蓮霧果實(shí)高質(zhì)量總蛋白提取方法的建立

姜興旭，陳發(fā)河

(集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

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蓮霧果實(shí)高質(zhì)量總蛋白提取方法的建立

姜興旭，陳發(fā)河

(集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

為了高質(zhì)量提取蓮霧果實(shí)總蛋白，選擇TCA/丙酮法、勻漿法、酚抽提法、試劑盒法和裂解法，分別從蓮霧果實(shí)中提取總蛋白，使用Bradford法測定蛋白含量，對蛋白含量較高的勻漿法、酚抽提法和試劑盒法進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示，3種方法所得圖譜都條帶清晰且較無明顯拖尾，其中酚抽提法所得圖譜最完整清晰且蛋白得率最高，說明酚抽提法適合蓮霧果實(shí)總蛋白提取。

蓮霧；果實(shí)總蛋白；蛋白質(zhì)提??；酚抽提法

蓮霧(Syzygium samarangense (Blume)Merr.L.M.Perry)我國臺(tái)灣17世紀(jì)就已引種，福建、廣東、海南等南方多省也均有種植[1]。蓮霧組織疏松、呼吸代謝旺盛，采收后未經(jīng)處理，果肉短時(shí)間內(nèi)急劇劣變甚至腐爛。為了研究采后蓮霧果實(shí)貯藏期間蛋白質(zhì)表達(dá)差異，探討其絮狀綿軟的分子機(jī)理，提取其果實(shí)總蛋白及電泳是前提條件。蓮霧果實(shí)中富含色素、果膠和多糖多酚類物質(zhì)，能與蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，導(dǎo)致總蛋白樣品制備困難。目前蛋白質(zhì)的提取方法很多，但在蓮霧中卻鮮有報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

采用臺(tái)灣“黑珍珠”蓮霧，購自廈門中埔臺(tái)灣水果銷售集散中心。挑選果實(shí)正常發(fā)育且形態(tài)相似，表面無外傷及病蟲害侵染的新鮮蓮霧果實(shí)。液氮速凍后，迅速置于-80 ℃冰箱備用。

1.2 蓮霧果實(shí)總蛋白提取

以下步驟均在4 ℃條件下進(jìn)行。

A.TCA/丙酮法: 迅速從超低溫冰箱中取出保存的蓮霧果肉組織5 g，含有1%交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，液氮中研磨成粉末。加入4倍體積10% TCA(含0.07% β-巰基乙醇)勻漿液，-20 ℃沉淀3 h以上；20 000 g離心30 min，棄上清；沉淀物用冷丙酮(含20 mmol/L DTT)反復(fù)洗滌3次以上至丙酮無色。沉淀真空冷凍干燥，于-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

B. 勻漿法: 稱取5 g蓮霧果肉(含1% PVPP)，液氮中研磨成粉末。加入5 mL配制好的勻漿緩沖液1 [20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)；250 mmol/L 蔗糖；10 mol/L EGTA；1 mmol/L PMSF；1 mmol/L DTT；1% Triton X-100]，繼續(xù)研磨，混勻液20 000 g離心30 min，轉(zhuǎn)移上清添加10%TCA，4 ℃放置2 h，20 000 g離心40 min，收集沉淀，冷丙酮沖洗3次以上至無色。沉淀物凍干，低溫保存。

C. 酚抽提法: 稱取5 g蓮霧果肉(含1% PVPP)，液氮中研磨成粉末。加入5 mL配制好的勻漿緩沖液2(蔗糖濃度增于1.05 mol/L，其他物質(zhì)濃度與1相同)后繼續(xù)研磨，20 000 g離心30 min。上清液中加入等體積Tris飽和酚(pH7.8)，漩渦充分震蕩，10 000 g離心30 min，回收上層酚相。再加入5倍體積的預(yù)冷甲醇(含0.1 mol/L 乙酸銨)，-20 ℃過夜放置以沉淀蛋白。冷甲醇、丙酮溶液中分別沖洗2次，收集沉淀物凍干保存。

D. 裂解法: 稱取5 g蓮霧果肉，加入1% PVPP，研磨成粉末，加入4倍體積勻漿液[0.5 mol/L Tris-HCl(pH7.5)；0.7 mol/L蔗糖；0.05 mol/L EDTA；0.1 mol/L KCl；1 mmol/L PMSF；2%(v/v)β-巰基乙醇；2%(w/v)SDS]繼續(xù)研磨，再加入等體積Tris-飽和酚(pH7.8)研磨，20 000 g離心20 min，回收上層酚相。加入等體積勻漿液漩渦混勻，20 000 g離心20 min，回收酚相，該步驟重復(fù)3次。加入5倍體積預(yù)冷甲醇(含0.1 mol/L 乙酸銨)，-20 ℃過夜沉淀。冷甲醇、丙酮溶液中分別沖洗2次，收集沉淀物凍干保存。

E.試劑盒法采用貝博生物公司的Plant Protein Extraction Reagent試劑盒。

1.3 蛋白質(zhì)樣品溶解與定量

制備好的蛋白干粉溶于蛋白裂解液[7 mol/L尿素；2 mol/L硫脲；4%(w/v)CHAPS；2%(v/v)NP-40；1%(w/v)DTT；使用前加PMSF]中，充分裂解4～6 h，15 000 g離心30 min，取上清重復(fù)離心2次。上清液采用Bradford法測定蛋白濃度。

1.4 SDS-PAGE凝膠電泳

配置12%分離膠和5%濃縮膠，上樣量為10 μL。濃縮膠內(nèi)電泳設(shè)置為90 V，當(dāng)溴酚藍(lán)線到達(dá)分離膠時(shí)將電壓提高至120 V。當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部時(shí)停止電泳，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法蛋白產(chǎn)量的分析

分別采用TCA/丙酮法、勻漿法、酚抽提法、試劑盒法和裂解法提取蓮霧果實(shí)總蛋白，產(chǎn)量如表1所示。所得蛋白產(chǎn)量從高到低分別為酚抽提法、勻漿法、試劑盒法、裂解法和TCA/丙酮法。其中酚抽提法可達(dá)到1.63 mg/g鮮重，為TCA/丙酮法的2.43倍，具有顯著差異(P<0.05)。勻漿法、試劑盒法和裂解法的提取量分別為酚抽提法的88.34%，79.14%和74.85%，酚抽提法從蛋白提取量上看效果最好。

表1 不同提取方法所獲得的蛋白產(chǎn)量Tab.1 Protein yield of different extraction methods

注: 采用Bradford法測定蛋白濃度Y=0.0055X+0.0034，R2=0.9923。

2.2 不同提取方法SDS-PAGE帶型對比

根據(jù)上一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇酚抽提法、勻漿法和試劑盒法提取所得的蛋白質(zhì)溶解液，上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖1所示。3種提取方法所獲得的蓮霧果實(shí)總蛋白在凝膠電泳中顯示的條帶數(shù)目較一致，均無明顯拖帶現(xiàn)象，但清晰度存在差異。其中酚抽提法所得樣品條帶最明亮，試劑盒法次之，勻漿法效果最差。電泳條帶的明亮程度與蛋白濃度結(jié)果較一致。酚抽提法所得蛋白樣品在低分子量處(20～35 Ku)也有明顯分布，說明酚抽提法提取蛋白的分子量范圍較廣，最適合于蓮霧果實(shí)總蛋白的提取，推測與蓮霧果肉化學(xué)組成和蛋白特性有關(guān)。

A: 試劑盒法；B: 勻漿法；C: 酚抽提法；M: Marker圖1 不同提取方法所得蓮霧果實(shí)總蛋白的SDS-PAGE圖譜比較Fig.1 Comparison of SDS-PAGE patterns of total protein samples obtained by different extraction methods

3 討論

蛋白質(zhì)樣品提取是蛋白組學(xué)研究的前提。本實(shí)驗(yàn)嘗試應(yīng)用TCA/丙酮法、勻漿法、酚抽提法、試劑盒法和裂解法5種方法。提取中發(fā)現(xiàn)，液氮研磨的成功可以有效保證蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)在液氮研磨過程中均添加了1% PVPP。已有文獻(xiàn)報(bào)道，PVPP是強(qiáng)氫離子受體，可高效吸附多酚類物質(zhì)，去除雜質(zhì)污染[2]。蓮霧果實(shí)中色素較多，而TCA/丙酮法在提取過程中能較好去除色素，但其蛋白得率最低。TCA為強(qiáng)酸，容易造成蛋白質(zhì)解體斷裂。提取過程中多次溶解的過程可能增加蛋白質(zhì)再溶的困難性，從而導(dǎo)致總蛋白大量流失[3]。酚抽提法中，酚是蛋白質(zhì)的良好溶劑，蛋白質(zhì)和脂類溶于酚相，而多糖、多酚等可溶性雜質(zhì)溶于水相，達(dá)到初步分離后，酚相中的蛋白質(zhì)可通過含乙酸銨的甲醇溶液進(jìn)一步純化。

[1] 李春福.東山縣蓮霧的生產(chǎn)技術(shù)[J].中國農(nóng)業(yè)信息，2016，(03):112-113.

[2] Laborde B，Moineledoux V，Richard T，et al. PVPP-polyphenol complexes: a molecular approach[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，2006，54(12):4383.

[3] 郭立安，閻哲，張曉楠，等.三氯乙酸對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響[J].醫(yī)學(xué)爭鳴，2001，22(22):102.

Establishment of high quality total protein extraction method for syzygium samarangense

JIANG Xing-xu，CHEN Fa-he

(College of Food and Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, China)

In order to establish the method of high quality extraction of total protein of syzygium samarangense, the total protein was extracted from the fruit of rhamnus officinalis by TCA/acetone method, homogenization method, phenol extraction method, kit method and lysis method respectively. Protein content was determined by Bradford method, SDS-PAGE was performed on homogenization, phenol extraction and reagent method. The results showed that the patterns of the three methods were clear and had no obvious tailing, and the deduced extraction pattern was the most complete and the highest protein yield.

Syzygium samarangense; Fruit total protein; Protein extraction; Phenol extraction method

2017-02-17

姜興旭(1992-)，女，碩士研究生。

陳發(fā)河(1960-)，男，碩士，教授。

TS205

A

1674-8646(2017)08-0084-02