乙型肝炎患者治療前后外周血CD4+CD25+TregsTCRCDR3譜系漂移特征分析①

潘宗琴 呂 紅 莊勤建 姚新生 邱隆敏

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科，遵義563003)

乙型肝炎患者治療前后外周血CD4+CD25+TregsTCRCDR3譜系漂移特征分析①

潘宗琴 呂 紅 莊勤建 姚新生②邱隆敏

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科，遵義563003)

目的：探討AHB患者急性期及恢復(fù)期、CHB患者恩替卡韋治療前后外周血PBMC中 CD4+CD25+Tregs TCR CDR3譜系漂移特征的變化。方法：采集4例正常人、3例AHB患者(急性期和恢復(fù)期)及4 例CHB患者恩替卡韋治療前后外周抗凝靜脈血，分離外周血PBMC；磁珠分選法分選CD4+CD25+Tregs，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；根據(jù)TCR β鏈24個(gè)可變區(qū)基因 (TRBV)家族設(shè)計(jì)相應(yīng)的上游引物，并在β鏈恒定區(qū)(BC)設(shè)計(jì)一條共用的FAM熒光標(biāo)記下游引物及對(duì)照引物。PCR擴(kuò)增出24個(gè)包含完整CDR3區(qū)的TRBV家族的PCR產(chǎn)物，電泳鑒定目的片段； PCR產(chǎn)物送上?；涤妹?xì)管電泳法進(jìn)行基因掃描；用Peak Scanner Software v1.0軟件分析研究對(duì)象TRBV家族CDR3譜系特征；采用配對(duì)t檢驗(yàn)(paired-samplettest)檢測(cè)AHB患者急性期及恢復(fù)期、CHB患者恩替卡韋治療前后TRBV家族譜系漂移率差異。結(jié)果：3例AHB患者急性期呈現(xiàn)普遍譜系漂移的TRBV4、10、14、16、19家族在恢復(fù)期多轉(zhuǎn)變?yōu)檎龖B(tài)的多峰譜型，AHB患者恢復(fù)期外周血CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3譜型漂移率顯著低于急性期 (t=9.456，P=0.011)；TRBV8、11、13.2、15、16、18、20在3例CHB患者抗HBV治療前出現(xiàn)克隆增生，TRBV1、5.2、6、12、14、24在3例CHB患者抗HBV治療后出現(xiàn)克隆增生。CHB患者抗病毒治療后TRBV家族CDR3譜型漂移率高于治療前(t=-0.666，P=0.553)。結(jié)論：AHB患者急性期呈現(xiàn)譜系漂移的TRBV4、10、14、16、19家族在恢復(fù)期多轉(zhuǎn)變?yōu)檎龖B(tài)的多峰譜型，推測(cè)這種轉(zhuǎn)變可能與HBsAg、HBeAg轉(zhuǎn)陰相關(guān)。CHB患者在治療前TRBV8、11、13.2、15、16、18、20家族克隆增生的Tregs可能通過(guò)下調(diào)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，阻礙病毒清除；隨著藥物導(dǎo)致病毒載量的顯著下降，TRBV1、5.2、6、12、14、24家族克隆增生的Tregs可能更有助于誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)免疫耐受，導(dǎo)致HBV不能徹底清除。

慢性乙型肝炎；急性乙型肝炎；T淋巴細(xì)胞受體；互補(bǔ)決定區(qū)3；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；恩替卡韋

本研究采用免疫掃描譜系分析技術(shù)監(jiān)測(cè)急性乙型肝炎(Acute hepatitis B,AHB)患者急性期、恢復(fù)期及慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者恩替卡韋治療前后外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cells，Tregs) T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor，TCR) β鏈各家族互補(bǔ)決定區(qū)3(Complem-entarity-determining region 3，CDR3)譜系漂移特征的變化，探討AHB患者急性期、恢復(fù)期及CHB患者恩替卡韋治療前后Tregs應(yīng)答庫(kù)的組成信息的變化特點(diǎn)，以期為機(jī)體感染HBV后臨床預(yù)后、轉(zhuǎn)歸機(jī)制及評(píng)估提供新思路。

1 材料與方法

1.1病例選擇 4例正常人為健康獻(xiàn)血者，分別采集外周靜脈血10 ml。3例AHB患者、4例CHB患者均來(lái)自遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科門(mén)診/住院患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)為病毒性肝炎防治方案(2001年)[1]和2010年慢性乙型肝炎防治指南[2]。所有研究對(duì)象在納入研究前均未使用過(guò)抗病毒藥物及免疫調(diào)節(jié)劑；抗-HCV、抗-HEV、抗-HIV及EB抗體均為陰性；排除惡性腫瘤、內(nèi)分泌疾病及自身免疫性疾??；非孕婦或哺乳期婦女。在取得患者知情同意的前提情況下，分別采集AHB患者急性期、恢復(fù)期及CHB患者恩替卡韋(0.5 mg 口服 1次/d)治療0、12周外周靜脈抗凝血各10 ml，同時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)納入對(duì)象ALT、TBIL、HBV血清標(biāo)志物及HBV DNA。納入研究對(duì)象基本臨床資料詳見(jiàn)表1、2。

1.2方法

1.2.1分選CD4+CD25+CD127lowTregs并提取其RNA、合成cDNA 淋巴細(xì)胞離液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)分離研究對(duì)象10 ml外周靜脈血中外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，CD4+CD25+CD127-Treg分選試劑盒(德國(guó)Miltenyi Biotec公司)經(jīng)免疫磁珠負(fù)向和正向兩步法分選CD4+CD25+CD127lowTregs后按照CD4+-FITC、CD25+-PE、CD127+-PE-Cy5方案行抗體染色后上流式細(xì)胞儀鑒定其純度。RNA試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)提取CD4+CD25+CD127lowTregs中總RNA，嚴(yán)格按照cDNA合成試劑盒(美國(guó)Thermo公司)條件合成cDNA，每個(gè)樣本逆轉(zhuǎn)錄2管，反應(yīng)體系為40 μl。

表1 3例AHB患者的臨床基本資料

Note：0 w.Acute phase；12 w.Convalescent phase.

表2 4例CHB患者的基本臨床資料

Note：0 w.Before entecavir treatment；12 w.After entecavir treatment.

1.2.2TRBV 24家族CDR3區(qū)段cDNA PCR擴(kuò)增 參考相關(guān)文獻(xiàn)[3，4],設(shè)計(jì)合成TRBV 24家族各上游引物，和一條共用的含有FAM標(biāo)記的TRBC下游引物及陽(yáng)性對(duì)照GAPDH上、下游引物，由上海Invitrogen公司合成。PCR擴(kuò)增條件：94℃ 3 min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 50 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min 1個(gè)循環(huán)。

1.2.3TCR 鏈 24個(gè)BV家族免疫譜型分析 將目的PCR產(chǎn)物6 μl送上?；?康生物有限公司行免疫譜型基因掃描，并采用PeakScanner軟件對(duì)譜系圖進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 借助SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1正常人、AHB患者急性期及恢復(fù)期、CHB患者恩替卡韋治療前后外周血CD4+CD25+Tregs 24個(gè)TRBV家族CDR3譜系分析

2.1.14例正常人外周血CD4+CD25+Tregs 24個(gè)TRBV家族CDR3區(qū) PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖上于預(yù)測(cè)的200～300 bp片段處均顯示目的條帶(圖1)，3例AHB患者急性期、恢復(fù)期及4例CHB患者恩替卡韋治療前后外周血CD4+CD25+Tregs 24個(gè)TRBV家族CDR3區(qū) PCR產(chǎn)物除個(gè)別家族外在1.5%瓊脂糖凝膠電泳上，于預(yù)測(cè)200～300 bp片段處大部分顯示目的條帶(圖2、3)。余病例按同樣方法分析。

圖1 正常人-1 外周血CD4+CD25+Tregs 24個(gè)TRBV家族CDR3區(qū)和陽(yáng)性對(duì)照(GAPDH) PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 PCR products of 24 TRBV CDR3 family in CD4+CD25+Tregs of healthy control (HC)-1 and GAPDH analyzed respectively on 1.5% agarose gel by Gold-View staining

2.1.24例正常人外周血CD4+CD25+Tregs 24個(gè)TRBV家族CDR3譜系均呈現(xiàn)中間高兩邊低的多峰“鐘型”分布圖(圖4)。

2.1.33例AHB患者在急性期臨床癥狀明顯，ALT明顯升高，外周血中均能檢測(cè)到HBV DNA含量，HBsAg、HBeAg均為陽(yáng)性。12周后3例AHB患者臨床癥狀消失，肝功能恢復(fù)正常，HBV DNA均低于1.0×102U/ml，HBsAg、HBeAg均陰轉(zhuǎn)，病程轉(zhuǎn)入恢復(fù)期。3例AHB患者急性期及恢復(fù)期外周血CD4+CD25+Tregs 24個(gè)TRBV家族CDR3譜系均出現(xiàn)了不同程度的漂移。如AHB-1急性期TRBV1～TRBV24譜系圖中呈現(xiàn)數(shù)量不等的單峰譜型(BV9、16、21、24)、寡/偏峰譜型(BV4、6、10、14、15、18、19、22)，恢復(fù)期譜系漂移減少，呈現(xiàn)出少許數(shù)量不等的單峰譜型 (BV6、21)、寡/偏峰譜型(BV12、15)(圖5)。

2.1.44例CHB患者經(jīng)恩替卡韋治療后均獲得良好的生化、病毒應(yīng)答，抗HBV治療12周時(shí)4例CHB患者肝功能均恢復(fù)正常， HBV DNA均明顯降低。4例CHB患者ETV治療前后外周血CD4+CD25+Tregs 24個(gè)TRBV家族CDR3譜系均出現(xiàn)了不同程度的漂移。如CHB-1患者治療前TRBV1～TRBV24譜系圖中呈現(xiàn)數(shù)量不等的單峰譜型(BV2、10)、 寡/偏峰譜型(BV6、8、13.2、15、18)，而治療后TRBV1～TRBV24譜系圖中呈現(xiàn)數(shù)量不等的單峰譜型(BV11、13.1、16、24)、寡/偏峰譜型(BV1、3、5.2、14、23)(見(jiàn)圖6)。

圖2 AHB-1外周血CD4+CD25+Tregs 24個(gè)TRBV家族CDR3區(qū)和陽(yáng)性對(duì)照(GAPDH) PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 PCR products of 24 TRBV CDR3 family in CD4+CD25+Tregs of AHB-1 and GAPDH analyzed respectively on 1.5% agarose gel by Gold-View stainingNote: 0 w.Acute phase；12 w.Convalescent phase.

圖3 CHB-1外周血CD4+CD25+Tregs中24個(gè)TRBV家族CDR3區(qū)和陽(yáng)性對(duì)照(GAPDH) PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 PCR products of 24 TRBV CDR3 family in CD4+CD25+Tregs of CHB-1 and GAPDH analyzed respectively on 1.5% agarose gel by Gold-View stainingNote: 0 w.Before entecavir treatment；12 w.After entecavir treatment.

圖4 正常人外周血CD4+CD25+Tregs 24個(gè)TRBV家族CDR3基因掃描譜系圖Fig.4 GMSP of TRBV gene family in CD4+CD25+Tregs of healthy control(HC)-1 Note: The X-axis of each plot corresponds to the size of nucleotides and the relative fluorescence intensity of the peaks is shown on the Y axis.

2.2AHB患者急性期、恢復(fù)期及CHB患者恩替卡韋治療前后外周血CD4+CD25+Tregs 24個(gè)TRBV家族CDR3譜系漂移情況及其總體異常率 24個(gè)TRBV家族CDR3譜系克隆增生總體異常率=(單峰譜型數(shù)+寡峰譜型數(shù)+偏峰譜型數(shù))/26×100%。

2.2.13例AHB患者急性期、恢復(fù)期及4例CHB恩替卡韋治療前后外周血CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3 譜系漂移情況匯總，見(jiàn)表3、4。

2.2.1.1TRBV4、10、14、16、19在3例AHB患者急性期出現(xiàn)克隆增生。大多數(shù)急性期出現(xiàn)漂移的家族在恢復(fù)期多轉(zhuǎn)為正態(tài)的多峰譜型。3例AHB患者急性期平均譜型漂移率53.85±7.70；恢復(fù)期平均譜型漂移率21.79±5.88。AHB患者恢復(fù)期外周血CD4+CD25+Tregs 24個(gè)TRBV家族CDR3譜系譜型漂移率顯著低于急性期 (t=9.456，P=0.011)。

圖5 AHB-1患者外周血CD4+CD25+Tregs 24個(gè)TRBV家族CDR3基因掃描譜系圖Fig.5 GMSP of TRBV gene family in CD4+CD25+Tregs of AHB-1Note: The X-axis of each plot corresponds to the size of nucleotides and the relative fluorescence intensity of the peaks is shown on the Y axis.0 w.Acute phase；12 w.Convalescent phase.

圖6 CHB-1患者外周血CD4+CD25+Tregs 24個(gè)TRBV家族CDR3基因掃描譜系圖Fig.6 GMSP of TRBV gene family in CD4+CD25+Tregs of CHB-1Note: The X-axis of each plot corresponds to the size of nucleotides and the relative fluorescence intensity of the peaks is shown on the Y axis.0 w.Before entecavir treatment;12 w.After entecavir treatment.

表3 3例AHB患者外周血CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3譜系克隆增生總體異常率

Note：0 w.Acute phase；12 w.Convalescent phase.

表4 4例CHB患者外周血CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3譜系克隆增生總體異常率

Note：0 w.Before entecavir treatment;12 w.After entecavir treatment.

2.2.1.2納入研究4例CHB患者恩替卡韋治療前后外周血CD4+CD25+Tregs 24個(gè)TRBV家族均出現(xiàn)克隆增生，而治療前后出現(xiàn)克隆增生的家族分布不同。如：TRBV8、11、13.2、15、16、18、20在3例CHB患者抗HBV治療前出現(xiàn)克隆增生，TRBV1、5.2、6、12、14、24在3例CHB患者抗HBV治療后出現(xiàn)克隆增生。4例CHB患者ETV治療前平均譜型漂移率35.58±8.53；治療后平均譜型漂移率41.35±10.59。CHB患者外周血CD4+CD25+Tregs 24個(gè)TRBV家族CDR3譜系譜型漂移率升高，但其差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=-0.666，P=0.553)。

3 討論

有研究描述了CD4+CD25+Tregs在不同HBV感染狀態(tài)中扮演的角色、發(fā)揮的功能，它除了抑制CD4+、CD8+T細(xì)胞，也可抑制樹(shù)突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的增殖與活化，抑制IL-2等細(xì)胞因子分泌[5-8]，從而發(fā)揮其免疫負(fù)調(diào)功能參與機(jī)體感染HBV后免疫清除、免疫耐受等過(guò)程，在HBV感染的急性及慢性階段均發(fā)揮重要作用。TCR CDR3區(qū)的長(zhǎng)度及序列是決定T細(xì)胞抗原特異性和介導(dǎo)T細(xì)胞多樣性的關(guān)鍵因素[9]。在HBV感染的急性及慢性階段，CD4+CD25+Tregs通過(guò)抑制HBV特異性CD8+T細(xì)胞活化與增殖從而發(fā)揮重要作用[10，11]。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Tregs在不同HBV感染狀態(tài)中存在重要的潛在性作用。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上[13-15]，對(duì)AHB患者急性期、恢復(fù)期及CHB患者恩替卡韋治療前后外周血CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3譜系漂移特征進(jìn)行縱向分析，試圖了解CD4+CD25+Tregs免疫應(yīng)答在AHB不同病程中以及CHB抗病毒治療前后的變化特征。

本研究發(fā)現(xiàn)4例正常人外周血CD4+CD25+Tregs的24個(gè)TRBV家族CDR3區(qū)譜系圖多呈中間高兩邊低的“鐘形”正態(tài)多峰譜型。與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究[16]結(jié)論一致，其原因?yàn)檎Ｈ宋词艿酵鈦?lái)抗原(病原體)的特異性刺激，其TCR β鏈可變區(qū)基因表現(xiàn)為多克隆性增生，在譜型圖上呈現(xiàn)正態(tài)分布。而AHB、CHB患者外周血CD4+CD25+Tregs中24個(gè)TRBV家族CDR3區(qū)譜系圖均呈數(shù)量不等，形態(tài)不一的單峰、寡峰、偏峰譜型，其原因?yàn)闄C(jī)體感染HBV后，HBV抗原肽刺激TCR β鏈可變區(qū)基因產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)表達(dá)某些TRBV家族的Tregs，在譜型圖上表現(xiàn)為單峰、寡峰或者偏峰譜型。

3例AHB患者大部分急性期表現(xiàn)為單、寡/偏峰異常譜型的家族在恢復(fù)期多恢復(fù)為正態(tài)的多峰譜型，AHB患者恢復(fù)期外周血CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3譜型漂移率顯著低于急性期 (t=9.456，P=0.011)。推測(cè)其原因：在HBV感染的急性期，機(jī)體啟動(dòng)快速有效的抗病毒細(xì)胞免疫應(yīng)答，HBV得以有效清除，隨著病情恢復(fù)，HBV抗原成分消失，隨之HBV抗原對(duì)于Tregs克隆的刺激減弱，選擇性及針對(duì)性的Tregs克隆增生減少，因而大多數(shù)TRBV家族CDR3譜型恢復(fù)呈正態(tài)的多峰譜型，CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3譜系漂移率減少。3例AHB患者急性期呈普遍漂移，TRBV4、10、14、16、19家族在恢復(fù)期多轉(zhuǎn)變?yōu)檎龖B(tài)的多峰譜型，推測(cè)這種轉(zhuǎn)變可能與HBsAg、HBeAg轉(zhuǎn)陰相關(guān)。

4例CHB患者在恩替卡韋治療12周時(shí)均獲得良好的生化、病毒應(yīng)答，HBV DNA均明顯降低，ALT、TBIL均恢復(fù)正常。部分治療前為單、寡/偏峰異常譜型家族抗HBV治療后恢復(fù)為正態(tài)多峰譜型，推測(cè)經(jīng)有效的抗HBV治療，HBV DNA復(fù)制受抑制，HBV抗原成分減少，隨之HBV抗原對(duì)Tregs克隆的刺激削弱，原本發(fā)生的選擇性及針對(duì)性的Tregs克隆增生減少，一些TRBV家族CDR3譜型恢復(fù)呈正態(tài)的多峰譜型；也有部分抗病毒治療前呈正態(tài)多峰譜型的家族治療后變?yōu)楫惓ＷV型。推測(cè)CHB患者外周血中Tregs克隆性增生可能為多表位、多特異性的，可能存在多個(gè)HBV抗原參與了CHB患者不同階段的免疫應(yīng)答，不同病程的免疫應(yīng)答對(duì)于HBV抗原表位的利用不同，有效的抗病毒治療的進(jìn)程中，參與免疫應(yīng)答的HBV抗原表位數(shù)量發(fā)生了變化，隨之?dāng)?shù)目不同的HBV表位對(duì)Tregs克隆產(chǎn)生新的刺激，因而經(jīng)有效抗病毒治療CHB患者外周血CD4+CD25+Tregs 24個(gè)TRBV家族CDR3譜系譜型圖中呈現(xiàn)出新譜型漂移。研究發(fā)現(xiàn)CHB患者抗HBV治療前普遍出現(xiàn)譜系漂移的家族為T(mén)RBV8、11、13.2、15、16、18、20，推測(cè)這些家族克隆增生的Tregs可能通過(guò)下調(diào)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，阻礙病毒清除。隨著藥物導(dǎo)致病毒載量的顯著下降，治療后普遍出現(xiàn)譜系漂移的家族為T(mén)RBV1、5.2、6、12、14、24，推測(cè)家族克隆增生的Tregs可能更有助于誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)免疫耐受，導(dǎo)致HBV不能徹底清除，病程慢性化。

總之，AHB和CHB患者在治療前后均存在多個(gè)CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3譜型漂移，AHB患者急性期呈現(xiàn)譜系漂移的TRBV4、10、14、16、19家族在恢復(fù)期多轉(zhuǎn)變?yōu)檎龖B(tài)的多峰譜型，推測(cè)這種轉(zhuǎn)變可能與HBsAg、HBeAg轉(zhuǎn)陰相關(guān)。CHB患者在治療前TRBV8、11、13.2、15、16、18、20家族克隆增生的Tregs可能通過(guò)下調(diào)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，阻礙病毒清除；隨著藥物導(dǎo)致病毒載量的顯著下降，TRBV1、5.2、6、12、14、24家族克隆增生的Tregs可能更有助于誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)免疫耐受，導(dǎo)致HBV不能徹底清除。根據(jù)CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3譜系在AHB不同病程中以及CHB抗病毒治療前后的漂移特征可為機(jī)體感染HBV后臨床預(yù)后、轉(zhuǎn)歸機(jī)制及評(píng)估提供一些新思路，為挖掘抗HBV新的免疫治療靶點(diǎn)打下一定的基礎(chǔ)。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì).病毒性肝炎防治方案[J].中華傳染病雜志，2001，19(1)：56-62.

[2] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì),中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南(2010年版) [J].中華肝臟病雜志,2011，19(1):13-24.

[3] 姚新生，馬 驪，溫 茜，等.監(jiān)測(cè)TCR CDR3漂移的免疫掃描譜型分析技術(shù)的建立與鑒定[J].中華微生物和免疫學(xué)雜志，2006,26(4)：571-573.

[4] 胡云良，楊介鉆，倪 莉，等.正常人外周血αβT細(xì)胞TCR B鏈CDR3多態(tài)性和長(zhǎng)度分析[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2007,23(6)：492-498.

[5] Ralainirina N,Poli A,Michel T,etal.Control of NK cell functions by CD4+CD25+regulatory T cells [J].J Leukoc Biol，2007，81(1):144-153.

[6] Martinez-Sosa P,Mendoza L.The regulatory network that controls the differentiation of T lymphocytes [J].Biosystems， 2013，113(2):96-103.

[7] Ohkura N,Sakaguchi S.Regulatory T cells:roles of T cell receptor for their development and function [J].Semin Immunopathol，2010，32(2):95-106.

[8] Enarsson K,Johnsson E,Lindholm C,etal.Differential mechanisms for T lymphocyte recruitment in normal and neoplastic human gastric mucosa [J].Clin Immunol，2006，118(1):24-34.

[9] 楊介鉆,李蘭娟.TCR β鏈CDR3概況與感染性疾病的研究[J].國(guó)際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志,2009,36(1):56-58.

[10] Liang XS,Li CZ,Zhou Y,etal.Changes of Treg and Th17 cells balance in the development of acute and chronic hepatitis B virus infection [J].BMC Gastroenterol，2012，12(1)：43-51.

[11] Nan XP,Zhang Y,Yu HT,etal.Inhibition of viral replication downregulates CD4(+)CD25(high) regulatory T cells and programmed death-ligand 1 in chronic hepatitis B [J].Viral Immunol， 2012，25(1):21-28.

[12] Yang J,Yi P,Wei L,etal.Phenotypes and clinical significance of circulating CD4(+)CD25(+) regulatory T cells (Tregs) in patients with acute-on-chronic liver failure (ACLF) [J].J Transl Med，2012，(10)9:193-198.

[13] 陳 宇,姚新生,邱隆敏,等.抗病毒治療對(duì)CHB患者外周血TCRβ鏈CDR3譜系的影響[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2014，30(1):100-104,109.

[14] 莊勤建,呂 紅,潘宗琴,等.慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞受體CDR3譜系的特征分析[J].中華肝臟病雜志，2015，23(8)：628-630.

[15] 伍紹強(qiáng),姚新生,邱隆敏,等.慢性乙型肝炎患者外周血及肝組織中T淋巴細(xì)胞受體β鏈互補(bǔ)決定區(qū)3譜系分析[J].中華傳染病雜志，2010，28(6):348-353.

[16] Fujishima M,Hirokawa M,Fujishima N,etal.TCR alphabeta repertoire diversity of human naturally occurring CD4+CD25+regulatory T cells [J].La Revue de Medecine Interne，2005，99(2):193-197.

[收稿2016-08-12 修回2016-12-05]

(編輯 倪 鵬)

SpectrumdriftcharacteristicsofCD4+CD25+TregsTCRCDR3inhepatitisBpatientsbeforeandaftertreatment

PANZong-Qin,LüHong,ZHUANGQin-Jian,YAOXin-Sheng,QIULong-Min.DepartmentofInfection,ZunyiMedicalCollegeAffiliatedHospital,Zunyi563003,China

Objective:To determine the spectrum drift characteristics of CD4+CD25+Tregs TCR β chain CDR3 in patients with different phases of acute hepatitis B (AHB) and chronic hepatitis B(CHB) patients before and after the entecavir treatment.Methods:Anticoagulation venous blood was collected from 4 normal control subjects,3 AHB patients with acute phase and convalescent phase,and 4 CHB patients before and after the entecavir treatment;and peripheral blood mononuclear cells were isolated;CD4+CD25+Tregs were separated by using the magnetic beads,and total RNAs were extracted from CD4+CD25+Tregs and used for reverse transcription.The TRBV CDR3 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) with forward primers specific for 24 TRBV families and one fluorescence-labeled common reverse primer specific for the BC region.The PCR products were sent out for Genescan,and results were analyzed for the TRBV family CDR3 spectrum characteristics by using the Peak Scanner Software v1.0.Data were analyzed with the comparativet-test to perform the statistical analysis.Results:The CDR3 spectral types of the TRBV family showed drift characteristics in 3 cases of AHB patients with acute and convalescent phases;single/oligo peak spectral type family was observed in most of patients with acute phase;multiple peak spectral type was seen in patients with convalescent phase;and the common spectrum shift of TRBV4，10，14，16，19 families seen in patients with acute phase was changed to multiple peak spectral type.The clonal expansion of TRBV family in the CD4+CD25+Tregs in PBMC from AHB patients with convalescent phase was significantly lower than AHB patients with acute phase (t=9.456，P=0.011).The clonal expansion of Tregs TRBV13.2,15,16,18,20 family seen in CHB patients before treatment may interfere the virus removal through down-regulating the body′s immune response;and with the decline of viral load in serum after the antiviral treatment,the clonal expansion of Tregs TRBV1,5.2,6,12,14,24 family may help body induce immune tolerance and result in the HBV persistence.The clonal expansion of TRBV family in the CD4+CD25+Tregs in PBMC from of CHB patients after antiviral treatment was increased (t=-0.666,P=0.553).Conclusion:TRBV4,10,14,16,19 family of spectrum shift seen in AHB patients with acute phase was changed to multiple peak spectral type in patients with convalescent phase,suggesting this transition may be associated with HBsAg and HBeAg turning to negative.The clonal expansion of Tregs TRBV13.2,15,16,18,20 family seen in CHB patients before treatment may interfere the virus removal through down-regulating the body′s immune response;and with the decline of viral load in serum after the antiviral treatment,the clonal expansion of Tregs TRBV1,5.2,6,12,14,24 family may help body induce immune tolerance and result in the HBV persistence.

Chronic hepatitis B;Acute hepatitis B;T-cell receptor;Complementarity determining region 3;CD4+CD25+Tregs;Entecavir

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.017

①本文為貴州省社會(huì)發(fā)展公關(guān)基金資助項(xiàng)目(No.黔科合SY[2010]3049號(hào))。

②遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遵義563003。

潘宗琴(1988年-)，女，碩士，主要從事乙型肝炎的免疫發(fā)病機(jī)理研究。

及指導(dǎo)教師：邱隆敏(1965年-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事乙型肝炎的免疫發(fā)病機(jī)理研究，E-mail：qiulm128@163.com。

R392-33

A

1000-484X(2017)06-0889-07