槌果藤提取物對CIA小鼠模型Treg和Th17細胞及相關(guān)細胞因子的影響

應(yīng)旭旻周夏娟

槌果藤提取物對CIA小鼠模型Treg和Th17細胞及相關(guān)細胞因子的影響

應(yīng)旭旻員周夏娟2

目的探討槌果藤對膠原誘導關(guān)節(jié)炎（CIA）模型小鼠全血和脾臟的Treg和Th17細胞比例及IL-17和TGF茁1水平的影響。方法25只DBA/1J小鼠，采用牛域型膠原蛋白制備CIA小鼠模型后根據(jù)踝關(guān)節(jié)病變總積分分為正常組（n=5）、生理鹽水組（n=5）、槌果藤低劑量組（0.5g/kg，n= 5）、中劑量組（1.0g/kg，n=5）和高劑量組（1.5g/kg，n=5）。免疫后第21天開始給予槌果藤提取物灌胃，共4周。采用細胞流式儀檢測小鼠血和脾臟Treg和Th17細胞百分比，ELISA法檢測血IL-17和TGF茁1水平。結(jié)果優(yōu)牛域型膠原蛋白誘導的CIA小鼠3周后開始首只小鼠足趾出現(xiàn)紅腫，第7周到達高峰，小鼠造模成功率達90%以上。悠與正常組比較，生理鹽水組小鼠血和脾臟Treg細胞百分比明顯下降［血：（1.17±0.36）%比（7.09±3.86）%，P<0.01）；脾臟：（1.56±0.48）%比（8.03±1.75）%，P< 0.01）］；Th17細胞百分比顯著上升［血：（3.96±2.05）%比（0.57±1.60）%，P<0.01）；脾臟：（8.32±1.62）%比（0.94±0.30）%，P<0.01）］；與生理鹽水組比較，槌果藤低、中、高劑量組血、脾臟Treg細胞百分比上升[血：（2.30±0.21）%、（3.78±1.68）%、（4.51±1.58）%比（1.17±0.36）%，P均<0.01）；脾臟：（2.75±0.74）%、（4.19±1.45）%、（5.28±1.76）%比（1.56±0.48）%，P均<0.01）]，Th17細胞下降［血：（1.78±0.50）%、（1.35±0.36）%、（0.91±0.31）%比（3.96±2.05）%，P均<0.01；脾臟：（3.66±1.69）%、（2.67±0.74）%、（1.70±0.44）%比（8.32±1.62）%，P均<0.01］；憂與正常組比較，生理鹽水組小鼠血清IL-17水平明顯上升［（31.81±7.33）pg/mL比（12.26±4.89）pg/mL，P<0.01］，TGF茁1水平明顯下降［（191.62±112.47）pg/mL比（637.33±97.42）pg/mL，P<0.01］；與生理鹽水組比較，槌果藤低、中、高劑量組血清IL-17水平顯著降低［（17.16±2.34）pg/mL、（16.02±2.78）、（10.46±1.83）pg/mL比（31.81±7.33）pg/mL，P<0.01］，TGF茁1水平顯著升高［（342.63±41.78）pg/mL、（484.76±43.64）pg/mL、（500.83±40.80）pg/mL比（191.62±112.47）pg/mL，P<0.01］。結(jié)論槌果藤提取物對CIA模型小鼠血和脾臟Treg和Th17細胞比例及血IL-17和TGF茁1水平具有調(diào)節(jié)作用。

小鼠；類風濕關(guān)節(jié)炎；膠原誘導性關(guān)節(jié)炎；槌果藤；Treg和Th17細胞；細胞因子

類風濕關(guān)節(jié)炎（則heumatoid arthritis，RA）是一種慢性、進行性、對稱性和全身性的發(fā)病原因尚不明確的自身免疫性疾病，早期出現(xiàn)手、腕、足等關(guān)節(jié)的紅腫熱痛，持久發(fā)作可導致關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞，關(guān)節(jié)功能障礙，甚至致殘。槌果藤（糟apparis spinosa L.）為維吾爾族藥，實驗研究報道有免疫抑制、抗纖維化、抗凝等作用[1-3]。膠原誘導關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）模型是一種由膠原誘導的免疫炎癥模型,為多發(fā)性關(guān)節(jié)炎,在動物模型中表現(xiàn)的紅腫熱痛的病理表現(xiàn)和發(fā)病機制與人類風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）類似。據(jù)統(tǒng)計[4]，我國RA發(fā)病率為14.7/10萬，加權(quán)合并的患病率為0.42%，患者人均年門診費用為（8018±17 238）元。由于目前類風濕關(guān)節(jié)炎治療僅限于控制病情藥物（DMARDs）和非甾體抗炎藥控制癥狀的藥物，無徹底根治、低毒副作用藥物。本研究應(yīng)用CIA模型小鼠研究槌果藤對其免疫細胞功能及細胞因子的影響，探討槌果藤治療RA的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物近交系DBA/1J小鼠25只，雄性，8周齡，體質(zhì)量（25±5）g，上海斯萊克實驗動物中心提供，實驗動物合格證號[SCXK（滬）2012-0002]，浙江中醫(yī)藥大學動物中心SPF級別飼養(yǎng)。分籠飼養(yǎng)，置于室溫（22±2）益，相對濕度（55±5）%，所有小鼠在整個實驗期間均標準飲食，自然晝夜規(guī)律，自由攝食飲水。

1.2 主要試劑與器材牛域型膠原蛋白（chondrex immunization grade bovine type域collagen）（20021）、完全弗氏佐劑（chondrex complete freund's adjuvant）（7027）購自美國Chondrex公司；冰醋酸（杭州紅十字會醫(yī)院中心實驗室提供）；ELISA試劑盒MouseIL-10（555252）、MouseIL-17（559501）、Mouse-TGF茁1（555052）購自eBioscience公司；Anti-Mouse/Rat IL-17A PE（eBioscience 12-7177）、Host/Isotype：Rat IgG2a Kappa、Mouse Regulatory T cell Staining Kit#3（eBioscience 88-8115）:{Anit-Mouse CD4 FITC（RM4-5）、Anti-Mouse CD25 PE CP（61.5）、Anti-Mouse/Rat FOX3 PE-Cy5（FJK-16S）、Rat IgG2a Isotype Control PE-Cy5、Anti-Mouse CD16/32（Fc Block）Purified、Flow Cytometry Staining Buffer、Fixation/permeabilization Concentrate、Fixation/Permeabilization Diluent、Permeabilization Buffer（10X）}、Cell stimulation Cocktail（plus protein transport inhibitors）（500X）（eBioscience 00-4975）、Anti-Mouse CD4 FITC（eBioscience 11-0041）；RPMI-1640（8113007）（上海立菲生物技術(shù)有限公司）；10%水合氯醛、肝素鈉、小鼠灌胃器；100目尼龍網(wǎng)（BD公司）；48孔培養(yǎng)皿、培養(yǎng)箱（HF151）（上海力中科學儀器有限公司）；BioTeK（PowerWave XS+洗板機ELX50美國）；組織勻漿機（IKA T10德國）；離心機（eppendorf Centrifuge 5430 R德國）。

2 實驗方法

2.1 小鼠CIA造模方法及評價牛域型膠原蛋白溶于冰醋酸中，濃度為2mg/mL，放置4益冰箱中隔夜，等體積與完全弗氏佐劑混合,充分乳化后在尾根部皮下注射膠原100滋g/只。第21天后再次皮下注射膠原50～100滋g/只，避免重復第一次注射部位。

疾病嚴重程度評分：正常0分；僅一個關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象1分；超過一個關(guān)節(jié)出現(xiàn)病變2分；4個關(guān)節(jié)都出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象3分；關(guān)節(jié)畸形或僵硬4分。各關(guān)節(jié)病變按5級評分法[5]：無紅腫0分；關(guān)節(jié)紅不腫1分；關(guān)節(jié)輕度紅腫2分；關(guān)節(jié)中度紅腫3分；關(guān)節(jié)重度紅腫伴功能障礙4分。關(guān)節(jié)炎分數(shù)（arthritis score，AS）為每只小鼠所有病變關(guān)節(jié)分數(shù)的總和,最高分為16分。各劑量組所有小鼠關(guān)節(jié)炎分數(shù)之總和除以該組小鼠的只數(shù),即為該組平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)（mean arthritic index，MAI）。

2.2 槌果藤提取物制備首先稱取槌果藤干果切成小片，加95%乙醇于70益水浴中加熱回流1h，傾出煎煮液備用，重復2次，將2次煎煮液合并；接著在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行真空濃縮至固態(tài)，取得提取物后用蒸餾水溶解成1mg/mL，0.22滋m濾過器過濾滅菌，-20益保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 分組及灌胃治療隨機分配為正常組（n=5），造模組（n=20）。造模成功后有小鼠死亡，故根據(jù)造模成功后關(guān)節(jié)病變總積分分為四組：生理鹽水組（等量生理鹽水）（n=5），槌果藤低劑量組（0.5g/kg）（n=5）、中劑量組（1.0g/kg）（n=5）和大劑量組（1.5g/kg）（n=5），灌胃治療周期4周。

2.4 小鼠外周血和脾臟細胞懸液制取10%水合氯醛0.15mL腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠完全麻醉后固定在動物手術(shù)臺上，用無菌手術(shù)剪打開小鼠胸腔暴露心臟，取1mL空針（肝素侵潤后）心臟取血約300滋L，置肝素管備用。立即取出小鼠脾臟，放入無菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中加入PRMI-1640研磨，用無菌磨玻平研碎脾臟，后放入200目尼龍網(wǎng)中過濾制得脾臟細胞懸液，用PRMI-1640調(diào)整細胞濃度為1伊106cell/mL。

2.5 刺激小鼠全血和脾臟IL-17生成取小鼠全血200滋L加200滋L PRMI-1640 1:1等體積混合放置于48孔培養(yǎng)皿1孔中，另取400滋L脾細胞懸液放置于另1孔，加入Cell stimulation Cocktail使終濃度為2滋L/mL,混勻后放入二氧化碳培養(yǎng)箱（37益5%CO2）培養(yǎng)6h取出備用,期間每隔2h混勻1次。

2.6 Treg和Th17細胞檢測脾臟細胞懸液和全血Treg細胞流式檢測：取全血或脾臟細胞懸液50滋L，加入Anit-Mouse CD4 FITC 0.25滋l和Anti-Mouse CD25 PE 0.3滋L混勻后避光置于4益孵育30min,用預冷流式染色緩沖液洗滌細胞（1500rpm 5min），棄上清收集細胞，加入1mL配置好的Fixation/Permeabilization working solution（Fixation/Permeabi-ization Concentrate: Fixation/Permeabiliztion Diluent 1:3），混勻后4益孵育>60min破膜，加入2mL 1伊Permea-bilization Buffer（10伊用蒸餾水稀釋）混勻后洗滌（1500rpm 5min）棄上清取沉淀，重復2次，加入100滋L 1伊Permeabilization Buffer，加入2滋L Anti-Mouse/Rat FOX3 PE-Cy5抗體和2滋LRat IgG2a Isotype Control PE-Cy5同型對照避光4益孵育30min，用2mL Permeabilization Buffer洗滌（1500rpm 5min）棄上清取沉淀，重復2次后加入5mL流式染色緩沖液上機分析。

脾臟細胞懸液和全血Th17細胞流式檢測：取刺激培養(yǎng)后的全血或脾臟細胞懸液50滋L，加入Anti-Mouse CD4 FITC 0.5滋L，避光4益孵育30min，破膜方式同上，加入Anti-Mouse/Rat IL-17A PE 5滋L和對照管加入Host/Isotype:Rat IgG2a Kappa 5滋L同型對照，孵育30min，用2mL Permeabilization Buffer洗滌（1500rpm 5min）棄上清取沉淀，重復2次后加入5mL流式染色緩沖液上機分析。

2.7 小鼠外周血IL-17、TGF TGF茁1水平檢測小鼠心臟取血取完300滋L后立即用1mL空針抽取剩余血液，收集外周血后離心（2500rpm 10min）取上清棄沉淀，分裝后置于-20益冰箱中保存?zhèn)溆茫糜跈z測IL-10、IL-17、TGF TGF茁1活性。ELISA具體操作方法參照eBioscience IL-10、IL-17、TGF茁1 Platinum ELISA說明書嚴格執(zhí)行。

3 結(jié)果

3.1 小鼠免疫后情況免疫后小鼠較未免疫前小鼠毛色無光澤，情緒煩躁，緊張易怒，食欲減退，體質(zhì)量下降。牛C域誘導的DBA/1J小鼠3周后開始首只小鼠足趾出現(xiàn)紅腫，第7周到達高峰。其腫脹多在趾間關(guān)節(jié)開始，隨后腫脹至足墊，踝關(guān)節(jié)，腫脹后可發(fā)展為關(guān)節(jié)僵硬、畸形，前后趾發(fā)病前后不一，前趾發(fā)病率70%，后趾發(fā)病率80%。各組平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)最高為7.1。槌果藤灌胃治療4周后，小鼠毛色無明細改變，情緒平靜，食欲增加，體質(zhì)量無持續(xù)下降。免疫后第21、28、35、42天以小鼠平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)（mean arthriticindex MAI）評價各組小鼠關(guān)節(jié)腫脹程度，與生理鹽水組比較，槌果藤低、中、高劑量組小鼠MAI均降低，腫脹程度減輕。見圖1。

圖1 各組小鼠免疫后關(guān)節(jié)炎指數(shù)

3.2 流式技術(shù)檢測小鼠外周血Treg和Th17細胞比例

與正常組比較，生理鹽水組Treg細胞比例明顯下降（t=3.418，P<0.01）；槌果藤各劑量組Treg細胞比例依次升高，槌果藤低、中、高劑量組Treg細胞比例較均生理鹽水組顯著升高（P均<0.01），槌果藤低、高劑量組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；槌果藤中、高劑量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與正常組比較，生理鹽水組Th17細胞比例明顯上升（t=3.676，P<0.01）；槌果藤各劑量組Th17細胞比例依次下降，槌果藤低、中、高劑量組Th17細胞比例均顯著低于生理鹽水組（P均<0.01），槌果藤高劑量組Th17細胞比例顯著高于低劑量組（P<0.01），見表1。

表1 各組小鼠外周血Treg、Th17細胞比例比較（%，）

表1 各組小鼠外周血Treg、Th17細胞比例比較（%，）

注：與正常組比較，吟P<0.01；與生理鹽水組比較，*P<0.01；與槌果藤低劑量組比較，銀P<0.01

組別正常組生理鹽水組槌果藤低劑量組槌果藤中劑量組槌果藤高劑量組動物數(shù)5 5 5 5 5 Treg 7.09±3.86 1.17±0.36吟2.30±0.21* 3.78±1.68* 4.51±1.58*銀Th17 0.57±1.60 3.96±2.05吟1.78±0.50* 1.35±0.36* 0.91±0.31*銀

3.3 流式細胞技術(shù)檢測小鼠脾細胞懸液Treg和Th17細胞比例與正常組比較，生理鹽水組Treg細胞比例明顯下降（t=7.981，P<0.01）；槌果藤各劑量組Treg細胞比例均依次上升，槌果藤中、高劑量組Treg細胞比例較生理鹽水組顯著升高（P均<0.01）；槌果藤低劑量組Treg細胞比例與生理鹽水組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但明顯低于槌果藤中、高劑量組（P<0.01）。與正常組比較，生理鹽水組Th17細胞比例明顯升高（t=10.024，P<0.01），槌果藤各劑量組Th17細胞比例依次下降，與生理鹽水組比較，槌果藤低、中、高劑量組Th17細胞比例均顯著降低（P均<0.01）；與槌果藤高劑量組比較，槌果藤低劑量組Th17細胞比例顯著降低（P<0.01），見表2。

表2 各組小鼠脾細胞懸液Treg和Th17細胞比例比較（%，）

表2 各組小鼠脾細胞懸液Treg和Th17細胞比例比較（%，）

注：與正常組比較，吟P<0.01；與生理鹽水組比較，*P<0.01；與槌果藤低劑量組比較，銀P<0.01

組別正常組生理鹽水組槌果藤低劑量組槌果藤中劑量組槌果藤高劑量組動物數(shù)5 5 5 5 5 Treg 8.03±1.75 1.56±0.48吟2.75±0.74 4.19±1.45*銀5.28±1.76*銀Th17 0.94±0.30 8.32±1.62吟3.66±1.69* 2.67±0.74* 1.70±0.44*銀

3.4 ELISA檢測小鼠血清IL-17、TGF茁1水平與正常組比較，生理鹽水組血清IL-17水平明顯上升（t=4.962，P<0.01）；槌果藤各劑量組IL-17水平依次下降，槌果藤低、中、高劑量組IL-17水平顯著低于生理鹽水組（P均<0.01）；槌果藤低劑量組血清IL-17水平明顯高于槌果藤高劑量組（P<0.01），與中劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；槌果藤中、高劑量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與正常組比較，生理鹽水組血清TGF茁1水平明顯下降（t= 6.698，P<0.01）；槌果藤各劑量組小鼠血清TGF茁1水平依次升高，槌果藤低、中、高劑量組血清TGF茁1水平顯著高于生理鹽水組（P均<0.01）；槌果藤低劑量組血清TGF茁1水平低于高劑量組（P<0.01）；槌果藤劑中、高劑量組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 各組小鼠血清IL-17和TGF茁1水平比較（pg/mL，）

表3 各組小鼠血清IL-17和TGF茁1水平比較（pg/mL，）

注：與正常組比較，吟P<0.01；與生理鹽水組比較，*P<0.01；與槌果藤低劑量組比較，銀P<0.01

組別正常組生理鹽水組槌果藤低劑量組槌果藤中劑量組槌果藤高劑量組動物數(shù)5 5 5 5 5 IL-17 12.26±4.89 31.81±7.33吟17.16±2.34* 16.02±2.78* 10.46±1.83*銀TGF茁1 637.33±97.42 191.62±112.47吟342.63±41.78* 484.76±43.64* 500.83±40.80*銀

4 討論

RA是自身免疫耐受受損后表現(xiàn)出一系列臨床癥狀及體征的自身免疫性疾病。通過本實驗研究，觀察模型小鼠體質(zhì)量、毛色、情緒、關(guān)節(jié)腫脹情況，結(jié)果顯示，槌果藤提取物能有效緩解CIA模型小鼠發(fā)病情況。

RA的病因目前尚不明確，可能與基因、環(huán)境等因素有關(guān)，但近期免疫研究熱點Treg/Th17細胞失衡在RA發(fā)病中具有重要作用[6]。Treg具有免疫抑制性和免疫無能性兩大特征，在維持機體免疫穩(wěn)定中起到重要作用，其中轉(zhuǎn)錄因子FoxP3是控制這群Treg分化和功能的重要基因，也是特異的標志物[7]。2005年，發(fā)現(xiàn)一群能分泌IL-17A的細胞，定義為Th17細胞，有別于經(jīng)典的Th1和Th2細胞，屬于CD4+細胞，能在核轉(zhuǎn)錄因子ROR-酌t調(diào)控下轉(zhuǎn)錄出特異性IL-17細胞因子，在自身免疫病中發(fā)揮重要的作用[8]。Lubberts等[9]使用IL-17中和抗體或者IL-17基因敲除的小鼠能顯著降低小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率，表明Th17細胞是RA重要的致病性T細胞。Treg和Th17細胞在特定的細胞因子微環(huán)境下可以相互轉(zhuǎn)化初始CD4+T細胞在TGF-茁作用下可分化為Treg細胞，而當TGF-茁和IL-6共同存在時，能夠誘導ROR酌t的表達，促進初始T細胞分化為Th17細胞[10]。

據(jù)研究，類風濕關(guān)節(jié)炎細胞因子的失衡也是類風濕關(guān)節(jié)炎重要的發(fā)病機制。TGF茁是一種既可促炎又可抑炎的雙向調(diào)節(jié)細胞因子。TGF茁1可促進成纖維細胞生長分化、單核巨噬細胞活化、趨化、血管形成，促進炎癥蛋白多糖、成纖維細胞玉型膠原基因表達和關(guān)節(jié)軟骨合成。Park等[11]研究表明，TGF茁1夠提高域型膠原特異性T細胞分化，下調(diào)促炎癥因子的表達、關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)和軟骨的損傷?；顒悠诨GF茁1表達增高，而慢性纖維化期表達降低[12]。本實驗小鼠的關(guān)節(jié)病變出現(xiàn)在活動期，TGF茁1的抑炎作用大于促炎作用。IL-17是早期炎癥因子，也是強致炎因子，可刺激細胞分泌前列腺素E2，粒細胞集落刺激因子和IL-6、IL-8等炎癥因子等，誘導人成纖維細胞表達細胞間黏附分子（ICAM）-1，激活NF-kB轉(zhuǎn)錄活性，也參與誘導基質(zhì)金屬蛋白酶生成和滑膜細胞增生[13-14]。推測槌果藤是通過抑制炎早期炎性因子IL-17，減少后期炎性因子或黏附分子等生成，達到治療目的。

本實驗結(jié)果顯示，生理鹽水組比正常組小鼠踝關(guān)節(jié)組織中促炎性因子IL-17上升，而抑炎性因子TGF茁1明顯下降，佐證小鼠造模成功。與生理鹽水組比較，槌果藤低、中、高劑量組IL-17下降，TGF茁1細胞因子濃度升高（P<0.01），且高濃度量（1.5g/kg）作用最明顯，推測槌果藤可提高TGF茁，既可協(xié)同IL-6上調(diào)Foxp3的表達，促進Treg細胞的生成，抑制Th17的分化，抑制炎癥反應(yīng)及自身免疫反應(yīng)，從而達到治療RA目的。

本研究結(jié)果表明，槌果藤對CIA模型小鼠有治療作用，但未涉及基因?qū)W如何調(diào)控，具體作用機制待進一步研究。

［1］周曉濤，周文濤，馬秀敏，等.槌果藤對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型外周血中細胞因子影響的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23（6）：1382-1384.

［2］曹越蘭，李欣，鄭敏.槌果藤對進行性系統(tǒng)性硬化癥患者成纖維細胞增殖和I型膠原產(chǎn)生的影響［J］.中國中藥雜志，2008，33（5）：560-563.

［3］Wang H，Shi S，Duan J.Structural characterization of a homogalacturonan from Capparis spinosa L.fruits and anti-complement activity of its sulfated derivative［J］.Glycoconjugate journal，2012，29（5-6）：379-878.

［4］曾小峰，朱松林，譚愛春，等.我國類風濕關(guān)節(jié)炎疾病負擔和生存質(zhì)量研究的系統(tǒng)評價［J］.中國循證醫(yī)學雜志，2013，13（3）：300-307.

［5］Cuzzocrea S，AyroldiE，DiPaola R，etal.Role of glucocorticoid-induced TNF receptor family gene（GITR）in collageninduced arthritis［J］.FASEB J，2005，19（10）：1253-1265.

［6］Venkatesha SH，Dudics S，Weingartner E，etal.Altered Th17/ Treg balance and dysregulated IL-1茁response influence susceptibility/resistance to experimental autoimmune arthritis［J］.International Journal of Immunopathology and Pharmacology，2015，28（3）：318-328.

［7］Park MK，Jung YO，Lee SY，et al Erratum to：Amelioration ofautoimmune arthritisby adoptive transfer of Foxp3-expressing regulatory B cells is associated with the Treg/Th17 cell balance［J］.Journalof TranslationalMedicine，2016，14（1）：1-11.

［8］Harrington LE，Hatton RD，Mangan PR，etal.Interleukin 17-producing CD4+effector T cells develop via a l ineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages［J］.Nat Immunol，2005，6（11）：1123-1132.

［9］Lubbters E，Koenders MI，Oppers-Walgreen B，etal.Treatmentwith a neutralizing anti-murine interleukin-17 antibody after the onset of collagen-induced arthritis rreduces joint inflammation，cartilage destruction，and bone erosion［J］.Arthritis Rheum，2004，50（2）：650-659.

［10］BettelliE，Carrier Y，GaoW，etal.Reciprocal developmental pathways for the Generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells［J］.Nature，2006，441（790）：235-238.

［11］Park M，Park H，Cho M，et al.Transforming growth factor茁-transducedmesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune arthritis through reciprocal regulation of Treg/Th17 cells and osteoclastogenesis［J］.Arthritis&Rheumatism，2011，63（6）：1668-1680.

［12］戴冽，葉志強，湯美安，等.類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜轉(zhuǎn)化生長因子茁-1表達及與病理改變的關(guān)系［J］.中華風濕病學雜志，2000，4（6）：357-360.

［13］Kirkham BW，Lassere M N，Edmonds JP，et al.Synovial membrane cytokine expression is predictive of joint damage progression in rheumatoid arthritis：A two-year prospective study（the DAMAGE study cohort）［J］.Arthritis&Rheumatism，2006，54（4）：1122-1131.

［14］郭亞春，高亞賢，宋鴻儒.薯蕷皂苷片含藥血清對IL-17和TNF-琢誘導大鼠滑膜細胞株RSC-364NF-KB p65、STAT3及VEGF影響的實驗研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，33（6）：814-818.

（收稿：2016-07-18修回：2016-10-20）

Effect of Capparis Spinosa L.Extract on Trag and Th17 Cells and Related Cytokines in CIA M ice

YING Xumin1,ZHOU Xiajuan2.1 Hangzhou Red Cross Hospital(now working at Hangzhou Emergency Medical Center), Hangzhou(310003),China;2 Department of General Medicine,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

Objective To investigate the effect of Capparis spinosa L.extract on the percentages of Treg/Th17 cells and the level of IL-17 and TGF茁1 in mice with collagen-induced arthritis（CIA）.M ethods CIA was induced in 25 male DBA/1 Jmice by immunization with bovine type II collagen.According to mean arthritic index（MAI）the successful model mice were divided into 5 groups:normal group（n=5）,control group（n=5,equivalent physiolog ical saline）,low-,medium-,and high-dose Capparis spinosa L.extract group（n=5 in each group,daily dose of 0.5, 1.0,and 1.5g/kg,respectively）.Capparis spinosa L.extract was given by gavage on Day 21 after immunization and lasted 4 weeks.The percentages of Treg and Th17 cells in blood and spleen were detected by flow cytometry,andthe serum levels of TGF茁1 and IL-17 were measured by ELISA.Results The first signs of arthritis appeared in mice 3 weeks after immunization and continued to 7 weeks.The incidence of CIA in mice reached more than 90%. Compared with normal group,control group had significantly decreased percentage of Treg cells（blood:1.17%±0.36% vs 7.09%±3.86%;spleen:1.56%±0.48%vs 8.03%±1.75%;all P<0.01）and increased percentage of Th17（blood: 3.96%±2.05%vs 0.57%±1.60%;spleen:8.32%±1.62%vs 0.94%±0.30%;all P<0.01）.The low-,medium-and highdose drug groups had increased percentages of Treg and decreased percentages of Th17 against control group（blood Treg:2.30%±0.21%,3.78%±1.68%,4.51%±1.58%vs 1.17%±0.36%;spleen Treg:2.75%±0.74%,4.19%±1.45%,5.28%±1.76%vs 1.56%±0.48%;blood Th17:1.78%±0.50%,1.35%±0.36%,0.91%±0.31%vs 3.96%±2.05%;spleen Th17: 3.66%±1.69%,2.67%±0.74%,1.70%±0.44%vs 8.32±1.62%;all P<0.01）.Compared with normal group,the serum level of IL-17 increased（31.81±7.33pg/mL vs 12.26±4.89pg/mL,P<0.01）and TGF茁1 decreased（191.62±112.47pg/mL vs 637.33±97.42 pg/mL,P<0.01）in control group;compared with control group,the serum levels of IL-17 decreased（17.16±2.34pg/mL,16.02±2.78pg/mL,10.46±1.83pg/mL vs 31.81±7.33pg/mL;P<0.01）and the level of TGF茁1 increased（342.63±41.78pg/mL,484.76±43.64pg/mL,500.83±40.80pg/mL vs 191.62±112.47pg/mL;P<0.01）in low-,medium,and high-dose drug groups.Conclusion Capparis spinosa L.Extract can regulate the percentages of Treg and Th17 and the serum levels of IL-17 and TGF茁1 cytokines in mice with CIA.

mice;rheumatoid arthritis;collagen-induced arthritis;Capparis spinosa L.;Treg and Th17 cells; cytokines

杭州市科技計劃項目（No.20110733Q15）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.2011ZA080）

1杭州市紅十字會醫(yī)院（現(xiàn)在杭州市急救中心工作）（3員園園園3）；2浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學科（杭州310006）

應(yīng)旭旻，Tel：0571-87035535；E-mail：xmyin@163.com