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    Smad1在胃腺癌組織中的表達(dá)及對胃腺癌細(xì)胞遷移能力的影響研究①

    2017-07-05 11:46:47李宜炯張瑞華楊艷紅朱振龍王政民
    中國免疫學(xué)雜志 2017年6期
    關(guān)鍵詞:信號水平檢測

    王 欣 李宜炯 龐 超 張瑞華 楊艷紅 朱振龍 王政民

    (河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科,石家莊050031)

    Smad1在胃腺癌組織中的表達(dá)及對胃腺癌細(xì)胞遷移能力的影響研究①

    王 欣 李宜炯②龐 超 張瑞華 楊艷紅 朱振龍 王政民

    (河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科,石家莊050031)

    目的:研究Smad1在胃腺癌組織中的表達(dá)及對胃腺癌細(xì)胞遷移能力的影響。方法:提取收集的胃腺癌組織及對應(yīng)的癌旁組織中的蛋白,Western blot檢測Smad1的表達(dá)水平。以胃腺癌細(xì)胞HGC-27為研究對象,細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)Smad1的載體(p-EGFP-C1/Smad1)和Smad1小干擾RNA(Smad1 siRNA),同時轉(zhuǎn)染p-EGFP-C1和 siRNA control為對照。細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力。Western blot檢測細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt的表達(dá)水平。Akt信號通路抑制劑LY294002(20 μg/ml)作用于胃腺癌細(xì)胞HGC-27,MTT檢測細(xì)胞增殖情況,細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力。Western blot檢測MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:胃腺癌組織中Smad1的水平明顯低于癌旁組織(P<0.01)。p-EGFP-C1/Smad1組細(xì)胞存活率和遷移率均明顯低于p-EGFP-C1組(P<0.01)。Smad1 siRNA組細(xì)胞存活率和遷移率均明顯高于siRNA control組(P<0.01)。 p-EGFP-C1、p-EGFP-C1/Smad1、siRNA control、Smad1 siRNA組細(xì)胞中Akt蛋白表達(dá)水平?jīng)]有變化。p-EGFP-C1/Smad1組細(xì)胞MMP-9、MMP-2、p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯低于p-EGFP-C1組(P<0.01)。Smad1 siRNA組細(xì)胞MMP-9、MMP-2、p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯高于siRNA control(P<0.01)。胃腺癌細(xì)胞與Akt信號通路抑制劑作用后細(xì)胞增殖和遷移趨勢與p-EGFP-C1/Smad1組一致。結(jié)論:Smad1在胃腺癌組織中低表達(dá)。Smad1能夠抑制胃腺癌細(xì)胞增殖和遷移,作用機(jī)制與Akt信號通路有關(guān)。

    胃腺癌;Akt信號通路;增殖;遷移

    據(jù)統(tǒng)計,在世界范圍內(nèi)每年有超過100萬的新增胃癌患者,有超過80萬患者死于胃癌,其中中國的新增胃癌患者和死亡人數(shù)占三分之一[1]。在中國,胃癌的發(fā)病率和致死率在全部惡性腫瘤中位居第3位,男性的發(fā)病率高于女性,農(nóng)村高于城市[2]。胃癌中有95%屬于胃腺癌。胃腺癌嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。

    Smad是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子[3]。Smad1是Smad受體活化類型,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡等過程,在機(jī)體免疫系統(tǒng)中也有重要作用[4,5]。近年來的研究表明,Smad1在結(jié)直腸癌、舌鱗癌、子宮內(nèi)膜癌等多種癌癥中表達(dá)下調(diào)[6,7]。本研究中運(yùn)用Western blot檢測胃腺癌組織中Smad1的水平,并探討Smad1對胃腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響,以期為進(jìn)一步研究胃腺癌的發(fā)病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1組織及細(xì)胞 選取2011年10月~2013年2月在我院確診切除的胃腺癌患者胃腺癌組織及距離腫塊5 cm以上的癌旁組織各56例,平均年齡(62.14±10.47)歲,其中女性20例,男性36例。人胃腺癌細(xì)胞HGC-27由河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室提供。

    1.1.2主要儀器及試劑 p-EGFP-C1/Smad1、 p-EGFP-C1由本實驗室保存;DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰蛋白酶均購自于美國Sigma;胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物科技有限公司;MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt、Smad1、β-actin單克隆抗體均購自上海酶聯(lián)生物研究所;CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo。

    1.2方法

    1.2.1Western blot檢測胃癌組織中的Smad1水平 收集56例胃腺癌組織和癌旁組織,剪碎后,加入到組織勻漿器中,加入組織裂解液,放在冰上裂解30 min后,14 000 r/min離心20 min,吸取蛋白上清液到EP管中。取蛋白樣品,加入Loading buffer混合后,放在100℃的孵育器中煮沸3 min。將變性蛋白樣品加入到上樣孔中,電泳初始電壓為80 V,觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后,將電壓調(diào)整為120 V至電泳結(jié)束。取出蛋白凝膠,洗滌后,放在轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡10 min。取出PVDF膜,100 mA恒流將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉液封閉后,加入一抗(500倍稀釋)、二抗(1 000倍稀釋)依次反應(yīng)后,滴加顯色液,顯影定影后,以β-actin為內(nèi)參,分析目的蛋白表達(dá)率。

    1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 取出保存在-80℃的胃腺癌細(xì)胞HGC-27,37℃完全融化后,1 000 r/min離心10 min,棄掉上清液,在細(xì)胞中加入含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液,充分混合,接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,放在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度超過85%時,棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液,加入0.25%的胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞,離心后,用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞,根據(jù)實驗要求接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

    1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的胃腺癌細(xì)胞,加入胰蛋白酶消化后,接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜,觀察細(xì)胞融合度達(dá)到75%時,更換細(xì)胞培養(yǎng)液為不含有胎牛血清的不完全培養(yǎng)液,放在37℃孵育1 h。用Lipofectamine 2000將過表達(dá)Smad1的載體(p-EGFP-C1/Smad1)和Smad1小干擾RNA(Smad1 siRNA)轉(zhuǎn)染至胃腺癌細(xì)胞中,同時轉(zhuǎn)染p-EGFP-C1和 siRNA control為對照。放在37℃培養(yǎng)48 h后,Trizol法提取細(xì)胞中的總蛋白,Western blot檢測細(xì)胞中Smad1水平。

    1.2.4MTT檢測細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后的胃腺癌細(xì)胞,經(jīng)胰蛋白酶消化后,1 000 r/min離心10 min,棄掉上清液,用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮后,接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔中加入細(xì)胞個數(shù)為2×104個,放在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后。在細(xì)胞中加入濃度為5 mg/ml 的MTT溶液,放在CO2培養(yǎng)箱中孵育反應(yīng)4 h。同時設(shè)置空白組,空白組中不加細(xì)胞。為了提高實驗的準(zhǔn)確性,每組設(shè)置8個復(fù)孔。吸除上清液,加入DMSO溶液150 μl,放置于避光條件下反應(yīng)10 min,觀察結(jié)晶物完全溶解后,酶標(biāo)儀檢測每孔的吸光度。計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)-(對照組OD值-空白組OD值)。

    1.2.5細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移 取轉(zhuǎn)染后的胃腺癌細(xì)胞,接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,放在37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,觀察細(xì)胞完全貼壁后,棄上清液,用移液槍槍頭垂直的在長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶壁上劃出一條細(xì)痕,加入PBS洗滌兩次將劃出的細(xì)胞洗掉。放在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕寬度,計算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=細(xì)胞遷移距離/細(xì)胞劃痕寬度。

    1.2.6Western blot檢測細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt水平 轉(zhuǎn)染后的胃腺癌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞,Trizol法提取細(xì)胞蛋白,Western blot檢測細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt水平。步驟同1.2.1。

    1.2.7阻斷Akt信號通路對胃腺癌細(xì)胞增殖遷移影響 培養(yǎng)至對數(shù)生長期的胃腺癌細(xì)胞,與20 μg/ml的Akt信號通路抑制劑LY294002作用48 h后記為抑制劑組,同時設(shè)置對照組,對照組不加入抑制劑LY294002。MTT檢測細(xì)胞增殖情況,細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力。Western blot檢測MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt水平。同1.2.1、1.2.4、1.2.5。

    2 結(jié)果

    2.1胃腺癌組織中Smad1蛋白表達(dá)水平結(jié)果 Western blot檢測了56例胃腺癌組織和癌旁組織中Smad1蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),胃癌組織中Smad1蛋白相對表達(dá)水平約為(0.18±0.05),而癌旁組織中Smad1蛋白相對表達(dá)水平約為(0.46±0.06)。Smad1蛋白在胃腺癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01 ),見圖1。

    2.2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Smad1蛋白表達(dá)水平結(jié)果 胃腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染p-EGFP-C1、p-EGFP-C1/Smad1、 siRNA control、Smad1 siRNA后,培養(yǎng)48 h,Western blot檢測細(xì)胞中Smad1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,p-EGFP-C1/Smad1組細(xì)胞中Smad1的水平明顯高于p-EGFP-C1,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Smad1 siRNA組細(xì)胞中Smad1的水平明顯低于siRNA control,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖2、表1。

    圖1 Western blot檢測胃腺癌組織中Smad1蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.1 Expression of Smad1 in gastric adenocarcinoma tissues by Western blot

    圖2 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Smad1蛋白水平結(jié)果圖Fig.2 Expression of Samd1 in gastric adenocarcinoma cells transfected by Western blotNote:1 .p-EGFP-C1;2.p-EGFP-C1/Smad1;3.siRNA control;4.Smad1 siRNA.

    2.3Smad1對胃腺癌細(xì)胞增殖遷移影響結(jié)果 轉(zhuǎn)染p-EGFP-C1、p-EGFP-C1/Smad1、siRNA control、Smad1 siRNA后,MTT檢測48 h的細(xì)胞存活情況,細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力。結(jié)果顯示,p-EGFP-C1/Smad1組細(xì)胞存活率和遷移率明顯低于p-EGFP-C1組,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),Smad1 siRNA組細(xì)胞存活率和遷移率明顯高于siRNA control,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表1。

    2.4Smad1對胃腺癌細(xì)胞MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt表達(dá)影響 轉(zhuǎn)染p-EGFP-C1、p-EGFP-C1/Smad1、siRNA control、Smad1 siRNA后,Western blot檢測48 h細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt蛋白水平。結(jié)果顯示,p-EGFP-C1、p-EGFP-C1/Smad1、siRNA con-trol、Smad1 siRNA組細(xì)胞中Akt蛋白表達(dá)水平?jīng)]有變化。p-EGFP-C1/Smad1組細(xì)胞MMP-9、MMP-2、p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯低于p-EGFP-C1組,差異顯著(P<0.01)。Smad1 siRNA組細(xì)胞MMP-9、MMP-2、p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯高于siRNA control,差異顯著(P<0.01)。見圖3、表2。

    表1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Smad1蛋白表達(dá)率、細(xì)胞存活率和細(xì)胞遷移率

    Note:1)P<0.01 vs p-EGFP-C1;2)P<0.01 vs siRNA control.

    圖3 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt表達(dá)結(jié)果Fig.3 Expression of MMP-9,MMP-2,p-Akt and Akt in gastric adenocarcinoma cells transfected by Western blotNote:1.p-EGFP-C1;2.p-EGFP-C1/Smad1;3.siRNA control;4.Smad1 siRNA.

    表2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt蛋白表達(dá)率

    Note:1)P<0.01 vs p-EGFP-C1;2)P<0.01 vs siRNA control.

    表4 阻斷Akt信號通路后細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt蛋白表達(dá)率

    Note:1)P<0.01 vs matched group.

    2.5阻斷Akt信號通路對胃腺癌細(xì)胞增殖遷移影響結(jié)果 胃腺癌細(xì)胞與20 μg/ml的Akt信號通路抑制劑LY294002作用48 h后,MTT檢測細(xì)胞存活率,細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移率,Western blot檢測細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt表達(dá)水平。結(jié)果顯示,抑制劑組細(xì)胞存活率和遷移率明顯低于對照組,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。抑制劑組細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt水平明顯低于對照組,差異顯著(P<0.01)。見圖4、表3、4。

    3 討論

    Smads蛋白家族含有9個成員,其分子量大約為42~60 kD。Smad由高度保守的氨基酸、羧基端及含有脯氨酸的中間連接區(qū)組成[8]。Smad1由465個氨基酸組成,參與轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),對組織胚胎發(fā)育、機(jī)體免疫系統(tǒng)、組織修復(fù)及細(xì)胞生長等都具有重要作用[9,10]。 Smad1在糖尿病、癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中也具有調(diào)控功能[11]。有研究表明,Smad1在肺癌、結(jié)直腸癌、垂體腺瘤等腫瘤中表達(dá)異常[12]。過表達(dá)Smad1后的小鼠垂體瘤細(xì)胞增殖能力明顯減弱,細(xì)胞周期阻滯在S期[13]。3,4-二氯異香豆素能夠通過上調(diào)BGC-823細(xì)胞中的Smad1水平發(fā)揮抗腫瘤的作用[14]。

    表3 阻斷Akt信號通路后細(xì)胞存活率

    Note:1)P<0.01 vs matched group.

    圖4 Western blot檢測阻斷Akt信號通路后細(xì)胞中MMP-9、MMP-2、p-Akt、Akt表達(dá)結(jié)果Fig.4 Expression of MMP-9,MMP-2,p-Akt and Akt in gastric adenocarcinoma cells after Akt signaling pathway blocked by Western blotNote:1.Matched group;2.Control group.

    絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號通路廣泛存在于生命機(jī)體中,在細(xì)胞生長、增殖等過程中發(fā)揮重要作用[15]。有研究表明,Akt信號通路在乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥中異?;罨?,而磷酸化的Akt(p-Akt)具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的作用[16,17]。用不同濃度的Akt信號通路抑制劑LY294002處理舌鱗癌細(xì)胞后,舌鱗癌細(xì)胞增殖和遷移受到抑制[18]?;|(zhì)金屬蛋白酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì),在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶的重要成員,在癌癥組織中過度表達(dá)[19]。

    本研究中,用Western blot法檢測了胃腺癌組織中Smad1的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Smad1在胃腺癌組織中表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步通過體外實驗研究Smad1對胃腺癌細(xì)胞增殖遷移的影響。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染分別過表達(dá)和抑制了胃腺癌細(xì)胞中Smad1的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達(dá)Smad1的細(xì)胞存活率和細(xì)胞遷移能力均明顯降低。這提示,Smad1在胃腺癌細(xì)胞生長過程中發(fā)揮抑癌基因的作用。過表達(dá)Smad1的胃腺癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá)也明顯減弱,這說明Smad1可能是通過調(diào)控MMP-2和MMP-9影響胃腺癌細(xì)胞遷移能力的。結(jié)果還發(fā)現(xiàn),過表達(dá)Smad1的細(xì)胞中p-Akt水平降低。本研究進(jìn)一步用Akt信號通路抑制劑作用于胃腺癌細(xì)胞,細(xì)胞存活率和遷移率降低。這提示,Smad1能夠抑制Akt信號通路的激活影響胃腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。

    綜上所述,Smad1在胃腺癌組織中表達(dá)下調(diào)。Smad1能夠抑制胃腺癌細(xì)胞的增殖和遷移發(fā)揮抑癌基因的作用,作用機(jī)制與Akt信號通路有關(guān)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究Smad1在胃腺癌發(fā)病機(jī)制中作用奠定了基礎(chǔ),為治療胃腺癌提供了新方向。

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    [收稿2016-10-19 修回2016-11-29]

    (編輯 許四平)

    StudyonexpressionofSmad1ingastricadenocarcinomaanditseffectonmigrationabilityofgastriccancercells

    WANGXin,LIYi-Jiong,PANGChao,ZHANGRui-Hua,YANGYan-Hong,ZHUZhen-Long,WANGZheng-Min.DepartmentofPathology,theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031,China

    Objective:To investigate the expression of Smad1 in gastric carcinoma and the influence on the migration ability of gastric cancer cells.Methods:Collected the protein from the gastric cancer tissues and corresponding adjacent tissues,the expression level of Smad1 was detected by Western blot.In HGC-27 gastric cancer cells as the research object,the carrier cells transfected with overexpression of Smad1 (p-EGFP-C1/Smad1) and Smad1 small interfering RNA (Smad1 siRNA),while transfection of p-EGFP-C1 and siRNA control as control.MTT to detect cell proliferation.Cell migration ability was detected with cell scratch test.The expression levels of MMP-9,MMP-2,p-Akt and Akt in cells were detected by Western blot.Akt signal pathway inhibitor LY294002 (20 μg/ml) in gastric adenocarcinoma cells,MTT for cell proliferation,cell scratch assay for cell migration.The expression levels of MMP-9,MMP-2,p-Akt,Akt were detected by Western blot.Results:Smad1 in gastric carcinoma was significantly lower than the adjacent tissues (P<0.01).The cell survival rate and migration rate of p-EGFP-C1/Smad1 group were significantly lower than that of p-EGFP-C1 group (P<0.01).The cell survival rate and migration rate of Smad1 siRNA group were significantly higher than those in the siRNA control group (P<0.01).The expression levels of Akt protein in P-EGFP-C1,p-EGFP-C1/Smad1,Smad1 siRNA,siRNA control cells did not change.The expression levels of MMP-9,MMP-2 and p-Akt in p-EGFP-C1/Smad1 group were significantly lower than that in p-EGFP-C1 group (P<0.01).The expression levels of MMP-9,MMP-2 and p-Akt in Smad1 siRNA group were significantly higher than that in control siRNA (P<0.01).The cell proliferation and migration trends in gastric cancer cells effected by Akt signaling pathway inhibitor consistent with the p-EGFP-C1/Smad1 group.Conclusion:Low expression of Smad1 in gastric cancer tissue.Smad1 can inhibit the proliferation and migration of gastric cancer cells,the mechanism of action is related to the Akt signaling pathway.

    Gastric adenocarcinoma;Akt signal pathway;Proliferation;Migration

    10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.008

    ①本文為河北省衛(wèi)計委青年科技課題(20150642)項目。

    ②通訊作者,河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院骨科,石家莊 050031,E-mail:185985103@qq.com。

    王 欣(1982年-),女,碩士,主治醫(yī)師,主要從事臨床腫瘤病理的研究,E-mail:wangxin1850@163.com。

    R735.2

    A

    1000-484X(2017)06-0844-05

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