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    子癇前期患者外周血CD8+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的變化及意義①

    2017-07-05 11:46:48于建秀汪洪友孫海玲
    中國免疫學(xué)雜志 2017年6期
    關(guān)鍵詞:血清檢測研究

    于建秀 汪洪友 錢 雷 陳 瑋 孫海玲

    (濱??h人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,鹽城224500)

    子癇前期患者外周血CD8+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的變化及意義①

    于建秀 汪洪友②錢 雷 陳 瑋 孫海玲③

    (濱海縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,鹽城224500)

    目的:探討外周血CD8+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)在子癇前期(PE)疾病過程中的作用。方法:研究對象包括子癇前期孕晚期患者46例,其中輕度子癇24例(MPE組),重度子癇22例(SPE組),并選擇24例與患者孕齡匹配的健康孕婦作為對照組(HP組)。流式細(xì)胞儀檢測分析外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例;Luminex200檢測血清IL-6、 IL-17A、IL-10、IL-1β、IL-33和TGF-β1濃度。分離10例健康對照者單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),IL-33刺激培養(yǎng)后檢測CD8+CD25+FoxP3+Treg比例的變化。結(jié)果:MPE和SPE組CD8+CD25+FoxP3+Treg比例分別為[0.32(0.19-0.63)%]、[0.13(0.02-0.41)%],兩組均低于HP組[0.48(0.21-0.96)%],三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HP組相比,MPE組和SPE組血清IL-6、IL-17A濃度均升高,且SPE組患者血清IL-6、IL-17A濃度升高更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);IL-10、IL-1β和IL-33濃度在HP、MPE及SPE三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與HP對照者相比,MPE和SPE組血清TGF-β濃度均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但MPE和SPE組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PE患者CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與血清IL-17A負(fù)相關(guān)(r=-0.338,P=0.021),與IL-33正相關(guān)(r=0.548,P=0.001)。PBMCs用IL-33刺激5 d后,與空白對照組相比,CD8+CD25+FoxP3+Treg比例顯著增高(P<0.05)。結(jié)論:子癇前期患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞比例降低可能在其疾病過程中發(fā)揮重要作用。

    子癇前期;CD8+CD25+FoxP3+Treg;IL-17;IL-33

    子癇前期(Preeclampsia,PE)指孕婦妊娠前血壓正常,妊娠后出現(xiàn)高血壓和蛋白尿等臨床癥狀,發(fā)病率約5%~10%,是孕產(chǎn)婦及胎兒發(fā)病和死亡的主要原因之一[1]。研究表明子癇前期等病理妊娠的發(fā)生與母體免疫系統(tǒng)對胎兒的免疫耐受異常有關(guān),導(dǎo)致母胎界面免疫損傷和母體系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)[2]。FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是維持免疫耐受的主要效應(yīng)細(xì)胞,可抑制其他免疫細(xì)胞的增生、活化和效應(yīng)功能,抑制炎癥反應(yīng),具有保持免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能[3,4]。較多研究表明CD4+FoxP3+Treg細(xì)胞參與子癇前期的發(fā)生發(fā)展[1,3],但CD8+FoxP3+Treg在PE疾病過程中的作用缺乏研究。本次研究通過檢測PE患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞比例,并分析其與血清細(xì)胞因子相關(guān)性,探討其在PE疾病過程中的作用。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1研究對象 選取2015年9月~2016年3月在濱??h人民醫(yī)院診斷為子癇前期的孕晚期患者共46例,其中輕度子癇(MPE)24例,重度子癇(SPE) 22例,并選擇孕齡匹配的健康孕婦24例作為對照組。PE診斷標(biāo)準(zhǔn)及分類參照第八版《婦產(chǎn)科學(xué)》[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)為:使用免疫抑制藥物或患有免疫系統(tǒng)疾病。各組均無近期感染史,無胎膜破裂或雙胎。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn) (倫研2015-03),獲得受試者書面知情同意。各組受試者年齡及孕齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。臨床特征見表1。

    1.1.2儀器及試劑 異硫氰酸熒光素(FITC)鼠抗人-CD3單克隆抗體(mAb)、葉綠素蛋白偶聯(lián)物(PerCP-cy5.5)鼠抗人-CD8 mAb、別藻青蛋白(APC)鼠抗人-CD25 mAb、藻紅蛋白(PE)鼠抗人-FoxP3 mAb及同型對照、紅細(xì)胞裂解液均購自美國BD公司;血清細(xì)胞因子IL-6、 IL-17A、IL-10、IL-1β、IL-33和TGF-β1購自美國Bio-Rad公司;cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Applied Biosystems;Trizol購自Invitrogen公司;Ficoll-HyPaque分離液購自上海恒信試劑有限公司;尿微量白蛋白采用BNProSpec特定蛋白分析儀及配套試劑檢測。流式細(xì)胞儀購自BD公司;Luminex200流式熒光檢測分析儀購自Luminex公司。

    表1 研究對象臨床資料

    Note:1)P<0.05 MPE and SPE versus HP;2)P<0.05 MPE versus SPE.

    1.2方法

    1.2.1流式細(xì)胞儀檢測外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞比例 取100 μl肝素抗凝靜脈血,分別加入10 μl FITC鼠抗人-CD3 mAb、10 μl PerCP-cy5.5鼠抗人-CD8 mAb、10 μl APC-鼠抗人CD25 mAb及同型對照,室溫避光孵育30 min。紅細(xì)胞裂解液破壞紅細(xì)胞后,1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,離心棄上清。每管加入250 μl 1×Fix/Perm buffer 渦旋約3 s,避光孵育40 min,加入300 μl 1×Perm/wash buffer洗滌,離心棄上清。100 μl Perm/wash buffer 重懸細(xì)胞,加10 μl PE-Foxp3 mAb,室溫避光孵育40 min。洗滌離心,棄上清。400 μl PBS重懸細(xì)胞,立即上機(jī)檢測。以淋巴細(xì)胞(圖1A)設(shè)門,分選出CD3+CD8+T細(xì)胞(圖1B),檢測CD8+CD25+T細(xì)胞(圖1)及CD8+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞(圖1D)。

    1.2.2RNA提取及RT-PCR檢測:用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法制備外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),使用Trizol試劑提取總RNA。采用 cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行 cDNA合成,利用QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列設(shè)計(jì)如下:FoxP3,sense:5′-TGAGAAGGACAGGGAGCCAA-3′,antisense:5′-GAGAAGCTGAGTGCC-ATGCA-3′;β-actin sense:5′-TGGCACCCAGCACA-ATGAA-3′,antisense:5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTA-GAAGCA-3′。熱循環(huán)條件如下:95°C 1 min,95°C 40個(gè)循環(huán) 15 s,60°C 1 min。根據(jù)2-ΔΔCt值計(jì)算樣本中FoxP3 mRNA 相對表達(dá)水平。

    圖1 CD8+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞檢測Fig.1 Detection of CD8+CD25+FoxP3+Treg cellsNote:A.Lymphocyte were gated based on FSC and SSC (R1);B.Plots showing CD8+ lymphocyte (R2) on gated CD3+ lymphocytes;C.Plots showing CD25 expression on gated CD8+ lymphocytes (R5);D.Plots showing FoxP3 expression on gated CD8+CD25+ lymphocytes (R7).

    1.2.3Luminex液相芯片檢測血清細(xì)胞因子濃度 收集外周血2 ml,1 500 r/min離心5 min,收集血漿,立即儲存于-80℃冰箱。按試劑說明書檢測TGF-β、IL-10、IL-17A、IL-1β、IL-33、和IL-6濃度,每個(gè)標(biāo)本檢測2次,取均值。

    1.2.4IL-33誘導(dǎo)CD8+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞增殖 收集10位健康對照者外周血4 ml,通過Ficoll-HyPaque 密度梯度離心法制備PBMCs。細(xì)胞用RPMI1640完全培養(yǎng)液(100 U/L青霉素,鏈霉素100 U/L和10%小牛血清)重懸,然后分別接種于24孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞濃度為1×106cells/ml。然后加入終濃度為10 ng/ml重組IL-33,混勻,37℃ 5%CO2孵育5 d。最后收集細(xì)胞,流式細(xì)胞儀測定CD8+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞頻率,PCR檢測FoxP3 mRNA水平。

    表2 外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例及PBMCs FoxP3 mRNA水平比較

    Note:1)P<0.05,MPE and SPE versus HP;2)P<0.05,MPE vers-us SPE.

    2 結(jié)果

    2.1PE患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞頻率檢測 與HP組相比,MPE及SPE患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞比例均顯著降低,但SPE組降低更明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

    2.2Real-time PCR檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞FoxP3 mRNA 與HP組對比,MPE及SPE組PBMCs FoxP3 mRNA表達(dá)水平均降低,但SPE 組降低更明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。PE組CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與PBMCs FoxP3 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(t=0.779,P<0.05),見圖2。

    2.3PE患者外周血細(xì)胞因子濃度檢測 與HP組相比,MPE組和SPE組血清IL-6、IL-17A濃度均升高,但SPE組升高更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HP組相比,MPE和SPE組血清TGF-β濃度均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但MPE和SPE組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。三組血清IL-10、IL-33及IL-1β濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

    2.4PE患者CD8+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞比例與血清細(xì)胞因子相關(guān)性分析 PE患者CD8+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞比例與血清IL-33濃度呈正相關(guān)(r=0.548,P=0.001);與IL-17A呈負(fù)相關(guān)(r=-0.338,P=0.021);與IL-6 (r=0.019,P=0.896)、IL-10(r=0.201,P=0.181)、IL-1β(r=0.103,P=0.496)及TGF-β (r=0.196,P=0.192)濃度不相關(guān)。

    2.5IL-33誘導(dǎo)CD8+CD25+FoxP3+Treg增殖 與空白對照組相比,IL-33刺激5 d后,PBMCs中CD8+CD25+FoxP3+Treg比例和FoxP3mRNA表達(dá)水平顯著增高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。

    圖2 PE患者CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與PBMCs FoxP3 mRNA相關(guān)性Fig.2 Correlations between percentage of CD8+CD25+FoxP3+Treg and FoxP3 mRNA expression in PBMCs from PE patients

    表3 血清細(xì)胞因子濃度比較

    Note:1)P<0.05,MPE and SPE versus HP;2)P<0.05,MPE versus SPE.

    表4 IL-33誘導(dǎo)CD8+CD25+FoxP3+Treg增殖

    Note:1)P<0.05,IL-33 group versus control group.

    3 討論

    子癇前期的發(fā)病機(jī)制與母體對胎兒不能產(chǎn)生足夠的免疫耐受有關(guān),胎兒對母體是一種同種半異體移植物,導(dǎo)致母體系統(tǒng)性炎癥反應(yīng),引起高血壓和蛋白尿[2]。FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可根據(jù)細(xì)胞表面CD4、CD8分為CD4+FoxP3+Treg和CD8+FoxP3+Treg。較多研究證實(shí)子癇前期的發(fā)生發(fā)展與CD4+Tregs數(shù)量減少和抑制功能下降有關(guān)[3,6]。CD8+CD25+FoxP3+Treg與CD4+CD25+FoxP3+Treg有相似的表型、功能和作用機(jī)制,能夠通過細(xì)胞表面高表達(dá)的膜結(jié)合型TGF-β和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4 (CTLA-4)介導(dǎo)的接觸依賴性方式,或者通過分泌IL-10、 TGF-β 等細(xì)胞因子,發(fā)揮非特異性免疫抑制功能[7]。

    本研究表明,與正常妊娠組相比,PE患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞比例顯著降低。叉頭狀蛋白轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是Treg細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,F(xiàn)oxP3表達(dá)對Tregs細(xì)胞發(fā)育和抑制功能的發(fā)揮起著關(guān)鍵作用。過繼表達(dá)FoxP3的CD4+T細(xì)胞對自身免疫等疾病的防治有顯著療效[8]。本研究證實(shí),與正常妊娠者相比,子癇前期患者外周血單個(gè)核細(xì)胞FoxP3mRNA水平明顯減少,其他研究者也有相似的報(bào)道[9]。本次研究還證實(shí)PE患者PBMCs FoxP3mRNA表達(dá)水平與CD8+CD25+FoxP3+Treg比例呈正相關(guān)。

    調(diào)節(jié)T細(xì)胞合成和分泌高濃度的抑炎性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β等,從而發(fā)揮非特異性免疫抑制功能。正常妊娠時(shí),母胎界面高濃度的IL-10能產(chǎn)生同種異體免疫耐受作用,從而抑制母體對胎兒產(chǎn)生免疫排斥[10]。Weel等[11]將胎盤組織經(jīng)勻漿處理,發(fā)現(xiàn)與正常妊娠者相比,PE患者胎盤組織IL-10濃度顯著降低,且晚發(fā)型PE患者TNF-α/IL-10比例顯著低于早發(fā)型PE患者,提示PE患者胎盤組織存在炎癥損傷。 本研究發(fā)現(xiàn)檢測PE患者外周血IL-10濃度與正常對照組無差異,與CD8+CD25+FoxP3+Treg也不存在相關(guān)性,可能的原因是IL-10可由CD4+Treg、CD8+Treg、絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生。

    與CD4+Th細(xì)胞相似,CD8+T細(xì)胞分為Tc1、Tc2、Tc9、Tc17和CD8+Treg。CD8+初始T細(xì)胞朝著不同亞群分化的方向取決于抗原性質(zhì)和強(qiáng)度、協(xié)同刺激分子和細(xì)胞因子。TGF-β 能誘使CD8+初始T細(xì)胞向CD8+Treg細(xì)胞分化,但在IL-6和TGF-β同時(shí)存在時(shí)則可分化為Tc17,在TGF-β和IL-4存在的條件下分化為Tc9[12]。Feizollahzadeh等[13]研究表明,子癇前期患者存在TGF-β1基因多肽性,而且血清TGF-β濃度明顯升高。本次研究也證實(shí),PE受試者血清TGF-β的表達(dá)顯著高于健康妊娠組。

    PE患者血清TGF-β水平顯著升高,但CD8+Treg顯著降低,其機(jī)制可能是受患者體內(nèi)高濃度IL-6影響。Luppi等[14]也證實(shí),與正常孕婦相比,PE患者的單核細(xì)胞可分泌高濃度IL-6。Pasare等[15]發(fā)現(xiàn),IL-6/高濃度IL-6抑制CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的免疫抑制作用,其機(jī)制可能是IL-6/高濃度IL-6能誘導(dǎo)CD4+Treg 前體細(xì)胞朝著Th17細(xì)胞分化[6,16],Santner-Nanan等[17]證實(shí),PE患者體內(nèi) Th17細(xì)胞比例明顯增加,而CD4+Treg細(xì)胞比例明顯降低。本次研究也證實(shí),子癇前期患者外周血IL-6和IL-17升高,與Darmochwal-Kolarz等[18]研究結(jié)果一致。本次研究還證實(shí),CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與IL-17呈負(fù)相關(guān),提示IL-6可能誘導(dǎo)CD4+Treg、CD8+Treg分別向Th17細(xì)胞和Tc17細(xì)胞分化。也提示Th17/Treg 細(xì)胞是一對相關(guān)的T淋巴細(xì)胞亞群,共同參與維持體內(nèi)免疫功能動(dòng)態(tài)平衡。

    IL-33是IL-1家族的新成員,是一種多功能蛋白[19]。ST2是IL-33細(xì)胞膜受體,IL-33促進(jìn)Treg細(xì)胞表達(dá)ST2,并增強(qiáng)其免疫抑制功能[20]。本次研究發(fā)現(xiàn)PE患者外周血中 IL-33水平與正常孕婦相比差異無顯著性,與Granne 等研究結(jié)果一致[21],同時(shí)還發(fā)現(xiàn)PE患者IL-33濃度與CD8+CD25+FoxP3+Treg比例呈正相關(guān)。通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),IL-33在體外能誘導(dǎo)CD8+CD25+FoxP3+Treg增殖。Matta等[20,22]研究發(fā)現(xiàn),IL-33可以促進(jìn)樹突狀細(xì)胞分泌IL-2,導(dǎo)致CD4+FoxP3+Treg細(xì)胞增殖;還發(fā)現(xiàn)IL-33可以在體內(nèi)外增加CD4+Treg的抑制功能。在本次研究中,PE患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg顯著降低,而IL-33濃度正常,其機(jī)制可能是PE患者體內(nèi)sST2顯著增加[19]。sST2是ST2的可溶性變體,可作為 IL-33的誘餌受體從而抑制IL-33的功能。

    綜上所述,本次研究表明,與健康妊娠者相比,PE患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞比例顯著降低,其相應(yīng)FoxP3mRNA表達(dá)水平也降低,血清IL-6和IL-17濃度顯著升高。PE患者CD8+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞比例與外周血IL-33濃度呈正相關(guān),與IL-17濃度呈負(fù)相關(guān),通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),IL-33可誘導(dǎo)外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg+增殖。這些結(jié)果表明CD8+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞比例減少及相應(yīng)FoxP3mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)降低,減弱Treg免疫抑制功能,在子癇前期的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮一定的作用。為此,推測通過對PE患者CD8+Treg細(xì)胞分化及功能調(diào)控免疫平衡正常化,為探索子癇前期發(fā)病機(jī)制及治療提供新的思路及治療可能的新途徑。

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    [收稿2016-11-10 修回2016-12-10]

    (編輯 許四平)

    ChangeandsignificanceofCD8+CD25+FoxP3+regulatorTcellsinperipheralbloodofpatientswithpre-eclampsia

    YUJian-Xiu,WANGHong-You,QIANLei,CHENWei,SUNHai-Ling.DepartmentofLaboratoryMedicine,BinhaiCountryPeople′sHospital,Yancheng224500,China

    Objective:To explore the role of CD8+CD25+FoxP3+regulator T cells(Treg) in the pathogenesis of pre-eclampsia (PE) in peripheral blood.Methods:This study included 24 gestational-age-matched healthy pregnant women and 46 pregnant women diagnosed with mild PE (MPE,n=24) or severe PE (SPE,n=22) during the third trimester of gestation.An 3 ml sample of peripheral blood was drawn from each subject and anti-coagulated with heparin sodium.The percentage of CD8+CD25+FoxP3+Treg cells was detected by flow cytometry.The cytokines IL-6,IL-17A,IL-10,IL-1,IL-33 and TGF-β1 were detected using Luminex200.Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from healthy controls and treated with IL-33,the percentages of CD8+CD25+FoxP3+Treg cell were measured by flow cytometric detection.Results:Compared to that of healthy pregnant controls [0.48(0.21-0.96)%],MPE patients [0.32(0.19-0.63)%] and SPE patients [0.13(0.02-0.41)%] had lower percentages of CD8+CD25+FoxP3+Treg cells (P<0.05).Compared to HP controls,higher levels of IL-6 and IL-17A were found in MPE and SPE patients(P<0.05) and even higher in SPE patients.The levels of IL-10,IL-1β and IL-33 were similar in all three groups (P>0.05).Compared to HP controls,the levels of TGF-β1 was significantly increased in SPE and MPE patients(P<0.05),but no significant differences were found between these two groups (P>0.05).The percentage of CD8+CD25+FoxP3+Treg cells showed a negative correlation with the serum concentrations of IL-17A (r=-0.338,P=0.338),and a positive correlation with the serum concentrations of IL-33 (r=0.548,P=0.548).After PBMCs were treated with IL-33 for five days,the percentages of CD8+CD25+FoxP3+Treg were significantly higher than those of the controls(P<0.05).Conclusion:These findings suggested that the reduced CD8+CD25+FoxP3+Treg cells may play a role in the pathogenesis of pre-eclampsia.

    Pre-eclampsia;CD8+CD25+FoxP3+Treg;IL-17;IL-33

    10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.019

    ①本文為鹽城醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項(xiàng)目(YK2015065)。

    ②濱??h人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,鹽城224500。

    ③通訊作者,E-mail:qianleiyc@163.com。

    于建秀(1984年-),女,碩士,主管技師,主要從事免疫學(xué)方面的研究。

    R392

    A

    1000-484X(2017)06-0900-05

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