大鼠乙酸型胃潰瘍模型的建立與評(píng)價(jià)

通拉嘎 梅 紅 其木格 吳七十三

內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼 028043

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實(shí)驗(yàn)研究

大鼠乙酸型胃潰瘍模型的建立與評(píng)價(jià)

通拉嘎 梅 紅 其木格 吳七十三*

內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼 028043

目的：建立3種大鼠乙酸型胃潰瘍模型并進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法：將72只健康Wistar大鼠分為正常組、乙酸注射低、中、高3個(gè)劑量組(0.01、0.03、0.05mL)、乙酸濾紙貼敷組、乙酸直接灼燒組等6個(gè)組。采用乙酸注射、乙酸濾紙貼敷和乙酸直接灼燒法建立三種乙酸型胃潰瘍大鼠模型。各組大鼠處死后通過肉眼觀察潰瘍點(diǎn)狀，采用圖像分析軟件計(jì)算image潰瘍面積；檢測(cè)血清MDA、SOD和NO的含量。結(jié)果：乙酸注射低、中、高劑量組潰瘍面均較小，但中劑量組﹑高劑量組與正常組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05、P<0.01)；乙酸濾紙貼敷組和乙酸直接灼燒組潰瘍面較大，與正常組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。與正常組比較乙酸注射中劑量組、乙酸濾紙貼敷組、乙酸直接灼燒組的血清MDA含量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05、P<0.01)；乙酸直接灼燒組血清SOD含量與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；乙酸注射中劑量組、乙酸濾紙貼敷組和乙酸直接灼燒組血清NO水平高于正常組，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05、P<0.01)；與正常組相比，乙酸注射高劑量組、乙酸濾紙貼敷組和乙酸直接灼燒組的EGF的濃度，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05、P<0.01)。結(jié)論：乙酸直接灼燒法導(dǎo)致的胃潰瘍模型最為理想，適用于慢性胃潰瘍大鼠模型的建立。

大鼠胃潰瘍模型；乙酸型；建立

建立胃潰瘍動(dòng)物模型是研究胃潰瘍發(fā)生機(jī)制和評(píng)價(jià)抗?jié)兯幬锏挠行Х椒ㄖ?。大鼠形體適中,繁殖快,成本較低,可用于大樣本實(shí)驗(yàn),因此常選用大鼠(Wistar或SD)建立胃潰瘍模型。其造模方式較多,主要有水浸應(yīng)激性大鼠胃潰瘍模型[1]、幽門結(jié)扎型大鼠胃潰瘍模型[2]、乙醇致大鼠胃潰瘍模型[3]、非甾體抗炎藥所致胃潰瘍模型[4-6]、乙酸致慢性胃潰瘍模型[7]。其中乙酸致慢性胃潰瘍模型的建立簡(jiǎn)單，模型成功率較高，不易恢復(fù)等特點(diǎn)。目前大鼠胃潰瘍模型中以冰乙酸性模型在實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用較廣[8]，研究表明此模型方法可靠,重復(fù)性好,潰瘍深而大,與人類的慢性胃潰瘍極為相似,其自然愈合需要60d左右[9]。建立慢性胃潰瘍動(dòng)物模型有以下3種：乙酸注射法、乙酸濾紙貼敷法、乙酸直接灼燒法[10]。其中因乙酸注射法造模型的操作部位比較麻煩，不易造模型；乙酸濾紙貼敷法造模要精準(zhǔn)直徑的大小和濾紙貼敷的時(shí)間的長(zhǎng)短不同而模型的程度不同；乙酸直接灼燒法造模時(shí)乙酸的量越多，造成的損傷最越重，有的引起肌層及漿膜層的損傷，甚至有壞死組織等。以上3種模型都有各自的不足點(diǎn)。應(yīng)此目前還是沒有建立乙酸型動(dòng)物模型的標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)價(jià)指標(biāo)。本試驗(yàn)將建立3種乙酸型大鼠胃潰瘍模型并進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí) Wistar大鼠，體重(200±2)g，雄性，購(gòu)于長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)GB14922-2001。

1.2 儀器 紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；酶標(biāo)儀(帝肯上海貿(mào)易有限公司)；TG16-WS高速臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；HH-W600數(shù)顯三用恒溫水箱(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.3 材料 冰乙酸(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；甲醛(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；水合氯醛(批號(hào)20150330，天津市東麗區(qū)新中村科技園區(qū))；MDA(批號(hào)：20160114)、SOD(批號(hào)：20160112)、NO(批號(hào)：20160115)和EGF(批號(hào)：20160231)試劑盒，南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 建立3種乙酸型模型 將Wistar大鼠72只雄性，體重為(200±20)g，將大鼠隨機(jī)分為正常組、乙酸注射模型組、乙酸濾紙貼敷模型組和乙酸直接灼燒模型組，每組12只。正常組自由飲食進(jìn)水，14d 后取材。利用乙酸注射、乙酸濾紙貼敷和乙酸直接灼燒法分別制備乙酸型胃潰瘍大鼠模型：大鼠禁食不禁水24h,用10%水合氯醛(3.5mL/kg)腹腔注射麻醉，劍突下0.5cm縱向切開腹壁約2cm，找出胃，輕移出腹腔。①乙酸注射法，用微量注射器在胃前壁胃竇部漿膜下近肌層處注入一定劑量(0.05、0.03、0.01mL)的冰乙酸。②乙酸濾紙貼敷法，用直徑為5mm的圓濾紙片浸適量的冰乙酸后，在胃竇部漿膜層貼敷30s×2次。③乙酸直接灼燒法,將內(nèi)徑5mm、長(zhǎng)30mm的玻璃管垂直置于胃體漿膜層，管內(nèi)加入冰乙酸0.2mL，1.5min后用棉簽蘸出冰乙酸。以上操作完畢，將胃輕輕送回腹腔，后覆蓋網(wǎng)膜，縫合腹膜，腹壁各層組織。

14d后，大鼠禁食1h后經(jīng)腹腔注射10% 水合氯醛1mL 深度麻醉，剖腹，腹主動(dòng)脈取血3～5mL，水浴36～37℃保溫30min后，3500r/min，離心10min，取上清液備用，結(jié)扎幽門和賁門，從幽門處注入4%的甲醛溶液10mL。取胃，置甲醛溶液中固定15min后，切開胃，擦去胃內(nèi)容物，觀察潰瘍點(diǎn)狀，比較各組大鼠胃潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率，用數(shù)碼相機(jī)在固定光源和固定位置拍攝，制成圖像，采用圖像分析軟件image 計(jì)算其潰瘍面積。

2.2 一般情況的觀察 實(shí)驗(yàn)過程中每天觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)、飲食、皮毛、爽便、體重等情況并予以記錄。

2.3 測(cè)定指標(biāo) 取血清嚴(yán)格按照試劑盒的說明用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(MDA)；用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)；用硝酸還原酶法測(cè)定一氧化氮(NO)。

3 結(jié)果與分析

3.1 一般情況的觀察結(jié)果 正常組、乙酸注射低劑量組大鼠術(shù)前和術(shù)后差別不大，精神狀態(tài)、活動(dòng)、飲食、皮毛、排糞尿均正常。乙酸注射中劑量組、高劑量組大鼠蘇醒后精神狀態(tài)比術(shù)前較差，活動(dòng)減少，食欲下降，無豎毛現(xiàn)象，排糞尿正常。乙酸濾紙貼敷組、乙酸直接灼燒組大鼠蘇醒后精神狀態(tài)很差，供背，嗜臥，不活動(dòng)，食欲明顯下降，毛皮蓬松沒有光澤，排糞尿基本正常。

2.2 3種大鼠胃潰瘍面積的比較 與正常組比較，乙酸注射中劑量組、乙酸注射高劑量組、乙酸濾紙貼敷組和乙酸直接灼燒組的潰瘍面積，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01或P<0.05)。見表1。

表1 3種大鼠胃潰瘍面積的比較 ±s)

注：與正常組比較，*P<0.05,#P<0.01；與乙酸注射低劑量組比較,△P<0.01；與乙酸注射中劑量組和高劑量組比較,□P<0.01。

3.3 3種乙酸型胃潰瘍模型血清指標(biāo) 與正常組比較，乙酸注射中劑量組、乙酸濾紙貼敷組、乙酸直接灼燒組的MDA的含量，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)；與正常組相比，乙酸注射低劑量組、中劑量組、乙酸直接灼燒組的SOD活力，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)；與正常組相比，乙酸注射高劑量組、乙酸濾紙貼敷組和乙酸直接灼燒組的NO水平，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 3種大鼠胃潰瘍模型的血清指標(biāo)

注：與正常組比較，*P<0.05，#P<0.01;與乙酸注射低劑量組比較，△P<0.01；與乙酸注射中劑量組比較，○P<0.01，☆P<0.05；與乙酸注射高劑量組比較，□P<0.05。

2.4 3種乙酸型胃潰瘍模型血清指標(biāo) 與正常組相比，乙酸注射高劑量組、乙酸濾紙貼敷組和乙酸直接灼燒組的EGF的濃度，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 3種大鼠胃潰瘍面積的比較

注：與正常組比較*P<0.05，#P<0.01；與乙酸注射低劑量組比較，△P<0.01；與乙酸注射中劑量組和高劑量組比較，□P<0.01。

4 討論

正常組、乙酸注射低劑量組的大鼠蘇醒后與術(shù)前同樣，造模手術(shù)3d內(nèi)乙酸注射中劑量組、乙酸注射高劑量組與正常組大鼠相比蘇醒后精神狀態(tài)欠佳，進(jìn)食進(jìn)水，排糞尿正常，乙酸濾紙貼敷組、乙酸直接灼燒組的大鼠精神狀態(tài)較差，活動(dòng)減少食欲明顯下降，毛皮松散缺乏光澤，排糞尿基本都正常。說明乙酸注射低劑量組以外均發(fā)生明顯的胃潰瘍。實(shí)驗(yàn)中，乙酸注射低劑量組大鼠4只死亡，死亡原因是大鼠的個(gè)體差異和麻醉劑量過多導(dǎo)致的。乙酸注射高劑量組大鼠1只死亡，死亡原因是注射時(shí)針頭穿透胃壁，導(dǎo)致該大鼠胃部穿孔而死亡。乙酸濾紙貼敷組大鼠2只死亡，死亡原因是取出胃部時(shí)傷到了脾臟，乙酸直接灼燒組大鼠1只死亡，死亡原因是縫合時(shí)傷了腹腔內(nèi)的消化道，造成腹腔內(nèi)感染等原因?qū)е碌摹?/p>

與正常組比較乙酸注射組的潰瘍面積不明顯，而乙酸濾紙貼敷組和乙酸直接灼燒組的潰瘍面積明顯，而且乙酸濾紙貼敷法導(dǎo)致的胃潰瘍模型讓大鼠的臟器出現(xiàn)粘連，造成的脾臟創(chuàng)傷比較大，乙酸直接灼燒組發(fā)生的潰瘍呈圓形或橢圓形，中心凹陷，表面粗糙，粘膜缺損，周邊充血水腫。乙酸直接灼燒組發(fā)生的潰瘍深而大，是理想的動(dòng)物模型。

胃潰瘍是攻擊因子與防御因子失衡所致，因此抗?jié)兯幬锏脑u(píng)價(jià)通常檢測(cè)MDA、SOD、NO，這些指標(biāo)涵蓋了組織，分子及基因水平。MDA是攻擊因子，它的含量放映組織受自由基攻擊的損傷程度，SOD、NO和EGF是保護(hù)因子，其活力反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力。乙酸直接灼燒組的MDA含量比較其高，并其SOD活力低，模型組NO含量和EGF的濃度普遍高于正常組，其原因待進(jìn)一步探討。

綜上所述，乙酸直接灼燒導(dǎo)致的胃潰瘍模型是乙酸直接對(duì)胃壁組織侵蝕，損傷胃壁組織引起的慢性胃潰瘍，結(jié)果顯示，乙酸直接灼燒組發(fā)生的潰瘍深而大，與周圍組織粘連小，一般情況接近胃潰瘍病癥狀，是較為理想的大鼠胃潰瘍動(dòng)物模型，適用于慢性胃潰瘍動(dòng)物模型。

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Acetic Acid Type of Rat Gastric Ulcer Model and Evaluation

TONG LaGa MEI Hong QI MuGe WU QiShiSan*

College of Mongolian Medicine of Inner Mongolian University for the Nationalities , Tongliao 028000,China

Objective Establish three kinds of acetic acid type gastric ulcer model in rats and evaluated. Method Will be dividing, sixgroups. After building 14, groups of rats with anesthesia, open, blood, stomach, macroscopic observation point of ulcer after taking pictures, measured by image analysis software Imagej ulcer area; Detection of serum MDA, SOD and the content of NOS and the concentration of EGF.Results Acetic acid injection ulcer surface low, medium and high dose group were smaller, but the medium dose group and high dose group compared with normal group, were statistically significant (P<0.01、P<0.05); The group of acetic acid and the direct burning group of acetic area compared with normal group, there were statistical differences (P<0.01).compared with normal group, acetic acid injection dose group, acetate filter paper sticking group, direct calcination acetate group of serum MDA content were statistically significant (P<0.05、P<0.01).compared with normal group, the serum SOD content of acetic acid directly burning group was statistically different (P< 0.05).compared with normal group, acetic acid injection dose group, acetate filter paper sticking group, direct calcination acetate group of serum NOS content were statistically significant (P<0.05、P<0.01).compared with normal group, the acetic acid injection of high dose group, the acetate filter paper sticking group and the concentration of acetic acid direct calcination group of EGF, were statistically significant (P<0.05、P<0.01).Conclusion The ideal of the gastric ulcer model caused by the direct burning method of acetic acid is suitable for the establishment of rat model of the chronic gastric ulcer.

Rats Stomach Ulcer Model;Acetic Acid type; Establish

通拉嘎(1991-)，女，蒙古族，碩士研究生，研究方向?yàn)槊舍t(yī)病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。E-mail：m15247531585@163.com

吳七十三，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槊舍t(yī)病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。E-mail：qishanwu@126.com

R-332

A

1007-8517(2017)11-0049-04

2017-03-30 編輯：程鵬飛)