子癇前期患者外周血CD8+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)T細胞的變化及意義①

于建秀 汪洪友 錢 雷 陳 瑋 孫海玲

(濱?？h人民醫(yī)院檢驗科，鹽城224500)

子癇前期患者外周血CD8+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)T細胞的變化及意義①

于建秀 汪洪友②錢 雷 陳 瑋 孫海玲③

(濱?？h人民醫(yī)院檢驗科，鹽城224500)

目的：探討外周血CD8+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)T細胞(Treg)在子癇前期(PE)疾病過程中的作用。方法：研究對象包括子癇前期孕晚期患者46例，其中輕度子癇24例(MPE組)，重度子癇22例(SPE組)，并選擇24例與患者孕齡匹配的健康孕婦作為對照組(HP組)。流式細胞儀檢測分析外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例；Luminex200檢測血清IL-6、 IL-17A、IL-10、IL-1β、IL-33和TGF-β1濃度。分離10例健康對照者單個核細胞(PBMCs)，IL-33刺激培養(yǎng)后檢測CD8+CD25+FoxP3+Treg比例的變化。結果：MPE和SPE組CD8+CD25+FoxP3+Treg比例分別為[0.32(0.19-0.63)%]、[0.13(0.02-0.41)%]，兩組均低于HP組[0.48(0.21-0.96)%]，三組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與HP組相比，MPE組和SPE組血清IL-6、IL-17A濃度均升高，且SPE組患者血清IL-6、IL-17A濃度升高更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；IL-10、IL-1β和IL-33濃度在HP、MPE及SPE三組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與HP對照者相比，MPE和SPE組血清TGF-β濃度均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但MPE和SPE組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PE患者CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與血清IL-17A負相關(r=-0.338,P=0.021)，與IL-33正相關(r=0.548,P=0.001)。PBMCs用IL-33刺激5 d后，與空白對照組相比，CD8+CD25+FoxP3+Treg比例顯著增高(P<0.05)。結論：子癇前期患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞比例降低可能在其疾病過程中發(fā)揮重要作用。

子癇前期；CD8+CD25+FoxP3+Treg；IL-17；IL-33

子癇前期(Preeclampsia,PE)指孕婦妊娠前血壓正常，妊娠后出現(xiàn)高血壓和蛋白尿等臨床癥狀，發(fā)病率約5%～10%，是孕產(chǎn)婦及胎兒發(fā)病和死亡的主要原因之一[1]。研究表明子癇前期等病理妊娠的發(fā)生與母體免疫系統(tǒng)對胎兒的免疫耐受異常有關，導致母胎界面免疫損傷和母體系統(tǒng)性炎癥反應[2]。FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是維持免疫耐受的主要效應細胞，可抑制其他免疫細胞的增生、活化和效應功能，抑制炎癥反應，具有保持免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能[3,4]。較多研究表明CD4+FoxP3+Treg細胞參與子癇前期的發(fā)生發(fā)展[1,3]，但CD8+FoxP3+Treg在PE疾病過程中的作用缺乏研究。本次研究通過檢測PE患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞比例，并分析其與血清細胞因子相關性，探討其在PE疾病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1研究對象 選取2015年9月～2016年3月在濱?？h人民醫(yī)院診斷為子癇前期的孕晚期患者共46例,其中輕度子癇(MPE)24例，重度子癇(SPE) 22例，并選擇孕齡匹配的健康孕婦24例作為對照組。PE診斷標準及分類參照第八版《婦產(chǎn)科學》[5]。排除標準為：使用免疫抑制藥物或患有免疫系統(tǒng)疾病。各組均無近期感染史，無胎膜破裂或雙胎。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準 (倫研2015-03)，獲得受試者書面知情同意。各組受試者年齡及孕齡差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。臨床特征見表1。

1.1.2儀器及試劑 異硫氰酸熒光素(FITC)鼠抗人-CD3單克隆抗體(mAb)、葉綠素蛋白偶聯(lián)物(PerCP-cy5.5)鼠抗人-CD8 mAb、別藻青蛋白(APC)鼠抗人-CD25 mAb、藻紅蛋白(PE)鼠抗人-FoxP3 mAb及同型對照、紅細胞裂解液均購自美國BD公司；血清細胞因子IL-6、 IL-17A、IL-10、IL-1β、IL-33和TGF-β1購自美國Bio-Rad公司；cDNA反轉錄試劑盒購自Applied Biosystems；Trizol購自Invitrogen公司；Ficoll-HyPaque分離液購自上海恒信試劑有限公司；尿微量白蛋白采用BNProSpec特定蛋白分析儀及配套試劑檢測。流式細胞儀購自BD公司；Luminex200流式熒光檢測分析儀購自Luminex公司。

表1 研究對象臨床資料

Note：1)P<0.05 MPE and SPE versus HP;2)P<0.05 MPE versus SPE.

1.2方法

1.2.1流式細胞儀檢測外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞比例 取100 μl肝素抗凝靜脈血，分別加入10 μl FITC鼠抗人-CD3 mAb、10 μl PerCP-cy5.5鼠抗人-CD8 mAb、10 μl APC-鼠抗人CD25 mAb及同型對照，室溫避光孵育30 min。紅細胞裂解液破壞紅細胞后，1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，離心棄上清。每管加入250 μl 1×Fix/Perm buffer 渦旋約3 s，避光孵育40 min，加入300 μl 1×Perm/wash buffer洗滌，離心棄上清。100 μl Perm/wash buffer 重懸細胞，加10 μl PE-Foxp3 mAb，室溫避光孵育40 min。洗滌離心，棄上清。400 μl PBS重懸細胞，立即上機檢測。以淋巴細胞(圖1A)設門，分選出CD3+CD8+T細胞(圖1B)，檢測CD8+CD25+T細胞(圖1)及CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞(圖1D)。

1.2.2RNA提取及RT-PCR檢測：用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法制備外周血單個核細胞(PBMCs)，使用Trizol試劑提取總RNA。采用 cDNA反轉錄試劑盒進行 cDNA合成，利用QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒進行擴增。引物序列設計如下：FoxP3，sense：5′-TGAGAAGGACAGGGAGCCAA-3′，antisense：5′-GAGAAGCTGAGTGCC-ATGCA-3′；β-actin sense：5′-TGGCACCCAGCACA-ATGAA-3′，antisense：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTA-GAAGCA-3′。熱循環(huán)條件如下：95°C 1 min，95°C 40個循環(huán) 15 s，60°C 1 min。根據(jù)2-ΔΔCt值計算樣本中FoxP3 mRNA 相對表達水平。

圖1 CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞檢測Fig.1 Detection of CD8+CD25+FoxP3+Treg cellsNote:A.Lymphocyte were gated based on FSC and SSC (R1);B.Plots showing CD8+ lymphocyte (R2) on gated CD3+ lymphocytes;C.Plots showing CD25 expression on gated CD8+ lymphocytes (R5);D.Plots showing FoxP3 expression on gated CD8+CD25+ lymphocytes (R7).

1.2.3Luminex液相芯片檢測血清細胞因子濃度 收集外周血2 ml，1 500 r/min離心5 min，收集血漿，立即儲存于-80℃冰箱。按試劑說明書檢測TGF-β、IL-10、IL-17A、IL-1β、IL-33、和IL-6濃度，每個標本檢測2次，取均值。

1.2.4IL-33誘導CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞增殖 收集10位健康對照者外周血4 ml，通過Ficoll-HyPaque 密度梯度離心法制備PBMCs。細胞用RPMI1640完全培養(yǎng)液(100 U/L青霉素，鏈霉素100 U/L和10%小牛血清)重懸，然后分別接種于24孔培養(yǎng)板中，細胞濃度為1×106cells/ml。然后加入終濃度為10 ng/ml重組IL-33，混勻，37℃ 5%CO2孵育5 d。最后收集細胞，流式細胞儀測定CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞頻率，PCR檢測FoxP3 mRNA水平。

表2 外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg比例及PBMCs FoxP3 mRNA水平比較

Note：1)P<0.05，MPE and SPE versus HP;2)P<0.05，MPE vers-us SPE.

2 結果

2.1PE患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞頻率檢測 與HP組相比，MPE及SPE患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞比例均顯著降低，但SPE組降低更明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

2.2Real-time PCR檢測外周血單個核細胞FoxP3 mRNA 與HP組對比，MPE及SPE組PBMCs FoxP3 mRNA表達水平均降低，但SPE 組降低更明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。PE組CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與PBMCs FoxP3 mRNA表達水平呈正相關(t=0.779,P<0.05)，見圖2。

2.3PE患者外周血細胞因子濃度檢測 與HP組相比，MPE組和SPE組血清IL-6、IL-17A濃度均升高，但SPE組升高更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與HP組相比，MPE和SPE組血清TGF-β濃度均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但MPE和SPE組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。三組血清IL-10、IL-33及IL-1β濃度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.4PE患者CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞比例與血清細胞因子相關性分析 PE患者CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞比例與血清IL-33濃度呈正相關(r=0.548,P=0.001)；與IL-17A呈負相關(r=-0.338,P=0.021)；與IL-6 (r=0.019,P=0.896)、IL-10(r=0.201,P=0.181)、IL-1β(r=0.103,P=0.496)及TGF-β (r=0.196,P=0.192)濃度不相關。

2.5IL-33誘導CD8+CD25+FoxP3+Treg增殖 與空白對照組相比，IL-33刺激5 d后，PBMCs中CD8+CD25+FoxP3+Treg比例和FoxP3mRNA表達水平顯著增高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

圖2 PE患者CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與PBMCs FoxP3 mRNA相關性Fig.2 Correlations between percentage of CD8+CD25+FoxP3+Treg and FoxP3 mRNA expression in PBMCs from PE patients

表3 血清細胞因子濃度比較

Note：1)P<0.05，MPE and SPE versus HP;2)P<0.05，MPE versus SPE.

表4 IL-33誘導CD8+CD25+FoxP3+Treg增殖

Note：1)P<0.05，IL-33 group versus control group.

3 討論

子癇前期的發(fā)病機制與母體對胎兒不能產(chǎn)生足夠的免疫耐受有關，胎兒對母體是一種同種半異體移植物，導致母體系統(tǒng)性炎癥反應，引起高血壓和蛋白尿[2]。FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞可根據(jù)細胞表面CD4、CD8分為CD4+FoxP3+Treg和CD8+FoxP3+Treg。較多研究證實子癇前期的發(fā)生發(fā)展與CD4+Tregs數(shù)量減少和抑制功能下降有關[3,6]。CD8+CD25+FoxP3+Treg與CD4+CD25+FoxP3+Treg有相似的表型、功能和作用機制，能夠通過細胞表面高表達的膜結合型TGF-β和細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (CTLA-4)介導的接觸依賴性方式，或者通過分泌IL-10、 TGF-β 等細胞因子，發(fā)揮非特異性免疫抑制功能[7]。

本研究表明，與正常妊娠組相比，PE患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞比例顯著降低。叉頭狀蛋白轉錄因子Foxp3是Treg細胞關鍵轉錄因子，F(xiàn)oxP3表達對Tregs細胞發(fā)育和抑制功能的發(fā)揮起著關鍵作用。過繼表達FoxP3的CD4+T細胞對自身免疫等疾病的防治有顯著療效[8]。本研究證實，與正常妊娠者相比，子癇前期患者外周血單個核細胞FoxP3mRNA水平明顯減少，其他研究者也有相似的報道[9]。本次研究還證實PE患者PBMCs FoxP3mRNA表達水平與CD8+CD25+FoxP3+Treg比例呈正相關。

調(diào)節(jié)T細胞合成和分泌高濃度的抑炎性細胞因子IL-10和TGF-β等，從而發(fā)揮非特異性免疫抑制功能。正常妊娠時，母胎界面高濃度的IL-10能產(chǎn)生同種異體免疫耐受作用，從而抑制母體對胎兒產(chǎn)生免疫排斥[10]。Weel等[11]將胎盤組織經(jīng)勻漿處理，發(fā)現(xiàn)與正常妊娠者相比，PE患者胎盤組織IL-10濃度顯著降低，且晚發(fā)型PE患者TNF-α/IL-10比例顯著低于早發(fā)型PE患者，提示PE患者胎盤組織存在炎癥損傷。 本研究發(fā)現(xiàn)檢測PE患者外周血IL-10濃度與正常對照組無差異，與CD8+CD25+FoxP3+Treg也不存在相關性，可能的原因是IL-10可由CD4+Treg、CD8+Treg、絨毛滋養(yǎng)層細胞等多種免疫細胞產(chǎn)生。

與CD4+Th細胞相似，CD8+T細胞分為Tc1、Tc2、Tc9、Tc17和CD8+Treg。CD8+初始T細胞朝著不同亞群分化的方向取決于抗原性質(zhì)和強度、協(xié)同刺激分子和細胞因子。TGF-β 能誘使CD8+初始T細胞向CD8+Treg細胞分化，但在IL-6和TGF-β同時存在時則可分化為Tc17，在TGF-β和IL-4存在的條件下分化為Tc9[12]。Feizollahzadeh等[13]研究表明，子癇前期患者存在TGF-β1基因多肽性，而且血清TGF-β濃度明顯升高。本次研究也證實，PE受試者血清TGF-β的表達顯著高于健康妊娠組。

PE患者血清TGF-β水平顯著升高，但CD8+Treg顯著降低，其機制可能是受患者體內(nèi)高濃度IL-6影響。Luppi等[14]也證實，與正常孕婦相比，PE患者的單核細胞可分泌高濃度IL-6。Pasare等[15]發(fā)現(xiàn)，IL-6/高濃度IL-6抑制CD4+CD25+Treg 細胞的免疫抑制作用，其機制可能是IL-6/高濃度IL-6能誘導CD4+Treg 前體細胞朝著Th17細胞分化[6，16]，Santner-Nanan等[17]證實，PE患者體內(nèi) Th17細胞比例明顯增加，而CD4+Treg細胞比例明顯降低。本次研究也證實，子癇前期患者外周血IL-6和IL-17升高，與Darmochwal-Kolarz等[18]研究結果一致。本次研究還證實，CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與IL-17呈負相關，提示IL-6可能誘導CD4+Treg、CD8+Treg分別向Th17細胞和Tc17細胞分化。也提示Th17/Treg 細胞是一對相關的T淋巴細胞亞群，共同參與維持體內(nèi)免疫功能動態(tài)平衡。

IL-33是IL-1家族的新成員，是一種多功能蛋白[19]。ST2是IL-33細胞膜受體，IL-33促進Treg細胞表達ST2，并增強其免疫抑制功能[20]。本次研究發(fā)現(xiàn)PE患者外周血中 IL-33水平與正常孕婦相比差異無顯著性，與Granne 等研究結果一致[21]，同時還發(fā)現(xiàn)PE患者IL-33濃度與CD8+CD25+FoxP3+Treg比例呈正相關。通過體外實驗證實，IL-33在體外能誘導CD8+CD25+FoxP3+Treg增殖。Matta等[20，22]研究發(fā)現(xiàn)，IL-33可以促進樹突狀細胞分泌IL-2，導致CD4+FoxP3+Treg細胞增殖；還發(fā)現(xiàn)IL-33可以在體內(nèi)外增加CD4+Treg的抑制功能。在本次研究中，PE患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg顯著降低，而IL-33濃度正常，其機制可能是PE患者體內(nèi)sST2顯著增加[19]。sST2是ST2的可溶性變體，可作為 IL-33的誘餌受體從而抑制IL-33的功能。

綜上所述，本次研究表明，與健康妊娠者相比，PE患者外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞比例顯著降低,其相應FoxP3mRNA表達水平也降低，血清IL-6和IL-17濃度顯著升高。PE患者CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞比例與外周血IL-33濃度呈正相關，與IL-17濃度呈負相關，通過體外實驗證實，IL-33可誘導外周血CD8+CD25+FoxP3+Treg+增殖。這些結果表明CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞比例減少及相應FoxP3mRNA轉錄水平表達降低，減弱Treg免疫抑制功能，在子癇前期的發(fā)病機制中可能發(fā)揮一定的作用。為此，推測通過對PE患者CD8+Treg細胞分化及功能調(diào)控免疫平衡正常化，為探索子癇前期發(fā)病機制及治療提供新的思路及治療可能的新途徑。

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[收稿2016-11-10 修回2016-12-10]

(編輯 許四平)

ChangeandsignificanceofCD8+CD25+FoxP3+regulatorTcellsinperipheralbloodofpatientswithpre-eclampsia

YUJian-Xiu,WANGHong-You,QIANLei,CHENWei,SUNHai-Ling.DepartmentofLaboratoryMedicine，BinhaiCountryPeople′sHospital,Yancheng224500,China

Objective:To explore the role of CD8+CD25+FoxP3+regulator T cells(Treg) in the pathogenesis of pre-eclampsia (PE) in peripheral blood.Methods:This study included 24 gestational-age-matched healthy pregnant women and 46 pregnant women diagnosed with mild PE (MPE,n=24) or severe PE (SPE,n=22) during the third trimester of gestation.An 3 ml sample of peripheral blood was drawn from each subject and anti-coagulated with heparin sodium.The percentage of CD8+CD25+FoxP3+Treg cells was detected by flow cytometry.The cytokines IL-6,IL-17A,IL-10,IL-1,IL-33 and TGF-β1 were detected using Luminex200.Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from healthy controls and treated with IL-33,the percentages of CD8+CD25+FoxP3+Treg cell were measured by flow cytometric detection.Results:Compared to that of healthy pregnant controls [0.48(0.21-0.96)%],MPE patients [0.32(0.19-0.63)%] and SPE patients [0.13(0.02-0.41)%] had lower percentages of CD8+CD25+FoxP3+Treg cells (P<0.05).Compared to HP controls,higher levels of IL-6 and IL-17A were found in MPE and SPE patients(P<0.05) and even higher in SPE patients.The levels of IL-10,IL-1β and IL-33 were similar in all three groups (P>0.05).Compared to HP controls,the levels of TGF-β1 was significantly increased in SPE and MPE patients(P<0.05),but no significant differences were found between these two groups (P>0.05).The percentage of CD8+CD25+FoxP3+Treg cells showed a negative correlation with the serum concentrations of IL-17A (r=-0.338,P=0.338),and a positive correlation with the serum concentrations of IL-33 (r=0.548,P=0.548).After PBMCs were treated with IL-33 for five days,the percentages of CD8+CD25+FoxP3+Treg were significantly higher than those of the controls(P<0.05).Conclusion:These findings suggested that the reduced CD8+CD25+FoxP3+Treg cells may play a role in the pathogenesis of pre-eclampsia.

Pre-eclampsia;CD8+CD25+FoxP3+Treg;IL-17;IL-33

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.019

①本文為鹽城醫(yī)學科技發(fā)展項目(YK2015065)。

②濱海縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，鹽城224500。

③通訊作者，E-mail：qianleiyc@163.com。

于建秀(1984年-)，女，碩士，主管技師，主要從事免疫學方面的研究。

R392

A

1000-484X(2017)06-0900-05