氣道吸入中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑對(duì)顱腦損傷誤吸致肺損傷大鼠炎性因子及免疫功能的影響

榮 燕 江智霞 黃大可

(安徽中醫(yī)藥大學(xué),合肥230012)

氣道吸入中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑對(duì)顱腦損傷誤吸致肺損傷大鼠炎性因子及免疫功能的影響

榮 燕 江智霞①黃大可②

(安徽中醫(yī)藥大學(xué),合肥230012)

顱腦損傷(Brain injury)患者咽反射消失，食物或口咽分泌物容易誤吸進(jìn)入肺內(nèi)，導(dǎo)致急性吸入性肺損傷(Acute lung injury,ALI)，處理不及時(shí)還可能出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，甚至造成患者死亡[1]。目前顱腦損傷繼發(fā)肺損傷發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與活化中性粒細(xì)胞(Polymorphonulear leukocyte,PMN)釋放細(xì)胞因子與過度炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)是PMN釋放的一種蛋白酶，是引起炎癥反應(yīng)與免疫異常的終效因子，可介導(dǎo)并引起肺損傷[2]。西維來(lái)司鈉(Sivelestat sodiom)是一種中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)抑制劑，可以有效抑制NE，阻止并減輕中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的肺損傷反應(yīng)[3]。西維來(lái)司鈉臨床上多采用全身靜脈給藥，局部藥物濃度有限，給藥劑量大，藥物作用受限，且副作用明顯。霧化吸入能使藥物直接到達(dá)終末支氣管及肺泡，局部藥物濃度高，能最大程度發(fā)揮藥效[4]。本文通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的方法，探討霧化吸入西維來(lái)司鈉對(duì)顱腦損傷誤吸致肺損傷大鼠模型炎性因子、免疫功能的影響，旨在揭示其治療的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 60只SD大鼠，均為雄性，體重270～340 g，平均(312.53±7.89)g。購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號(hào)：AHCK2015-0012)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為健康對(duì)照組、模型組、生理鹽水組、地塞米松組、西維來(lái)司鈉組各12只。飼養(yǎng)條件：室溫(25.21±0.56)℃，相對(duì)濕度50%～60%，常規(guī)進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2主要儀器與試劑 霧化治療器：德國(guó)百瑞公司PARI Turbo BOY 型；高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠TGL-16型；光學(xué)相差顯微鏡：日本Olympus公司CKX41型；病理圖像分析系統(tǒng)：Germany公司Leica Qwin standard 2.8；恒溫冰箱：天津泰斯特儀器有限公司HH-W21-60型；全自動(dòng)生化分析儀：日本日立7600型；流式細(xì)胞式：貝克曼庫(kù)爾特Gallios型。

西維來(lái)司鈉：上海巨龍藥物研究開發(fā)有限公司，批號(hào)：20151210；NE、IL-8、IL-4、IFN-γ、趨化因子CCL3、趨化因子CCL5等試劑均購(gòu)于北京晶美生物工程有限公司；BALF白蛋白試劑購(gòu)自海德診斷系統(tǒng)有限公司。

1.2方法

1.2.1顱腦損傷誤吸致肺損傷模型 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，除健康對(duì)照組外，其余四組大鼠采用改進(jìn)型Marmarou法建立顱腦損傷大鼠模型：將大鼠頭部置BI裝置的導(dǎo)引下，用100 g的撞擊錘從50 cm 高處經(jīng)引導(dǎo)管下滑，致使大鼠重度腦損傷。見大鼠有呼吸抑制、肢體抽蓄、昏迷及肢體活動(dòng)障礙為重度腦損傷造模成功。

隨后向大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛0.33 mg/kg，麻醉大鼠后，將其仰臥固定于操作臺(tái)上，常規(guī)消毒后，切開頸部皮膚表層，分離氣管，頭向下傾斜30°，將提前收集的鼻飼患者的胃液(0.4 ml/kg)經(jīng)大鼠氣管滴入，建立顱腦損傷誤吸模型，大鼠逐層縫合后歸籠。

1.2.2分組試驗(yàn) 參考權(quán)明桃等[5]方法，顱腦損傷誤吸模型建立后，除重度腦損傷組大鼠不作處理外，其余3組大鼠分別置入30 cm×15 cm×20 cm的玻璃箱中，給予不同的藥物溶液霧化吸入。地塞米松組用地塞米松6.25 mg/kg+0.9%氯化鈉10 ml霧化吸入，西維來(lái)司鈉組用西維來(lái)司鈉1.25 mg/kg+0.9%氯化鈉10 ml霧化吸入，每次20 min，3次/d，連續(xù)治療3 d。

1.2.3觀察指標(biāo)

1.2.3.1NE、IL-8及白蛋白含量 治療3 d 后，于氣管下段作“T”形切口，將5 ml預(yù)冷生理鹽水緩慢注入肺內(nèi)，反復(fù)灌洗5次，取支氣管肺泡灌洗液(BALF)5 ml，3 000 r/min離心15 min取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)NE、IL-8含量，采用免疫透射比濁法測(cè)定BALF中白蛋白濃度。

1.2.3.2γ-IFN、IL-4、CCL3及CCL5含量 治療3 d 后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血6 ml，3 000 r/min離心10 min取血清，采用ELISA法測(cè)定IFN-γ、IL-4、CCL3及CCL5含量。

2 結(jié)果

2.1NE、IL-8及白蛋白含量比較 模型組NE、IL-8、白蛋白含量明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05,P<0.01)；地塞米松組、西維來(lái)司鈉組NE、IL-8、白蛋白含量明顯低于模型組(P<0.05,P<0.01)；西維來(lái)司鈉組NE、IL-8、白蛋白含量明顯低于地塞米松組(P<0.05)。見表1。

2.2IFN-γ、IL-4、CCL3及CCL5含量比較 模型組血清IFN-γ、CCL3、CCL5含量明顯高于健康對(duì)照組，IL-4含量明顯低于健康對(duì)照組(P<0.05,P<0.01)；西維來(lái)司鈉組、地塞米松組血清IFN-γ、CCL3、CCL5含量明顯低于模型組，IL-4含量明顯高于模型組(P<0.05,P<0.01)；且西維來(lái)司鈉組、地塞米松組血清IFN-γ、IL-4、CCL3及CCL5含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

3 討論

急性肺損傷是重度腦損傷的常見并發(fā)癥，常發(fā)展為ARDS導(dǎo)致患者呼吸衰竭甚至死亡。重型顱腦損傷后繼發(fā)吸入性肺炎的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前認(rèn)為與肺內(nèi)過度性、失控性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞廣泛破壞有關(guān)[6]。

嚴(yán)重顱腦損傷后，應(yīng)激反應(yīng)及顱內(nèi)壓升高等因素，引起交感神經(jīng)興奮，全身血管收縮，組織缺血缺氧，使中性粒細(xì)胞處于激活狀態(tài)；如因誤吸再次發(fā)生急性肺損傷，則使處于激活狀態(tài)的炎性細(xì)胞釋放大量的炎性介質(zhì)，其中NE可直接降解細(xì)胞外基質(zhì)的多種蛋白成分，增加血管通透性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化性細(xì)胞因子，使IL-8等大量釋放，引起過度失控的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致ALI的發(fā)生[7]。大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊療法是治療ALI的主要方法。地塞米松具有廣泛的抗炎作用，能降低肺泡-毛細(xì)血管的通透性，減少滲出，降低INF-α、白介素類炎性因子的水平，抑制炎性反應(yīng)，減輕肺損傷。西維來(lái)司鈉是一種NE抑制劑，在炎癥局部可有效抑制彈性蛋白酶，減輕肺組織損傷[8]。通過霧化吸入可使藥物直達(dá)肺泡，能減輕ALI肺部炎性因子、PMN的活化，減少炎性反應(yīng)對(duì)肺組織的直接損傷[9]。丁云麗等[10]認(rèn)為，西維來(lái)司鈉能明顯抑制ANP肺損傷大鼠促炎細(xì)胞因子的釋放和表達(dá)，有效保護(hù)急性胰腺炎肺損傷。王一賀等[11]發(fā)現(xiàn)，西維來(lái)司鈉保護(hù)肺組織的機(jī)制是通過改善血?dú)夥治鲋笜?biāo)、減輕肺水腫、降低血清中炎癥因子水平實(shí)現(xiàn)的。本文研究中，西維來(lái)司鈉組支氣管肺泡灌洗液(BALF)中NE、IL-8、白蛋白含量明顯低于模型組與地塞米松組，與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論基本相似。

表1 各組大鼠BALF中NE、IL-8及白蛋白含量的比較

Note：Compared with health control group，t=10.728-31.107,1)P<0.01；compared with model group，t=4.204-26.179,2)P<0.05；compared with Dexamethasone group，t=3.799-8.634,3)P<0.05.

表2 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4、CCL3及CCL5含量的比較

Note：Compared with health control group，t=10.728-31.107,1)P<0.01；compared with model group，t=4.204-26.179,2)P<0.05；compared with Dexamethasone group，t=3.799-8.634,3)P<0.05.

“二次打擊”理論認(rèn)為，當(dāng)機(jī)體受到第一次打擊時(shí)，炎性因子與免疫細(xì)胞均處于激活狀態(tài)，如果再次受到第二次打擊，將會(huì)使處于激活狀態(tài)的炎性細(xì)胞大量釋放，免疫功能降低[12]。顱腦損傷所致誤吸對(duì)肺組織的第二次打擊，既往多認(rèn)為是胃液酸性物質(zhì)與消化酶對(duì)肺組織的直接損傷，隨著研究的不斷深入，誤吸不僅直接導(dǎo)致肺毛細(xì)血管通透性增加，也造成肺內(nèi)炎性細(xì)胞因子過度分泌，導(dǎo)致免疫功能紊亂[13，14]。T淋巴細(xì)胞參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。CD4+細(xì)胞主要分為Th1、Th2細(xì)胞兩類，IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌，能調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞募集，是一種促炎因子；IL-4由Th2分泌，能抑制IFN-γ分泌，發(fā)揮強(qiáng)大的抗炎作用[15]。CCL3及CCL5均為趨化因子之一，能調(diào)節(jié)并活化正常T細(xì)胞的表達(dá)與分泌，從而參與機(jī)體的免疫過程[16]。周游等[17]對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型大鼠的研究中，報(bào)道西維來(lái)司鈉可增強(qiáng)自身免疫性腦脊髓炎模型大鼠血清IL-4含量，且呈劑量依賴性關(guān)系。本文研究表明，西維來(lái)司鈉外周血中IFN-γ、CCL3及CCL5含量明顯低于模型組，IL-4含量明顯高于模型組，提示西維來(lái)司鈉可能提高調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能來(lái)發(fā)揮抗炎效果。

本文研究結(jié)果表明，西維來(lái)司鈉氣道霧化吸入治療對(duì)顱腦損傷誤吸致肺損傷大鼠肺組織有一定的保護(hù)作用，可能與抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性、減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等因素有關(guān)。需要指出的是，本文僅為實(shí)驗(yàn)性研究，缺乏對(duì)不同劑量西維來(lái)司鈉霧化吸入治療的比較，且對(duì)可能作用機(jī)制分析不夠深入，更準(zhǔn)確的結(jié)論還有待于更多的基礎(chǔ)研究與臨床研究去求證。

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[收稿2017-01-06]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.023

①遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，遵義563003。

②安徽醫(yī)科大學(xué)，合肥230000。

榮 燕(1982年-)，女，碩士，講師，主要從事醫(yī)學(xué)教育方面的研究，E-mail：409078107@qq.com。

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1000-484X(2017)06-0919-03