H520細(xì)胞的擴(kuò)散具有一定的抑制作用[5]；LP能夠通過增強(qiáng)機(jī)體免疫力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而對胃癌具有一定的抑制作用[6]；LP能夠通過改變膜電位并促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)而對人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖具有抑制作用[15]；此外，張鑫等[7]研究發(fā)現(xiàn)LP對前列腺癌LnCaP細(xì)胞和人喉癌Hep-2細(xì)胞均具有一定的抑制作用[7，16]。本研究采用MTT法檢測人肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制率發(fā)現(xiàn)：經(jīng)LP干預(yù)48 h能夠顯著提高人肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制率，且LP 20 μg/mL劑量組細(xì)胞增殖抑制率顯著高于順鉑組；經(jīng)FCM檢測發(fā)現(xiàn)：經(jīng)LP干預(yù)48 h能夠阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期、提高細(xì)胞凋亡率；且與順鉑組比較，LP 20 μg/mL組細(xì)胞凋亡率顯著升高，提示LP具有抑制HepG2細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的藥理學(xué)作用。

細(xì)胞凋亡過程有多種基因蛋白參與調(diào)控，其中Caspase-3是激活各種凋亡刺激因子(Apaf-1)的關(guān)鍵蛋白酶，參與細(xì)胞凋亡的啟動及整個凋亡過程的調(diào)節(jié)；Bcl-2能夠抑制線粒體破裂，可直接與Apaf-1結(jié)合而抑制Caspase-3激活，抑制促凋亡蛋白Bax細(xì)胞毒性作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，從而起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[17-18]；Bax屬于Bcl-2基因家族成員，具有誘導(dǎo)線粒體滲透性改變而釋放細(xì)胞色素C、激活促凋亡蛋白Caspase-9，而表現(xiàn)出促細(xì)胞凋亡作用[19]。Bax與Bcl-2能夠形成二聚體，所以Bax/Bcl-2比值更加能夠體現(xiàn)Bcl-2基因家族對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LP干預(yù)能夠調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞Bax mRNA和Bcl-2 mRNA表達(dá)，提高Bax/Bcl-2比值，上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，這可能是LP誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的重要分子機(jī)制之一。

綜上所述，LP可能通過抑制增殖并促進(jìn)凋亡而對人肝癌HepG2細(xì)胞生長起到一定的抑制作用，其機(jī)制可能與LP改變細(xì)胞周期以及調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)有關(guān)。

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(收稿：2016-09-07)

Effects of lycopene on the proliferation and apoptosis in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells

ZHAOMenglei

Handan Central Hospital，Handan 056001，China

Objective The objective of this study was to investigate effects of lycopene(LP)on the proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells and to explore its mechanism.Methods HepG2 cells in logarithmic growth phase were treated with 0，5，10，20 μg/mL of LP and 40 μg/mL of Cisplatin for 48 h.Ten replicates in each dose were designed in this study.After treatments，the cell viability was measured by MTT colorimetric assay.The distribution of cell cycle was detected by flow cytometry(FCM).The mRNA expression of Bax and Bcl-2 were measured by RT-PCR.The expression of Caspase-3 protein was explored by Western blot.Results The inhibition rate of HepG2 cells was significantly increased by 10 μg/mL and 20μg/mL of LP or 40 μg/mL of cisplatin when compared to the negative control group.The cell cycle of HepG2 cells were arrested at the G0/G1phase and the apoptosis rate were significantly increased in comparison with the negative control group.The level of Bax mRNA expression was significantly increased and decreased in the expression of Bcl-2 mRNA.They were shown an increasing ratio of Bax/Bcl-2 and up-regulated Caspase-3 protein in HepG2 cells treated with LP.All effects in this study show a dose-dependent manner.Conclusion LP can inhibit the proliferation and promote the apoptosis in HepG2 cells.This mechanism may be contributed to arresting cell cycle and regulating gene expression related to apoptosis.

Lycopene；Human hepatocellular carcinoma HepG2 cells；Proliferation；Apoptosis

邯鄲市中心醫(yī)院普外三科(邯鄲 056001)

趙孟雷，男，(1981-)，碩士，主治醫(yī)師，從事外科疾病的研究。

趙孟雷，E-mail：hdzhml@163.com

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.03.004