β-胡蘿卜素對(duì)脂多糖刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥因子的影響及其機(jī)制①

張曉音 張珊珊 吳 旻 吉昱斌 黃羽盛 鄭 鑫

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130118)

β-胡蘿卜素對(duì)脂多糖刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥因子的影響及其機(jī)制①

張曉音 張珊珊 吳 旻 吉昱斌 黃羽盛 鄭 鑫

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130118)

目的：探討β-胡蘿卜素對(duì)脂多糖(LPS)刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥因子的影響及其機(jī)制。方法：采用5 μg/ml 的LPS刺激巨噬細(xì)胞24 h后用不同濃度的β-胡蘿卜素(20、40、80、160 μmol/L)處理細(xì)胞3 h，MTT法測(cè)細(xì)胞活性，熒光定量PCR測(cè)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量，ELISA測(cè)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌量，Western blot測(cè)NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量。5 μg/ml的LPS和不同濃度的NF-κB抑制劑PDTC(1、5、10 μg/ml)共同處理巨噬細(xì)胞24 h，Western blot測(cè)NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量，熒光定量PCR、ELISA測(cè)炎癥因子的表達(dá)和分泌。比較LPS+PDTC組和LPS+PDTC+β-胡蘿卜素組炎癥因子和NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)的變化。結(jié)果：與LPS組相比，不同濃度的β-胡蘿卜素對(duì)LPS刺激的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活性有提升作用，對(duì)炎癥因子和NF-κB p65蛋白的表達(dá)有抑制作用；抑制NF-κB蛋白的表達(dá)可以抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌； LPS+PDTC+β-胡蘿卜素組對(duì)炎癥因子的抑制作用比LPS+PDTC組明顯，且差異顯著(P<0.05)，但兩組對(duì)NF-κB p65蛋白的表達(dá)不明顯。結(jié)論：β-胡蘿卜素可以通過(guò)抑制NF-κB通路中NF-κB p65蛋白的表達(dá)抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌，且此通路不是唯一相關(guān)的通路。

β-胡蘿卜素；RAW264.7細(xì)胞；炎癥因子；NF-κB p65蛋白

炎癥是由激活的巨噬細(xì)胞釋放一系列炎癥因子所產(chǎn)生的以防御為主的一種免疫反應(yīng)[1]，炎癥因子的持續(xù)刺激會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生，與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的產(chǎn)生密切相關(guān)[2,3]。類固醇和非類固醇藥物是傳統(tǒng)的抗炎藥物，被廣泛使用，但其對(duì)胃腸道、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等存在極大的副作用[4]，因此，尋求一種新型、高效、毒副作用小的抗炎藥物對(duì)慢性炎癥干預(yù)具有重要意義。β-胡蘿卜素是具有共軛多烯雙鍵結(jié)構(gòu)的天然色素之一，具有抗氧化、抗癌、促進(jìn)細(xì)胞間隙連接通訊等多種生物活性，在延緩機(jī)體衰老、預(yù)防疾病、提高機(jī)體免疫力等方面中發(fā)揮重要作用[5,6]，現(xiàn)已被157個(gè)國(guó)家列入食品添加劑與飼料添加劑名錄。關(guān)于β-胡蘿卜素的研究大多基于其是維生素A的前體，在炎癥方面鮮有報(bào)道，本試驗(yàn)擬通過(guò)細(xì)胞炎癥模型來(lái)研究β-胡蘿卜素對(duì)炎癥反應(yīng)的作用。

巨噬細(xì)胞是參與炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞之一，在脂多糖的刺激下，可誘導(dǎo)分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等多種炎癥因子，進(jìn)而出現(xiàn)臨床炎癥反應(yīng)[7]，而分泌的這些炎癥因子是檢測(cè)炎癥嚴(yán)重程度的量化指標(biāo)[8]。所以，本試驗(yàn)以LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立炎癥模型，研究β-胡蘿卜素對(duì)其炎癥因子分泌的影響及其作用機(jī)制，為β-胡蘿卜素的使用以及炎癥的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)細(xì)胞典藏中心。

1.1.2主要試劑 β-胡蘿卜素(武漢星辰生物)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；LPS、MTT(美國(guó)Sigma公司)；PDTC(上海碧云天)；RNA Lyzol(上海ExCell公司)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Gene Copoeia 公司)；Brilliant Ⅱ SYBR Green QPCR Master Mix(美國(guó) Agilent Technologies)；引物(上海生工生物)；RIPA裂解液(北京Solarbio)；ELISA試劑盒(上海朗頓)；BCA法蛋白定量試劑盒(上海申能博采)；NF-κB抗體、β-actin抗體(美國(guó)CST)；HRP標(biāo)記的羊抗鼠/兔抗體(天津三箭)；ECL試劑盒(美國(guó)Millipore)。

1.1.3主要儀器 高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma)；Thermo酶標(biāo)儀(上海賽默飛世爾) ；熒光定量PCR儀、凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad)。

1.2方法

1.2.1RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(含青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml)于5% CO2、37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，根據(jù)不同的試驗(yàn)?zāi)康?，接種于96孔細(xì)胞板或6孔細(xì)胞板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測(cè)β-胡蘿卜素對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以8×104個(gè)/ml的密度接種于96孔細(xì)胞板中，每孔100 μl，置于5% CO2、37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，加入終濃度為0、20、40、80、160 μmol/L的β-胡蘿卜素(DMSO的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%)，每組8個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)3、6、12 h后分別棄去培養(yǎng)液，然后每孔加入0.5 mg/ml的MTT溶液100 μl，培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。最后，每孔加入100 μl DMSO，置于搖床上低速震蕩10 min，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量其吸光值，計(jì)算不同濃度的β-胡蘿卜素組相對(duì)于空白組的細(xì)胞活性。

1.2.3熒光定量PCR、ELISA檢測(cè)β-胡蘿卜素、PDTC對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的影響 按照1.2.2中接種96孔細(xì)胞板的方法以細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml接種RAW264.7細(xì)胞于6孔細(xì)胞板中，每孔2 ml，細(xì)胞貼壁后用5 μg/ml的LPS刺激細(xì)胞24 h，棄掉培養(yǎng)液后加入20、40、80、160 μmol/L的β-胡蘿卜素繼續(xù)培養(yǎng)3 h，或者5 μg/ml的LPS和1、5、10 μg/ml NF-κB抑制劑PDTC共同處理RAW264.7細(xì)胞24 h。①根據(jù)RNA Lyzol說(shuō)明書提取細(xì)胞RNA，樣品在-80℃保存，并取部分樣品測(cè)RNA的質(zhì)量，OD260/OD280在1.8～2.0之間，可用于下一步試驗(yàn)。然后按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后熒光定量PCR，采用20 μl的反應(yīng)體系，Master Mix 10 μl、上下游引物各0.5 μl、cDNA模板2 μl、染料1 μl 、ddH2O 6 μl，按照95℃ 預(yù)變性 5 min，95℃ 變性10 s，60℃ 退火75 s，40個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)，每次試驗(yàn)均設(shè)置18s作為內(nèi)參。用2-ΔΔCt法計(jì)算炎性因子的相對(duì)表達(dá)量，引物序列表如表1所示[9]。②根據(jù)ELISA說(shuō)明書，3 000 r/min、4℃離心20 min，用無(wú)菌管收集細(xì)胞上清，嚴(yán)格按照試劑盒步驟操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算各組IL-1β、IL-6、TNF-α的含量(ng/L)。

表1 熒光定量PCR引物序列表

1.2.4Western blot法檢測(cè)PDTC、β-胡蘿卜素對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 取六孔細(xì)胞板中處理后的RAW264.7，預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上裂解后用細(xì)胞刮輕輕刮下，12 000 r/min、4℃ 離心5 min，取上清液，BCA法測(cè)蛋白濃度。取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，用3% 的BSA封閉3 h，一抗為鼠源的NF-κB p65抗體(1∶1 000)，兔源的β-actin抗體(1∶5 000)，4℃孵育過(guò)夜。1×TBST洗膜后分別加入相應(yīng)的二抗：HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶2 000)和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶3 000)，37℃ 孵育1 h。1×TBST洗膜后，感光，ECL顯色，用密度比值表示目的蛋白量。

2 結(jié)果

2.1β-胡蘿卜素對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響 如圖1所示，β-胡蘿卜素作用RAW264.7細(xì)胞3 h，可以提升細(xì)胞活性，且在濃度為20、40、80 μmol/L時(shí)，差異極顯著(P<0.01)；β-胡蘿卜素作用RAW264.7細(xì)胞6 h，濃度為160 μmol/L時(shí)，極顯著降低細(xì)胞活性(P<0.01)；β-胡蘿卜素作用RAW264.7細(xì)胞12 h，濃度為80、160 μmol/L時(shí)，極顯著降低細(xì)胞活性(P<0.01)，所以，選取不同濃度的β-胡蘿卜素作用細(xì)胞3 h作為本試驗(yàn)的作用時(shí)間，在此濃度和時(shí)間范圍內(nèi)，β-胡蘿卜素對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性，可作為試驗(yàn)用安全濃度范圍。

圖1 不同濃度的β-胡蘿卜素作用不同的時(shí)間對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活性的影響Fig.1 Different concentration and different time of β-carotene on cell viability of RAW264.7 cellsNote:Compared with the control group(0 μmol/L),*.P<0.05,**.P<0.01.

LPS可以激活巨噬細(xì)胞，如圖2所示，5 μg/ml的LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h，細(xì)胞活性略有上升，繼續(xù)用不同濃度的β-胡蘿卜素處理細(xì)胞3 h，細(xì)胞活性隨著β-胡蘿卜素濃度的升高而升高，有劑量依賴效應(yīng)。由圖2可知，β-胡蘿卜素對(duì)LPS刺激后的巨噬細(xì)胞有增殖作用，基于細(xì)胞活性方面，此細(xì)胞模型建模成功，對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性。

2.2β-胡蘿卜素對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的影響 LPS可激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌一系列的炎癥因子，炎癥因子的分泌是評(píng)價(jià)炎癥嚴(yán)重程度的一個(gè)量化指標(biāo)，如圖3A所示，LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)，用不同濃度的β-胡蘿卜素處理細(xì)胞后，炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，且差異極顯著(P<0.01)；如圖3B所示，LPS刺激巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌，不同濃度的β-胡蘿卜素可降低其分泌量，提示β-胡蘿卜素對(duì)炎癥因子的表達(dá)和分泌有一定的抑制作用。

2.3β-胡蘿卜素對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 NF-κB通路是炎癥通路中重要的通路之一，如圖4所示，用不同濃度的β-胡蘿卜素處理LPS刺激后的巨噬細(xì)胞，NF-κB p65蛋白表達(dá)量隨β-胡蘿卜素濃度的升高而降低，說(shuō)明，β-胡蘿卜素在一定程度上可以抑制NF-κB p65蛋白的表達(dá)。但LPS組與對(duì)照組比，NF-κB p65蛋白表達(dá)基本沒(méi)變化，可能是細(xì)胞處理24 h，在長(zhǎng)期饑餓狀態(tài)下，對(duì)照組中NF-κB通路已被激活。激活的NF-κB可結(jié)合到編碼炎癥因子基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列，進(jìn)而產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的炎癥因子[1]，所以，根據(jù)圖3、4推測(cè)，β-胡蘿卜素對(duì)炎癥因子的抑制作用可能是通過(guò)抑制NF-κB p65蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

圖2 不同濃度的β-胡蘿卜素對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞活性的影響Fig.2 Different concentration of β-carotene on cell viability of LPS-induced RAW264.7 cellsNote:Compared with the LPS group,**.P<0.01.

2.4β-胡蘿卜素對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥因子影響的分子機(jī)制 PDTC是常用的一種NF-κB抑制劑，能特異性的抑制NF-κB的活化，如圖5所示，不同濃度的PDTC與LPS共同作用細(xì)胞24 h，與LPS組相比，可顯著降低NF-κB p65蛋白的表達(dá)，驗(yàn)證了其抑制NF-κB活化的作用，且在濃度為10 μg/ml時(shí)，抑制效果最好。

PDTC可以抑制NF-κB p65的表達(dá)，如圖6A、B所示，與LPS共同作用后，也可以抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)和分泌，說(shuō)明，通過(guò)抑制NF-κB p65的表達(dá)可以抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)和分泌，因此，結(jié)合圖3、4的結(jié)果，β-胡蘿卜素可以通過(guò)抑制NF-κB p65蛋白的表達(dá)來(lái)抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌，β-胡蘿卜素對(duì)炎癥因子的抑制作用與NF-κB通路有關(guān)。

圖3 β-胡蘿卜素對(duì)LPS刺激RAW264.7炎癥因子的影響Fig.3 Different concentration of β-carotene on inflamma-tory factors of LPS-induced RAW264.7 cellsNote:A.The effects of β-carotene on the mRNA relative expression of inflammatory factors in LPS-induced RAW264.7 cells；B.The effects of β-carotene on the secretion capacity of inflammatory factors in LPS-induced RAW264.7 cells.Compared with the LPS group,*.P<0.05,**.P<0.01.

如圖7A、B所示，80 μmol/L的β-胡蘿卜素、10 μg/ml的PDTC以及兩者共同作用，均可以抑制LPS引起的炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)和分泌。對(duì)比LPS+PDTC組和LPS+PDTC+β-胡蘿卜素組發(fā)現(xiàn)，后者對(duì)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的抑制作用更明顯，而且，如圖8所示，這兩組的NF-κB p65蛋白表達(dá)差異不顯著，這可能是β-胡蘿卜素的抑制作用還與其他通路有關(guān)，LPS+PDTC組和LPS+β-胡蘿卜素組的差異趨勢(shì)也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

圖4 β-胡蘿卜素對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Different concentration of β-carotene on protein NF-κB p65 of LPS-induced RAW264.7 cellsNote: Compared with the LPS group,*.P<0.05,**.P<0.01.

圖5 PDTC對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of different concentration of PDTC on prot-ein NF-κB p65 of LPS-induced RAW264.7 cellsNote: Compared with the LPS group,*.P<0.05,**.P<0.01.

圖6 PDTC對(duì)LPS刺激RAW264.7炎癥因子的影響Fig.6 Different concentration of PDTC on inflammatory factors of LPS-induced RAW264.7 cellsNote: A.The effects of PDTC on the mRNA relative expression of inflammatory factors in LPS-induced RAW264.7 cells;B.The effects of PDTC on the secretion capacity of inflammatory factors in LPS-induced RAW264.7 cells.Compared with the LPS group,*.P<0.05,**.P<0.01.

圖8 PDTC、β-胡蘿卜素對(duì)LPS刺激RAW264.7NF-κB p65蛋白比較圖Fig.8 Different concentration of PDTC and β-carotene on protein NF-κB p65 of LPS-induced RAW264.7 cellsNote: Compared with LPS group,*.P<0.05,**.P<0.01.

圖7 PDTC、β-胡蘿卜素對(duì)LPS刺激RAW264.7炎癥因子的影響Fig.7 Different concentration of PDTC and β-carotene on inflammatory factors of LPS-induced RAW2 64.7 cellsNote:A.The effects of PDTC and β-carotene on the mRNA relative expression of inflammatory factors in LPS-induced RAW264.7 cells;B.The effects of PDTC and β-carotene on the secretion capacity of inflammatory factors in LPS-induced RAW264.7 cells.Compared with the LPS group,*.P<0.05,**.P<0.01，compared with the LPS+PDTC group,#.P<0.05,##.P<0.01.

3 討論

炎癥是機(jī)體保護(hù)自身并消除有害刺激的過(guò)程，一般是有利的，分為急性炎癥和慢性炎癥，炎癥因子的持續(xù)刺激是導(dǎo)致慢性炎癥的主要原因，如高濃度的炎癥因子會(huì)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞攻擊自身組織，嚴(yán)重的與糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘等疾病的產(chǎn)生密切相關(guān)，所以炎癥也是抗損傷和損傷的統(tǒng)一過(guò)程[10]。巨噬細(xì)胞在病原微生物引起的炎癥中發(fā)揮重要作用，LPS即可活化巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)其分泌多種促炎因子[11]，最終會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷以及系統(tǒng)并發(fā)癥[12]。

炎癥因子的分泌是檢測(cè)炎癥嚴(yán)重程度的量化指標(biāo)，本試驗(yàn)以IL-1β、IL-6、TNF-α這三種炎癥因子作為檢測(cè)指標(biāo)。TNF-α、IL-1β是炎癥介質(zhì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的始發(fā)因子[13]，其中TNF-α是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞中重要的促炎細(xì)胞因子，通過(guò)產(chǎn)生IL-1β、IL-6誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)熱、細(xì)胞凋亡等，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，TNF-α含量的異常與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。IL-6是調(diào)節(jié)免疫、炎癥反應(yīng)等生理過(guò)程的多功能細(xì)胞因子，其表達(dá)受LPS和IL-1β的正向調(diào)節(jié)[14]。本試驗(yàn)中，5 μg/ml的LPS刺激巨噬細(xì)胞后，IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，即細(xì)胞已經(jīng)處于炎癥的一個(gè)嚴(yán)重程度，當(dāng)用不同濃度的β-胡蘿卜素處理后，這些炎癥因子開始降低，說(shuō)明β-胡蘿卜素可以減輕LPS刺激的巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)。

NF-κB通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，正常狀態(tài)下，NF-κB以同二聚體或異二聚體存在胞質(zhì)中，其p65亞基和抑制蛋白IκB結(jié)合，在受到外界刺激如LPS時(shí)，其抑制蛋白IκB發(fā)生磷酸化并降解，誘導(dǎo)p65亞基轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子上的結(jié)合原件結(jié)合，誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[15,16]。本試驗(yàn)中，LPS刺激的巨噬細(xì)胞用不同濃度的β-胡蘿卜素處理后，NF-κB p65蛋白的表達(dá)劑量依賴性降低，這可能是β-胡蘿卜素抑制炎癥因子的原因。

NF-κB抑制劑PDTC主要抑制NF-κB的活化，在本試驗(yàn)中，不同濃度的PDTC可以抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)和分泌，已有研究證實(shí)，IL-1β、IL-6、TNF-α基因的啟動(dòng)子均存在NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，其表達(dá)受NF-κB活性的調(diào)控[17,18]。說(shuō)明通過(guò)抑制NF-κB p65的表達(dá)的確可以抑制炎癥因子的分泌，間接說(shuō)明，β-胡蘿卜素可以通過(guò)抑制NF-κB p65的表達(dá)從而抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌。

機(jī)體中炎癥信號(hào)通路受到多種復(fù)雜機(jī)制的調(diào)節(jié)，NF-κB通路只是重要的經(jīng)典通路之一，大量的研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激的巨噬細(xì)胞可以激活MAPKs家族，巨噬細(xì)胞通過(guò)不同的MAPKs途徑調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[19]。本試驗(yàn)中，LPS刺激的巨噬細(xì)胞，在PDTC、β-胡蘿卜素共同作用組和PDTC組，這兩組的NF-κB p65蛋白的表達(dá)基本無(wú)差異的情況下，共同作用組炎癥因子的表達(dá)和分泌較PDTC組顯著降低，說(shuō)明，β-胡蘿卜素可能也通過(guò)其他的通路來(lái)抑制炎癥因子的分泌。

綜上所述，β-胡蘿卜素可以抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥因子的分泌，此抑制作用是通過(guò)抑制NF-κB p65蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，與NF-κB通路有關(guān)，且此通路不是β-胡蘿卜素抑制炎癥因子的唯一通路。

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[收稿2016-05-27 修回2016-07-20]

(編輯 許四平)

Effectsandmechanismofβ-caroteneoninflammatoryfactorsinLPS-inducedRAW264.7cells

ZHANGXiao-Yin,ZHANGShan-Shan,WUMin,JIYu-Bin,HUANGYu-Sheng,ZHENGXin.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China

Objective:To investigate the effects and mechanism of β-carotene on inflammatory factors(IL-1β，IL-6，TNF-α) in LPS-induced RAW264.7 cells.Methods:Firstly,RAW264.7 cells of being induced by 4(5 μg/ml)for 24 h were treated with different concentration of β-carotene(20，40，80，160 μmol/L)for 3 h.The cells viability was measured by MTT,the mRNA relative expression of IL-1β，IL-6，TNF-α was detected by fluorescence quantitative PCR,the secretion capacity of IL-1β，IL-6，TNF-α was detected by ELISA and the protein relative expression of NF-κB p65 protein was measured by Western blot.Secondly,RAW264.7 cells were induced by LPS(5 μg/ml) and different concentration of PDTC(1，5，10 μg/ml)for 24 h,NF-κB p65 protein was measured by Western blot and inflammatory factors were detected by fluorescence quantitative PCR and ELISA.Finally,compared the changes in the relative expression of inflammatory factors and NF-κB p65 protein between LPS+PDTC group and LPS+PDTC+β-carotene group.Results:Compared with the LPS-induced group,β-carotene could increase the cell viability of LPS-induced RAW264.7 cells and inhibied the relative expression of inflammatory factors and NF-κB p65 protein.Inhibited the relative expression of NF-κB p65 protein could reduce the relative expression of inflammatory factors.Compared with the LPS+PDTC group,LPS+PDTC+β-carotene group could inhibit the relative expression of inflammatory factors significantly(P<0.05).But,there was little difference about the relative expression of NF-κB p65 protein between this two groups.Conclusion:β-carotene inhibits the relative expression of inflammatory factors(IL-1β，IL-6，TNF-α) in LPS-induced RAW264.7 cells through inhibition of NF-κB p65 protein in NF-κB pathway,this pathway isn′t unique.

β-carotene;RAW264.7 cell;Inflammatory factor;NF-κB p65 protein

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.007

①本文為吉林省科技廳科技成果轉(zhuǎn)化促進(jìn)計(jì)劃(20150307021NY)。

張曉音(1991年-)，女，在讀碩士，主要從事細(xì)胞免疫與動(dòng)物育種方面的研究，E-mail：951770634@qq.com。

及指導(dǎo)教師：鄭 鑫(1965年-)，女，博士，教授，主要從事細(xì)胞免疫與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)方面的研究，E-mail： zhengxinjilin@126.com。

S828

A

1000-484X(2017)06-0838-06