鈣網(wǎng)蛋白在上皮性卵巢癌中的表達及臨床意義*

戴 宇，劉 凱，姚秀華

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院婦科，廣東 深圳 518000）

卵巢腫瘤是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一，死亡率居婦科惡性腫瘤之首，因其發(fā)病比較隱匿，許多卵巢癌被確診時已是晚期。而在卵巢惡性腫瘤中，上皮性卵巢癌約占90%，腫瘤細胞減滅術(shù)和以鉑類為基礎(chǔ)的化療是上皮性卵巢癌的主要治療原則。但隨之而來的腫瘤細胞耐藥問題使相當一部分患者在手術(shù)合化療后仍會出現(xiàn)疾病進展或復(fù)發(fā)，致使其5年生存率還不到30%。因此，尋找惡性腫瘤的早期診斷指標以及尋找基因的靶向治療方法逐漸成為一個研究的熱點，鈣網(wǎng)蛋白 (calreticulin，CRT)為主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (endoplasmic reticulum，ER)且高度保守的一種Ca2+結(jié)合蛋白，包括協(xié)助蛋白質(zhì)加工折疊、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣平衡、抑制腫瘤血管新生和參與抗原遞呈及細胞凋亡等功能。最近發(fā)現(xiàn)，CRT在臨床腫瘤的診斷及治療方面有著不可估計的應(yīng)用前景，成為研究熱點之一。但有關(guān)CRT在卵巢癌中的研究尚無報道。本研究采用免疫組織化學(xué)方法，檢測CRT在不同生理、病理狀態(tài)下的卵巢組織中蛋白的表達，從而尋找可預(yù)測腫瘤惡性潛能的生物學(xué)標志物，為采取有效的預(yù)防措施，選擇新的治療靶點，制定合理有效的綜合治療方案奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取深圳市婦幼保健院2013-01—2015-12間手術(shù)切除的組織標本，包括40例上皮性卵巢癌，20例卵巢良性腫瘤，10例正常卵巢組織，上皮性卵巢癌患者40例，其中漿液性癌28例，粘液性癌12例；高-中分化癌14例，低分化癌26例；按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）臨床分期標準，I～II期11例，III～IV期29例；有淋巴轉(zhuǎn)移25例，未轉(zhuǎn)移15例，所有的病例術(shù)前均未接受放療、化療或激素治療。良性卵巢腫瘤20例，10例正常卵巢組織 (來自卵巢活檢、子宮肌瘤或功能性子宮出血、子宮脫垂的病例行全子宮切除同時行卵巢切除，病理證實卵巢組織無異常者)，病理診斷經(jīng)兩位病理專家確證。組織標本10%甲醛固定，石蠟包埋，制備成4μm厚切片。

1.2 方法

免疫組織化學(xué)檢查采用S-P兩步法。鼠抗人CRT多克隆抗體購自美國Santa Cruz生物科技公司，工作濃度1∶200。免疫組化S-P試劑盒購自福州邁新試劑公司，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司，整個過程按試劑盒說明書進行。每批染色均設(shè)已知陽性切片（肝癌）作陽性對照，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

每張切片于400倍光鏡下隨即選取4個視野，采用Metamorph/DP10/BX41顯微圖像分析系統(tǒng)，對其中一個具有代表意義的陽性結(jié)果視野的棕黃色顆粒進行標記，以此標準自動檢測所有視野的陽性結(jié)果，以參數(shù)積分光密度（integral optical density，IOD）代表蛋白顆粒密度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量單位以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和獨立樣本Dunnett t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

在上皮性卵巢癌中表達水平明顯高于在卵巢良性腫瘤及正常卵巢組織中的表達（見表1）。進一步分析CRT的表達與卵巢癌某些臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，CRT與組織病理分級（P＜0.05）、臨床分期（P＜0.05）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）有關(guān)，與組織學(xué)分型（P＞0.05）無關(guān)（見表2）。

圖1 CRT在上皮性卵巢癌中的表達（S-P 400×）

圖2 CRT在正常卵巢組織中的表達（S-P 400×）

表1 CRT在正常卵巢組織及上皮性卵巢腫瘤中的表達（±s）

表1 CRT在正常卵巢組織及上皮性卵巢腫瘤中的表達（±s）

注:1)vs 2)，P＜0.05；1)vs 3)，P＜0.05；2)vs 3)，P＜0.05。

分組正常卵巢組織1)良性卵巢腫瘤2)上皮性卵巢癌3)例數(shù)OPN F/P 10 20 40(IOD值)3.21±4.50 16.54±7.04 90.26±10.29 F=9.55 P＜0.05

3 討論

CRT最先由Ostwald和Maclennan于1974年從骨骼肌肌漿網(wǎng)中首次分離獲得，是一種普遍存在且高度保守的內(nèi)質(zhì)鈣結(jié)合蛋白。CRT是熱休克蛋白家族的一員，分子大小約46kD，由單一基因編碼，人類CRT基因位于第19號染色體(p13.2～p13.3)，由9個外顯子和8個內(nèi)含子構(gòu)成，長度為1254 bp，編碼由417個氨基酸組成的酸性蛋白質(zhì)，最初被認為是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白，主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，普遍存在于除酵母和原核生物以外的哺乳動物細胞及植物中。后有研究發(fā)現(xiàn)，CRT還存在于胞膜、胞質(zhì)或胞外基質(zhì)等，即所謂的非ER-CRT[1]。CRT由3個結(jié)構(gòu)域組成，包括球狀N-末端結(jié)構(gòu)域、富脯氨酸P結(jié)構(gòu)域和酸性C末端結(jié)構(gòu)域[2]，每個結(jié)構(gòu)均發(fā)揮獨特的病理生理學(xué)作用。鈣網(wǎng)蛋白最初的功能是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外Ca2+濃度的穩(wěn)定及作為分子伴侶、協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊[3]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)CRT是多功能蛋白質(zhì)，在抗原的提呈、血管的發(fā)生、細胞黏附、細胞凋亡及自身免疫系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用，CRT表達量的改變可以使細胞的侵襲、黏附、增殖等生物學(xué)行為發(fā)生改變，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)[4]。

表2 CRT的表達與臨床病理特征的關(guān)系（±s）

表2 CRT的表達與臨床病理特征的關(guān)系（±s）

臨床病理指標組織病理分級高-中分化低分化臨床分期I～II期III～IV 期組織學(xué)分型漿液性囊腺癌黏液性囊腺癌淋巴轉(zhuǎn)移例數(shù)OPN表達（IOD值）t P 14 26 44.30±12.54 90.44±13.42 4.51P＜0.05 11 29 56.32±11.74 110.21±15.06 2.48P＜0.05 28 12 89.41±21.41 93.17±18.56 0.21P＞0.05無有15 25 61.67±20.24 112.34±18.42 3.04P＜0.05

惡性腫瘤死亡率高的一個重要的原因是不能早期診斷，許多患者在明確診斷后往往已經(jīng)是晚期，錯過了最佳的治療時機。而缺乏特異性高、敏感性強的腫瘤標記物是導(dǎo)致不能早期診斷的直接原因。因此，尋找出新的有利于早期診斷的腫瘤標記物意義重大。近年許多研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤中CRT及其裂解片段有量的改變。Liu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞膜上的CRT表達水平與腫瘤的病理分型和分期相關(guān)，小細胞肺癌的CRT水平低于腺癌，然而鱗狀細胞癌表達均比前兩者高。Sheng等[6]研究結(jié)果顯示，胰腺癌中CRT mRNA表達水平高于癌旁組織，CRT過表達者的預(yù)后好于低表達者。Kageyama等[7]發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者尿液中CRT表達較正?；颊吒撸异`敏度及特異性分別達67%、80%。Kabbage等[8]研究發(fā)現(xiàn)，CRT在乳腺癌組織和細胞系中高表達，尤其在高侵襲性的乳腺癌細胞系中表達量高于低侵襲性細胞。CRT在肝癌、食管癌、結(jié)腸癌[9]等腫瘤中也呈高表達，近年CRT逐漸成為婦科腫瘤領(lǐng)域中的研究熱點。劉倩等[10]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜樣腺癌中CRT mRNA水平和蛋白表達水平較正常子宮內(nèi)膜均升高，韓冰等[11]實驗證實，CRT在絨癌耐藥細胞系中高表達，下調(diào)CRT后耐藥指數(shù)明顯降低，推測CRT可能參與絨癌耐藥。以上研究表明，CRT有望成為多種腫瘤的新標記物,有利于協(xié)助惡性腫瘤的早期診斷。

本研究結(jié)果顯示CRT主要定位在細胞的胞漿，其表達與上皮性卵巢癌的組織病理分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)。CRT進一步加快了腫瘤細胞的進程。因此，檢測CRT可能成為卵巢癌診斷性標志物及有效的治療靶點，對改善卵巢癌患者的預(yù)后具有重要的意義。最終使降低卵巢癌患者的復(fù)發(fā)率，提高5年生存率成為可能。

[1]GOLD L I,EGGLETON P,SWEETWYNE M,et al.Calreticulin:nonendoplasmic reticulum functions in physiology anddisease[J].FASEB,2010,24(3):665-683.

[2]MICHALAK M,CORBETT E F,MESAELI N.Calreticulin one protein,one gene,many functions[J].Biochem,1999,344(2):281-292.

[3]GELEBART P,OPAS M,MICHALAK M,et al.Calreticulin,aCa2+-binding chaperone of the endop-lasmic reticulum[J].Cell Biol,2005,37(2):260-266.

[4]ZAMANIAN M,VEERAKUMARASIVAM A,ABDULLAH S,et al.Cal reticulinand cancer[J].Pathol Oncol,2013,19(2):149-154.

[5]LIU R,GONG J,CHEN J,et al.Calreticulin as a potential diagnosticbiomarker for lung cancer[J].Cancer Immunol Immunother,2012,61(6):855-864.

[6]SHENG W,CHEN C,DONG M,et al.Overexpression of calreticulincontributes to the development and progressionof pancreatic cancer[J].Cell Physiol,2014,229(7):887-897.

[7]KAGEYAMA S,ISONO T,MATSUDA S,et al.Urinary calreticulinin the diagnosis of bladder urothelial carcinoma[J].Int Urol,2009,16(5):48l-486.

[8]KABBAGE M,TRIMECHE M,BERGAOUI S,et al.Calreticulin expression in infiltrating ductal breast carcinomas:relationshipswith disease progression and humoral mmuneresponses[J].Tumor Biol,2013,34(2):1177-1188.

[9]ZAMANIAN M,VEERAKUMARASIVAM A,ABDULLAH S,et al.Calreticulin and cancer[J].Pathol Oncol,2013,19(2):149-154.

[10]劉倩，楊清.鈣網(wǎng)蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達及臨床意義[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2016,25(4):249-256.

[11]韓冰，向陽，馮鳳芝，等.鈣網(wǎng)蛋白在甲氨蝶呤耐藥絨毛膜癌中的作用研究[J].實用婦產(chǎn)科雜志，2013,29(3):194-197.