雷公藤紅素逆轉乳腺癌細胞對多柔比星的耐藥性及機制研究

孫凱 孫菊萍

雷公藤紅素逆轉乳腺癌細胞對多柔比星的耐藥性及機制研究

孫凱 孫菊萍

目的探討雷公藤紅素逆轉乳腺癌細胞對多柔比星的耐藥性及作用機制。方法將多柔比星耐藥MDA-MB-231細胞（MDA-MB-231/R細胞）分為對照組、雷公藤紅素組、多柔比星組、雷公藤紅素+多柔比星組和雷公藤紅素+多柔比星+Bim siRNA組，MTT法檢測MDA-MB-231/R細胞活力，流式細胞術檢測各組MDA-MB-231/R細胞的凋亡，免疫共沉淀法檢測MDA-MB-231/R細胞Bim蛋白與Bak及Bax蛋白的相互作用，Western blot檢測MDA-MB-231/R細胞色素C釋放和Caspase-3活化。結果MDA-MB-231/R細胞對多柔比星的半數有效濃度（IC50）顯著高于常規(guī)MDAMB-231細胞[（18.4±1.1）g/mL比（1.5±0.1）g/mL，P<0.05]；雷公藤紅素處理后，多柔比星對MDA-MB-231/R細胞活力抑制率和凋亡誘導率均顯著提高，與對照組和多柔比星組比較，差異有統(tǒng)計學意義[（57.3±4.1）%比0、（13.0±1.0）%，（36.5±2.3）%比（1.6±0.2）%、（8.8±0.6）%，P均<0.05]；雷公藤紅素處理能顯著上調MDA-MB-231/R細胞Bim蛋白表達水平[（0.51±0.04）比（0.11±0.01）、（0.13±0.01），P均<0.05]；用Bim siRNA阻斷Bim蛋白上調后，雷公藤紅素對多柔比星的協(xié)同抗腫瘤效應受到明顯抑制[（20.5±2.1）%比（57.3±4.1）%，（12.4±1.1）%比（36.5±2.3）%，P<0.05]；雷公藤紅素處理后，與MDA-MB-231/R細胞Bim蛋白結合的Bak、Bax蛋白表達水平顯著提高[（0.29±0.02）比（0.04±0.01）、（0.05±0.01），（0.35±0.02）比（0.05±0.01）、（0.04±0.01），P均<0.05）]；雷公藤紅素處理后，多柔比星對MDA-MB-231/R細胞色素C的釋放率和Caspase-3的活化率顯著提高[（0.57±0.05）比（0.11±0.02）、（0.06±0.01），P均<0.05；（0.43±0.04）比（0.09±0.02）、（0.03±0.01），P均<0.05]。結論雷公藤紅素可通過上調Bim蛋白表達，提高多柔比星耐藥乳腺癌細胞對多柔比星的敏感性。

乳腺癌；MDA-MB-231細胞；雷公藤紅素；多柔比星；Bim；Bak；Bax

乳腺癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類健康[1]。在乳腺癌的治療過程中，化療是不可替代的治療方法，化療的療效在很大程度上決定了乳腺癌患者的預后[2]。多柔比星是一種細胞毒性抗腫瘤抗生素，能抑制腫瘤細胞DNA和RNA的合成，從而誘導細胞凋亡。盡管多柔比星是治療乳腺癌的重要化療藥物，但該藥的重復給藥可能造成乳腺癌細胞的獲得性藥物抵抗，從而降低化療的治療效果[3]。因此，通過輔助治療手段提高乳腺癌細胞對多柔比星的敏感性，減弱獲得性藥物抵抗是提高多柔比星療效有效方法。本研究探討雷公藤紅素逆轉乳腺癌細胞對多柔比星的耐藥性及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料多柔比星、雷公藤紅素、噻唑藍（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、凋亡檢測試劑盒購于美國Sigma-Aldrich。蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠購于美國Santa Cruz。Bim、Bak、Bax、細胞色素C、活化caspase-3和茁-actin抗體購于美國Cell Signaling。ECL試劑盒購于美國Pierce。細胞線粒體分離試劑盒購于江蘇碧云天生物科技有限公司。Bim siRNA購于廣州銳博生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司。人乳腺癌細胞系MDA-MB-231購于美國ATCC。

1.2 細胞培養(yǎng)人乳腺癌細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37毅C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。多柔比星耐藥MDA-MB-231（MDA-MB-231/R）細胞用多柔比星梯度處理法進行誘導構建，簡要步驟如下：首先將常規(guī)MDA-MB-231細胞用含0.05g/mL多柔比星的培養(yǎng)基培養(yǎng)3個月，之后每3周將多柔比星濃度提高0.01g/mL，最終使MDA-MB-231細胞穩(wěn)定培養(yǎng)在含0.15g/mL多柔比星的培養(yǎng)基中。進行實驗之前，將MDA-MB-231/R在無多柔比星DMEM培養(yǎng)基中先行培養(yǎng)2周以消除殘余多柔比星的干擾。

1.3 多柔比星半數有效濃度（IC50）的測定將常規(guī)MDA-MB-231或MDA-MB-231/R細胞按5伊103/孔接種于96孔板上孵育過夜，分為常規(guī)MDA-MB-231細胞組和MDA-MB-231/R細胞組，將兩組細胞用不同濃度的多柔比星處理48h后進行MTT實驗并繪制細胞活力-多柔比星濃度曲線，根據曲線計算多柔比星對常規(guī)MDA-MB-231細胞和MDA-MB-231/R細胞的IC50。

1.4 MTT實驗將MDA-MB-231/R細胞按5伊103/孔接種于96孔板上孵育過夜，使細胞貼壁。實驗分為對照組、雷公藤紅素組、多柔比星組、雷公藤紅素+多柔比星組及雷公藤紅素+多柔比星+Bim siRNA組，每組3孔。對照組為MDA-MB-231/R細胞不加藥物培養(yǎng)48h，雷公藤紅素組為在MDA-MB-231/R細胞中加入2mol/L的雷公藤紅素培養(yǎng)48h，多柔比星組為在MDA-MB-231/R細胞中加入5g/mL多柔比星培養(yǎng)48h，雷公藤紅素+多柔比星組為在MDA-MB-231/R細胞中加入2mol/L的雷公藤紅素和5g/mL多柔比星培養(yǎng)48h，雷公藤紅素+多柔比星+Bim siRNA組為先將50pmol/mL的Bim siRNA用Lipo-fectamine 2000轉染入MDA-MB-231/R細胞中培養(yǎng)24h，之后更換DMEM培養(yǎng)基再加入2mol/L的雷公藤紅素和5g/mL多柔比星培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后進行MTT試驗，步驟如下：在經過藥物處理的MDA-MB-231/R細胞培養(yǎng)體系中加入20滋L 5mg/mL MTT培養(yǎng)4h，棄去上清，孔中加入150滋L二甲亞砜，在570nm波長下用酶標儀檢測OD值，細胞活力抑制率計算公式：抑制率=（OD對照組-OD藥物處理組）/OD對照組伊100%。

1.5 細胞凋亡實驗將MDA-MB-231/R細胞按上述進行分組和藥物處理，之后按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入細胞中孵育20min，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽性細胞數占總細胞數的百分比表示。

1.6 免疫共沉淀將MDA-MB-231/R細胞按上述進行分組和藥物處理，之后將細胞用細胞裂解液進行裂解，裂解產物在12 000轉/分下離心15min，取上清液，分成等量兩份。一份上清液用于檢測茁-actin的表達作為對照。另一份上清液在其中加入Bim抗體孵育過夜后加入蛋白G瓊脂糖珠孵育2h。將Bim抗體孵育后的產物在1200轉/分低速下離心5min，小心吸去上清留取瓊脂糖珠。瓊脂糖珠用細胞裂解液重懸后進行western blot實驗用于檢測Bim與Bak及Bax蛋白的相互作用。

1.7 線粒體分離將MDA-MB-231/R細胞按上述進行分組和藥物處理，之后用細胞線粒體分離試劑盒分離腫瘤細胞的線粒體，細胞質進行Western blot實驗，檢測細胞色素C的釋放。

1.8 Western blot實驗將MDA-MB-231/R細胞按上述進行分組和藥物處理，之后將細胞用細胞裂解液進行裂解，裂解產物在12 000轉/分下離心15min，提取總蛋白質進行Western blot實驗（免疫共沉淀產物或線粒體分離試劑盒分離出的細胞質可直接進行后續(xù)實驗）。將樣品用12.5%SDS-PAGE進行電泳分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質從分離膠上轉到PVDF膜上，用Bim、Bak、Bax、細胞色素C、活化Caspase-3和茁-actin抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。蛋白灰度值分析用Image J軟件處理，目標蛋白的相對表達水平用它們的蛋白灰度值與茁-actin灰度值的比值表示。

2 結果

2.1 雷公藤紅素抑制MDA-MB-231/R細胞對多柔比星的耐藥性結果顯示,多柔比星對MDA-MB-231/R細胞的半數有效濃度（IC50）顯著高于常規(guī)MDAMB-231細胞（P<0.05），見表1。聯(lián)合雷公藤紅素處理后，多柔比星對MDA-MB-231/R細胞的活力抑制率和凋亡誘導率都顯著提高（P均<0.05），見表2。雷公藤紅素處理能顯著上調MDA-MB-231/R細胞Bim蛋白的表達水平（P均<0.05），而多柔比星單獨處理對Bim無影響。同時，當用Bim siRNA阻斷Bim蛋白的上調后，雷公藤紅素對多柔比星的協(xié)同抗腫瘤效應受到明顯抑制（P均<0.05），見表2。

表1 兩組細胞對多柔比星IC50比較（）

表1 兩組細胞對多柔比星IC50比較（）

注：與常規(guī)MDA-MB-231細胞組比較，*P<0.05；IC50：半數有效濃度

組別孔數多柔比星IC50（滋g/mL）常規(guī)MDA-MB-231細胞組MDA-MB-231/R細胞組3 3 1.5±0.1 18.4±1.1*

2.2 雷公藤紅素促進Bim蛋白與Bak、Bax蛋白的相互作用免疫共沉淀結果顯示，經過雷公藤紅素處理后，與MDA-MB-231/R細胞Bim蛋白結合的Bak、Bax蛋白水平顯著提高（P<0.05），見表3。

表2 雷公藤紅素上調Bim蛋白的表達并提高多柔比星對MDA-MB-231/R細胞的抗腫瘤活性（）

表2 雷公藤紅素上調Bim蛋白的表達并提高多柔比星對MDA-MB-231/R細胞的抗腫瘤活性（）

注：與對照組比較，*P<0.05；與多柔比星組比較，吟P<0.05；與雷公藤紅素+多柔比星組比較，銀P<0.05；Bim：Bcl-2蛋白家族細胞死亡調控分子；Bim siRNA：Bim小干擾RNA；茁-actin：茁-肌動蛋白

組別對照組雷公藤紅素組多柔比星組雷公藤紅素+多柔比星組雷公藤紅素+多柔比星+Bim siRNA組孔數雷公藤紅素濃度（mmol/L）Bim siRNA濃度（pmol/mL）多柔比星濃度（滋g/mL）3 3 3 3 3 0 2 0 2 2 0 0 0 0 5 0 0 0 5 5 5細胞活力抑制率（%）0 7.3±0.6* 13.0±1.0* 57.3±4.1*吟20.5±2.1銀凋亡誘導率（%）1.6±0.2 4.3±0.3* 8.8±0.6* 36.5±2.3*吟12.4±1.1銀Bim/茁-actin比值0.11±0.01 0.53±0.04* 0.13±0.01 0.51±0.04*吟0.09±0.01銀

表3 雷公藤紅素促進Bim蛋白與Bak、Bax蛋白的相互作用（）

表3 雷公藤紅素促進Bim蛋白與Bak、Bax蛋白的相互作用（）

注：與對照組比較，*P<0.05；與多柔比星組比較，吟P<0.05；與雷公藤紅素+多柔比星組比較，銀P<0.05；Bim：Bcl-2蛋白家族細胞死亡調控分子；Bim siRNA：Bim小干擾RNA；茁-actin：茁-肌動蛋白；Bak：Bcl-2拮抗分子；Bax：Bcl-2相關性x促凋亡分子

組別對照組雷公藤紅素組多柔比星組雷公藤紅素+多柔比星組雷公藤紅素+多柔比星+Bim siRNA組孔數雷公藤紅素濃度（mmol/L）Bim siRNA濃度（pmol/mL）多柔比星濃度（滋g/mL）3 3 3 3 3 0 2 0 2 2 0 0 0 0 5 0 0 0 5 5 5與Bim結合的Bak/茁-actin比值0.04±0.01 0.27±0.02* 0.05±0.01 0.29±0.02*吟0.06±0.01銀與Bim結合的Bax/茁-actin比值0.05±0.01 0.33±0.02* 0.04±0.01 0.35±0.02*吟0.04±0.01銀

表4 雷公藤紅素聯(lián)合多柔比星誘導MDA-MB-23/R細胞色素C的釋放和Cappase-3的活化（）

表4 雷公藤紅素聯(lián)合多柔比星誘導MDA-MB-23/R細胞色素C的釋放和Cappase-3的活化（）

注：與對照組比較，*P<0.05；與多柔比星組比較，吟P<0.05；與雷公藤紅素+多柔比星組比較，銀P<0.05；Bim：Bcl-2蛋白家族細胞死亡調控分子；Bim siRNA：Bim小干擾RNA；茁-actin：茁-肌動蛋白；Caspase-3：半胱天冬酶-3

組別對照組雷公藤紅素組多柔比星組雷公藤紅素+多柔比星組雷公藤紅素+多柔比星+Bim siRNA組孔數雷公藤紅素濃度（mmol/L）Bim siRNA濃度（pmol/mL）多柔比星濃度（滋g/mL）3 3 3 3 3 0 2 0 2 2 0 0 0 0 5 0 0 0 5 5 5細胞質中的細胞色素C/茁-actin比值0.01±0.01 0.06±0.01 0.11±0.02* 0.57±0.05*吟0.16±0.02銀活化caspase-3/茁-actin比值0.01±0.01 0.03±0.01 0.09±0.02* 0.43±0.04*吟0.13±0.02銀

2.3 雷公藤紅素聯(lián)合多柔比星誘導MDA-MB-231/ R細胞色素C的釋放和Caspase-3的活化Western blot結果顯示，雷公藤紅素聯(lián)合多柔比星處理后，MDAMB-231/R細胞色素C的釋放和Caspase-3的活化顯著提高（P均<0.05），見表4。

3 討論

雷公藤紅素是一個具有多種生物活性的天然藥物活性成分，來源于中藥雷公藤的根皮，具有很強抗氧化、抗風濕作用。近年研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素還有較好的抗腫瘤活性，對結腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤都有治療作用[4-5]。然而，雷公藤紅素是否對已產生獲得性多柔比星耐藥的乳腺癌細胞有藥物增敏效應，至今還未充分報道。本研究結果表明，已產生獲得性多柔比星耐藥的乳腺癌細胞對多柔比星高度耐藥，然而在使用多柔比星的同時聯(lián)用雷公藤紅素后，多柔比星耐藥的乳腺癌細胞發(fā)生了顯著的凋亡，表明雷公藤紅素能提高多柔比星耐藥乳腺癌細胞對多柔比星的敏感性，中藥雷公藤紅素在多柔比星治療中是良好的輔助治療藥物。

Bim是一種Bcl-2促凋亡蛋白家族成員，主要分布在線粒體的外膜，參與線粒體膜孔道的調節(jié)[6]。文獻[7]報道，Bim的表達水平與腫瘤細胞對藥物的敏感性高度相關，Bim基因的沉默可導致腫瘤細胞凋亡通路的失敏和藥物療效的下降。本研究證實雷公藤紅素能通過上調多柔比星耐藥乳腺癌細胞中Bim蛋白的表達而增強多柔比星對該耐藥腫瘤細胞的殺傷活性，與文獻報道一致。當用小干擾RNA抑制Bim基因的表達后，雷公藤紅素的協(xié)同抗腫瘤效應明顯減弱，表明雷公藤紅素發(fā)揮作用機制可能和Bim蛋白的上調有關。

線粒體途徑的凋亡是多種化療藥物發(fā)揮抗腫瘤效應的機制，主要由Bcl-2蛋白家族進行調節(jié)[8]。Bim蛋白在腫瘤細胞中能與Bak和Bax蛋白發(fā)生相互作用從而使它們活化并導致蛋白構象的變化。在DNA損傷等凋亡信號下，活化的Bak和Bax能在線粒體外膜表面形成通透性外膜孔道，使線粒體中的細胞色素C釋放到細胞質中，從而激活Caspase-3使細胞最終發(fā)生凋亡性死亡[9-10]。本研究結果表明，雷公藤紅素可以通過上調Bim蛋白的表達，促進其與Bak、Bax蛋白的相互作用，使它們發(fā)生活化，從而使多柔比星耐藥乳腺癌細胞在多柔比星的作用下打開線粒體的通透性膜孔道，釋放其中的細胞色素C，最終誘導Caspases依賴的凋亡[11]。

綜上所述，雷公藤紅素能顯著提高耐藥乳腺癌細胞對多柔比星的敏感性。其機制可能是雷公藤紅素能通過Bim-Bak/Bax途徑，誘導耐藥乳腺癌細胞在多柔比星的作用下發(fā)生線粒體途徑的凋亡。

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013［J］.CACancer JClin，2013，63（1）：11-30.

［2］Zhang J，Su B，Chao T，et al.miR-214 promotes apoptosis and sensitizes breast cancer cells to doxorubicin by targeting the RFWD2-p53 cascade［J］.Biochem BiophysResCommun，2016，478（1）：337-342.

［3］Xie X，Hu Y，Gu X，et al.The role of miR-125b-mitochondria-caspase-3 pathway in doxorubicin resistance and therapy in human breast cancer［J］.Tumour Biol，2015，36（9）：7 185-7194.

［4］張志強，高體云，許建華，等.雷公藤紅素通過活性氧誘導結腸癌細胞SW620凋亡［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2015，35（17）：1558-1563.

［5］Mi C，Shi H，Jin X，et al.Celastrol induces the apoptosis of breast cancer cells and inhibits their invasion via downregulation ofMMP-9［J］.OncolRep，2014，32（6）：2527-2532.

［6］Wang X，He X，Lu C，et al.Involvement of Bim in Photofrin-mediated photodynamically induced apoptosis［J］.CellPhysiol Biochem，2015，35（4）：1527-1536.

［7］Wu D，Chen B，Wang M，et al.Hypoxia-induced microRNA-301b regulates apoptosis by targeting Bim in lung cancer［J］.Cell Prolif，2016，49（4）：476-483.

［8］de Graaff MA，de Rooij MA，Bovée JV，et al.Inhibition of Bcl-2 familymemberssensitisessofttissue leiomyosarcomas to chemotherapy［J］.Br JCancer，2016，114（11）：1219-1226.

［9］Han CR，Jun do Y，Kim YH，et al.Prometaphase arrest-dependentphosphorylation of Bcl-2 and Bim reduces the association of Bcl-2 with Bak or Bim，provoking Bak activation and mitochondrial apoptosis in nocodazole-treated Jurkat T cells［J］.Apoptosis，2014，19（1）：224-240.

［10］Chen YT，Song XC，Liang M，et al.Expression of Bim，Bax and Bak in the process of gingipain-induced osteobl-ast apoptosis［J］.Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi，2013，48（5）：272-277.

［11］Zhao J，Wang J，Wu J.Roles of cytochrome c，caspase-9，and caspase-3 in pentavalent vanadium-induced neuronal apoptosis［J］.Zhonghua Lao DongWeiSheng ZhiYe Bing Za Zhi，2014，32（9）：664-667.

（收稿：2016-09-25修回：2016-10-26）

Celastrol Increased the Sensitivity of Doxorubicin-resistant Breast Cancer Cells to Doxorubicin by Upregulating the Expression of Bim

SUN Kai1,SUN Juping2.1 Department of Pathology,2 Clinical Laboratory, the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China

Objective To investigate the role and mechanism of celastrol in reversing the doxorubicin-resistance in breast cancer cells.M ethods The doxorubicin-resistant MDA-MB-231 cells（MDA-MB-231/R cells）were grouped as control group,celastrol group,doxorubicin group,doxorubicin+celastrol group,and doxorubicin+celastrol+Bim siRNA group.Then,the MTT assays were performed to measure the cell viability;Flow cytometry analysis was performed to detect the cell apoptosis;Co-immunoprecipitation analysis was performed to evaluate the interaction of Bim with Bak and Bax;Western blot analysis was performed to evaluate the release of cytochrome c and the activation of caspase-3.Results The IC50 of doxorubicin to MDA-MB-231/R cells was significantly higher than the routine MDA-MB-231 cells（18.4±1.1g/mL vs 1.5±0.1g/mL,P<0.05）.Cell viability inhibitory rate and apoptotic rate of MDA-MB-231/R cells in celastrol+doxorubicin group was significantly higher than that in the control group and the doxorubicin group（57.3%±4.1%vs 0,13.0%±1.0%;36.5%±2.3%vs 1.6%±0.2%,8.8%±0.6%;all P<0.05）.Compared with the control group or the doxorubicin group,treatment with celastrol significantly increased the expression of Bim（0.51±0.04 vs 0.11±0.01,0.13±0.01;P<0.05）and the subsequent interaction of Bim with Bak（0.29±0.02 vs 0.04±0.01,0.05±0.01;P<0.05）and Bax（0.35±0.02 vs 0.05±0.01,0.04±0.01;P<0.05）.Treatment of Bim siRNA significantly inhibited the anti-tumor effect of celastrol+doxorubicin（cell viability inhibitory rate:20.5%±2.1%vs57.3%,±4.1%;apoptotic rate:12.4%±1.1%vs 36.5%±2.3%;all P<0.05）.The release of cytochrome c and activation of caspase-3 in MDA-MB-231/R in the celastrol+doxorubicin group was elevated than those in the doxorubicin group and the celastrol group（cytochrome c:0.57±0.05 vs 0.11±0.02,0.06±0.01;caspase-3:0.43±0.04 vs 0.09±0.02,0.03±0.01;all P<0.05）.Conclusion Celastrol increased the sensitivity of doxorubicin-resistant breast cancer cells to doxorubicin by upregulating the expression of Bim.

breast cancer;MDA-MB-231 cells;celastrol;doxorubicin;Bim;Bak;Bax

浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院病理科（孫凱）、檢驗科（孫菊萍）（杭州310005）

孫凱，Tel：15382362622；E-mail：xinhuasunkai@163.com