紫蘇醇對肺癌A549細胞增殖和侵襲的抑制作用機制的研究①

劉行仁 白義鳳 梁 良 馮 靜 鄧 菲

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院呼吸科，成都610072)

紫蘇醇對肺癌A549細胞增殖和侵襲的抑制作用機制的研究①

劉行仁 白義鳳②梁 良②馮 靜③鄧 菲④

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院呼吸科，成都610072)

目的：探討紫蘇醇(Perillyl alcohol,PA)對肺癌A549細胞增殖和侵襲的抑制作用機制，并闡明其對腫瘤血管生成信號的影響。方法：不同濃度PA和厄洛替尼加入到A549細胞中，利用溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)法測定藥物組對A549細胞的抑制作用，Transwell法檢測PA對A549細胞侵襲的抑制作用，采用間接熒光標記法測定細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的變化；分光光度法檢測PA對細胞凋亡蛋白Caspase-3活性的影響，Western blot法檢測A549中VEGF、HIF-1α及COX-2的表達，凝膠遷移或電泳遷移率實驗測定A549細胞中NF-κB活性。結(jié)果：與空白對照組比較，隨著濃度的增加(10、50、100 μg/ml)，PA和厄洛替尼對A549細胞生長的抑制率在不斷地增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，A549細胞侵襲能力呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，A549細胞內(nèi)活性氧水平隨厄洛替尼濃度的增加變化不大，而ROS水平隨著PA的濃度的增加而增加，在100 μg/ml濃度的PA下引起的ROS百分率達到了(80.43±6.92)%，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。細胞活力檢測結(jié)果顯示，隨著PA和厄洛替尼濃度的增加和作用時間的延長，A549細胞中凋亡蛋白Caspase-3活性明顯增加(P<0.05)，隨著紫蘇醇濃度的增加，COX-2、VEGF和HIF-1α的表達呈不斷降低的趨勢，EMSA檢測結(jié)果顯示，隨著PA濃度的增加，NF-κB的條帶面積不斷減少。結(jié)論：PA可能參與并促進了ROS的生成和Caspase-3活性增加，最終誘導A549細胞的凋亡，PA可能通過降低NF-κB的表達，進而誘導COX-2、VEGF等的表達減少，使血管生成滯后，能夠有效地使細胞的穿透能力下降和凋亡發(fā)生。

紫蘇醇；肺癌A549細胞；增殖抑制作用；活性氧(ROS)水平；Caspase-3活性；血管生成信號通路

劑量、療效和藥物毒性等因素在肺癌常規(guī)的放化療方案上已累積達到了極限，人們往往急需尋求低毒、高效性的作用機制上有別于現(xiàn)有化療藥物的物質(zhì)，進而對腫瘤產(chǎn)生更強的殺傷力。腫瘤免疫治療在奧地利召開的2015年“歐洲癌癥大會上成為一個亮點，核因子NF-κB蛋白家族與多種基因的啟動子和增強子序列位點特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和表達，參與免疫、炎癥、應激等反應，同時也參與調(diào)控細胞分化、增殖、凋亡等過程。NF-κB的激活途徑主要有經(jīng)典途徑和旁路途徑兩條，這兩條途徑的激活最終都是通過磷酸化IκBα蛋白，并解除其對NF-κB的抑制來實現(xiàn)，因此NF-κB與慢性炎癥及腫瘤的形成有著至關(guān)重要的關(guān)系。

紫蘇醇 (Perillyl alcohol，PA) 主要以游離態(tài)或酯的形式天然存在于柑橘、櫻桃、薄荷、香檸檬、姜草、雜薰衣草等多種植物中，具有多種生物活性[1]。近年來紫蘇醇作為一種高效、廣譜、低毒的抗癌藥物，已經(jīng)受到廣泛關(guān)注和研究。研究表明，PA對食管癌[2]、胰腺癌[3]、結(jié)腸直腸癌[4]、卵巢癌和乳腺癌[5]等腫瘤均有預防和治療作用，李詢等[6]研究了PA體外對NCI-H1299和A549細胞的生長和低毒性，李明潺等[7]研究了槐定堿對肺癌A549 細胞體外增殖和侵襲抑制作用及機制的研究，但是相關(guān)的PA抗肺癌A549細胞機制沒有進行探討，因此，本實驗擬以肺癌A549細胞為研究對象，通過體外和細胞實驗初步探討PA對肺癌A549細胞增殖和侵襲的作用機理，并檢測和探討抗NF-κB血管生成信號通路的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系 人肺癌A549細胞購買于中國科學院上海細胞庫，在本實驗室進行培養(yǎng)。

1.1.2藥物與試劑 紫蘇醇(高效液相鑒定純度>98%， 含量20 mg)，購自阿拉丁試劑(上海)有限公司，4℃保存，待用。鹽酸厄洛替尼片購自瑞士羅氏有限公司，國藥準字J20090116；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購買于上海生工生物工程有限公司；小牛血清購買于杭州四季青生物試劑公司；胰蛋白酶、RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；FITC/PI雙染試劑盒購買于碧云天生物試劑公司；活性氧試劑盒購買于美國Sigma公司等。

1.1.3儀器 pHS-3C型酸度計購自上海雷磁儀器廠；二氧化碳培養(yǎng)箱(RCO3000TVBA)購自美國REVCO公司；流式細胞儀(FACSAria)購自美國Becton Dikinson公司；酶聯(lián)免疫檢測儀(MULTISKAN MK3)購自芬蘭Labsystems公司；Bio-Rad680型酶聯(lián)檢測儀購自北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2方法

1.2.1A549細胞增殖抑制試驗測定 200 μl/孔的對數(shù)生長期A549細胞(1×105/孔)接種于96孔板中，進行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，分別加入PA和厄洛替尼(10、50、100 μg/ml)培養(yǎng)基，設(shè)定空白對照組，每個藥物3個平行孔。分別培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μl 的5 mg/ml MTT試劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。之后把培養(yǎng)基吸出，加入150 μl 的DMSO試劑，充分振蕩后，充分溶解結(jié)晶，在570 nm處用酶標儀測定各孔的吸光度(OD)。計算細胞活性=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.2A549細胞轉(zhuǎn)移的抑制能力測定 準備Transwell小室的濾膜內(nèi)表面涂細胞外基質(zhì)膠(50 μg/室)。小室干燥后重新加入含有0.1%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基水化。4.0 × 105ml-1的重懸浮細胞在Transwell小室的下室中加入新鮮10%胎牛血清培養(yǎng)基，而在上室中加入PA和厄洛替尼(10、50、100 μg/ml)培養(yǎng)基組，設(shè)定空白對照組，每個藥物3個平行孔，培養(yǎng)24 h，每孔中加入100 μl細胞懸浮液。常規(guī)細胞培養(yǎng)24 h。取出小室后，使用PBS溶液沖洗濾膜，使用PBS棉棒吸除和擦除上室的細胞，再根據(jù)Transwell小室使用說明進行染色觀察從而計算穿膜的細胞數(shù)，從而反映各組細胞的侵襲能力。實驗為3次重復實驗。

1.2.3A549細胞內(nèi)ROS檢測 A549細胞接種后，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分別加入PA(10、50、100 μg/ml)的培養(yǎng)基，3個平行組。加入400 μl DCFH-DA(二氯氫化熒光素，10 μg/ml)，充分混勻后，避光孵育15 min后，用 PBS洗去除細胞外熒光劑。并用PBS重懸細胞10 min后對熒光強度進行檢測。

1.2.4凋亡蛋白Caspase-3活性的檢測 分析前將Caspase-GlooR3試劑與96孔板置于室溫平衡，選取(10、50、100 μg/ml)濃度的PA處理6、12和24 h 后，向細胞培養(yǎng)物中加Caspase-GlooR3試劑，輕輕震蕩30 s，室溫孵育1 h后，用酶標儀405 nm處OD值檢測。

1.2.5A549細胞中VEGF、HIF-1α和COX-2的表達 收集對數(shù)生長期的A549細胞進行相應的空白對照組和PA組處理24 h，進行各組細胞總蛋白的提取，通過Bradford的方法調(diào)整相同的蛋白濃度后，進行電泳獲得根據(jù)分子量分離的蛋白條帶，根據(jù)pierce公司W(wǎng)estern blot顯像試劑盒的指導說明來進行，蛋白的NC膜電轉(zhuǎn)，進行蛋白封閉和一抗結(jié)合。本研究一抗包括：大鼠抗人HIF-1α(1∶1 000)、VEGF(1∶1 000)和COX-2(1∶1 000)多克隆抗體。一抗結(jié)合后洗脫，再進行二抗孵育標記兔抗大鼠的多克隆抗體(1∶10 000)。ECL試劑盒顯色后，暗室發(fā)光拍照，以β-Actin為內(nèi)參進行系統(tǒng)軟件分析。

1.2.6EMSA法測定NF-κB活性 接種2×106ml-1的對數(shù)生長期A549細胞于培養(yǎng)瓶，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，加入PA濃度為10、50和100 μg/ml，混合24 h后對各組細胞核蛋白進行提取，并應用購買的試劑盒對蛋白濃度測定。本實驗經(jīng)凝膠電泳后，將提取蛋白轉(zhuǎn)移至結(jié)合膜上，并用封閉液對結(jié)合膜封閉后，加Streptavidin-HRP反應液進行反應，并用洗滌液洗膜多次，最后用Lighten? HRP底物液進行壓片和顯影。

2 結(jié)果

2.1PA對A549細胞生長的抑制作用 圖1顯示，不同濃度PA對A549細胞生長的抑制曲線，選取10、50、100 μg/ml 3個濃度作為研究對象。表1所示，解析PA和厄洛替尼對A549細胞生長和侵襲的抑制作用，與空白對照組比較，隨著PA和厄洛替尼濃度的增加(10、50、100 μg/ml)，PA和厄洛替尼對A549細胞生長的抑制率在不斷地增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2PA對A549細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用 從表1中看出，與空白對照組相比，隨著PA和厄洛替尼濃度的增大，細胞侵襲能力呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3PA誘導的A549細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生 用不同濃度PA和厄洛替尼作用A549細胞48 h 后，表2所示，與空白對照組相比，細胞內(nèi)活性氧水平隨厄洛替尼濃度的增加變化不大，而隨著PA濃度的增加而增加，圖2中細胞內(nèi)的ROS熒光隨濃度增加而變多，在100 μg/ml濃度下的PA引起的ROS百分率達到了(80.43±6.92)%，與空白對照組比較，具有顯著性差異(P<0.05)。

2.4A549細胞凋亡蛋白Caspase-3活性檢測 細胞活力檢測結(jié)果顯示，隨著PA和厄洛替尼(10、50、100 μg/ml)濃度的增加和作用時間的延長，A549細胞中凋亡蛋白Caspase-3活性明顯增加(P<0.05)。

圖1 不同濃度PA對A549細胞生長的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of PA on growth of A549 cell

2.5A549細胞中VEGF、HIF-1α和COX-2的表達 如圖3，在不同濃度紫蘇醇的存在下， 與空白對照組相比，隨著紫蘇醇濃度的增加，COX-2、VEGF和HIF-1α的表達呈不斷降低的趨勢。

表1 PA對A549細胞生長和侵襲能力的抑制作用

Note：Compared with control group，1)P<0.01；2)P<0.05.

表2 PA對A549細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響

Note：Compared with control group，1)P<0.01；2)P<0.05.

圖2 PA對A549細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響Fig.2 Effect of PA on production of ROS in A549 cell

表3 PA對細胞Caspase-3活性的影響

Note：Compared with control group，1)P<0.01；2)P<0.05.

圖3 PA對腫瘤細胞A549中COX-2、VEGF和HIF-1α表達的影響Fig.3 Expression of COX-2,VEGF and HIF-1α of PA on A549

圖4 NF-κB 蛋白表達的 EMSA結(jié)果Fig.4 EMSA result chart of protein expression of NF-κB

2.6PA對核轉(zhuǎn)錄因子蛋白NF-κB 活化的調(diào)節(jié) 圖4的EMSA檢測結(jié)果顯示：隨著PA濃度的增加，NF-κB的條帶面積在不斷地減少。

3 討論

信號通路的下放與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移息息相關(guān)，報道顯示眾多癌癥預后不良反應均與腫瘤喜好通路有關(guān)[8]，同時腫瘤組織也會通過內(nèi)源性因子的調(diào)控促進腫瘤細胞的生長[9]。因此，阻截信號通路下放已成為腫瘤靶向治療的重要手段之一。眾所周知，在細胞凋亡過程中，Caspase-3和Caspase-9共同組成了酶聯(lián)反應的終末因子[10,11]，在腫瘤的凋亡通路中起到開關(guān)作用[12-14]，在PA的存在下，Caspase-3和Caspase-9蛋白表達的增加是導致細胞凋亡的重要原因，進而對酶聯(lián)反應進行有效的調(diào)控，能夠使細胞的穿透能力下降，從而達到阻礙A549細胞侵襲的效果。實驗結(jié)果顯示，PA能夠參與并影響Caspase級聯(lián)反應誘導凋亡通路的活性。

考察了不同濃度的PA對細胞內(nèi)ROS的影響，發(fā)現(xiàn)PA可以誘導細胞內(nèi)ROS水平升高，而ROS是由細胞內(nèi)氧代謝或外源性氧化劑產(chǎn)生的具有生物活性的氧分子[15,16]，其在啟動和調(diào)節(jié)細胞凋亡中具有重要作用，而ROS的檢測手段能夠通過DCF熒光強度，試驗中發(fā)現(xiàn)厄洛替尼未引起細胞內(nèi)ROS水平的上升，這和劉曉敏等[17]的研究結(jié)論是一致的，細胞凋亡的機制可能與細胞內(nèi)ROS水平升高有關(guān)，此外劉勝姿等[18]也發(fā)現(xiàn)5,7-DMF通過促進A549細胞內(nèi)活性氧生成從而增強TRAIL誘導肺癌細胞的凋亡。因此可以說明參與PA并促進了ROS誘導A549細胞的凋亡。隋文文等[19]研究表明，腫瘤在缺氧狀態(tài)下促進血管生成因子COX-2、VEGF等的表達，而缺氧過程中也可以通過調(diào)節(jié)HIF-1α/HRE的結(jié)合來調(diào)節(jié)COX-2基因的表達；進而參與血管的形成，而以上三種都受NF-κB基因調(diào)控，故NF-κB信號通路可能就是腫瘤血管生成的主要通路之一，甲基化酶的突變可以造成腫瘤的發(fā)生，而NF-κB信號通路的活性降低在免疫系統(tǒng)發(fā)育和誘導腫瘤細胞凋亡發(fā)生等過程中，起著關(guān)鍵作用。因此PA誘導了ROS水平的升高和NF-κB信號通路表達的降低，會顯著降低COX-2、VEGF等的表達，進而使血管生成滯后。此外，NF-κB同時也具有介導免疫應答的正常生理功能。機體受感染后的炎癥反應需要啟動NF-κB信號通路，轉(zhuǎn)錄一些細胞因子來介導免疫應答，以清除入侵的病原菌。對NF-κB的抑制在緩解腫瘤發(fā)生發(fā)展的同時，也將抑制正常的免疫應答，所以如何平衡這兩者的關(guān)系，也是以后必須考慮的重點。

本實驗為肺癌細胞體外實驗，故PA對于人肺癌的治療作用還需要進一步的動物體內(nèi)實驗以及臨床實驗。而在分子水平需要進行進一步的信號通路基因的檢測，如基因或者微小RNA芯片的檢測，再通過蛋白質(zhì)印跡等手段進行進一步的基因下游表達論證。在后續(xù)的實驗中，PA將作為一種新型的抗肺癌的化療藥物，被進一步論證和研究。

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[收稿2016-07-26 修回2016-12-29]

(編輯 張曉舟)

Anti-lungcancereffectandanti-angiogenesistherapystudyofperillylalcohol

LIUXing-Ren，BAIYi-Feng，LIANGLiang，F(xiàn)ENGJing，DENGFei.SichuanAcademyofMedicalScience﹠DepartmentofRespiration,SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu610072,China

Objective:To investigate the inhibitory effect of perillyl alcohol (PA) on the proliferation and invasion of lung cancer cell A549,and the influence of PA on tumor angiogenesis was studied.Methods:Different concentrations of PA and erlotinib were added into lung cancer cell A549,the inhibiting effect of drug group on lung cancer cell A549 was found by MTT assay.The inhibiting effect of PA on lung cancer cell A549 invasion was measured by Transwell assay.ROS changes of PA on lung cancer cell A549 was detected by fluorescent.Influence of PA on Caspase-3 activity of lung cancer cell A549 was measured by spectrophotometry,VEGF,HIF-1α,COX-2 expression in lung cancer cell A549 was measured by Western blot,and the NF-κB activity of lung cancer cell A549 was measured by EMSA.Results:Compared with blank control group,cell growth inhibition rate of PA and erlotinib on lung cancer cell A549 was increasing with the increased concentrations (10，50，100 μg/ml),the difference was statistically significant (P<0.05),the invasion ability of lung cancer cell A549 was decreased continuously,the difference was statistically significant (P<0.05).The ROS level of lung cancer cell A549 had no obvious change with the increasing density of erlotinib,but obviously increased with the increasing concentrations of PA (10，50，100 μg/ml).With the increasing concentrations of PA,the expression of COX-2,VEGF and HIF-1α were continuously decreased.EMSA assay showed that NF-κB was continuously decreased with the increasing concentrations of PA.Conclusion:The antitumor mechanism of PA on lung cancer cell A549 might be related to increase the expression level of ROS and reduce the expression of activity of NF-κB,COX-2,VEGF and HIF-1α with angiogenesis signaling pathway.

Perillyl alcohol;Lung cancer A549 cell;Anti-proliferative effect;ROS level;Caspase-3 activity;Angiogenic signaling pathways

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.011

①本文受國家自然科學基金(No.81301910)和四川省衛(wèi)計委科研課題(No.110137)資助。

②四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院腫瘤科，成都610072。

③四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院中醫(yī)科，成都610072。

④四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，成都610072。

劉行仁(1980年-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事肺部感染及肺部腫瘤治療研究，E-mail：syyliudoc@sina.com。

R285.5

A

1000-484X(2017)06-0859-05