miRNA?135a在肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義

李文宏 曾憲成 王捷

miRNA?135a在肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義

李文宏1曾憲成2王捷3*

目的探討miRNA?135a（miR?135a）在肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)20例肝癌組織及其癌旁組織中miR?135a的表達(dá)水平，并通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將miR?135a模擬物（miR?135amimics）轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG2，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR?135a的表達(dá)水平；通過(guò)平板克隆實(shí)驗(yàn)和MTT法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞克隆形成率和存活率的變化，并對(duì)miR?135a調(diào)控相關(guān)靶細(xì)胞的基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，觀察miR?135a在肝癌細(xì)胞維持正常功能中的作用。結(jié)果通過(guò)對(duì)20例肝癌組織及其癌旁組織中miR?135a的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果miRNA?135a的表達(dá)在正常組織中相對(duì)更高，且兩組之間存在顯著性差異（P＜0.05）；與陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染miR?135amimics后HepG2細(xì)胞中miR?135a表達(dá)水平顯著提高（P＜0.05），而形成單克隆能力和細(xì)胞存活率均顯著下降（P＜0.05），同時(shí)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中與miR?135a細(xì)胞調(diào)控相關(guān)靶基因FOS、PI3、Jak2、Stat3的mRNA表達(dá)量相較于NC組均顯著降低（P＜0.05），表明miR?135a表達(dá)提高后抑制細(xì)胞形成單克隆能力并降低存活率。結(jié)論miR?135a在正常組織和肝癌組織中差異表達(dá)，同時(shí)當(dāng)miR?135a表達(dá)提高時(shí)抑制肝癌細(xì)胞形成單克隆能力和降低細(xì)胞存活率，表明miR?135a可能通過(guò)一些相關(guān)靶基因直接或間接調(diào)控HepG2肝癌細(xì)胞的存活，在肝癌的發(fā)生過(guò)程中可能起到作用，miR?135a可能成為臨床治療肝癌和預(yù)后的重要靶點(diǎn)。

miR?135a；HepG2細(xì)胞；miR?135amimics；肝癌

前言

微小RNA（microRNA）是近年在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)高度保守的內(nèi)源性RNA，在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡、腫瘤發(fā)生等過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［1，2］，它主要通過(guò)與靶mRNA特異性堿基配對(duì)引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯，同時(shí)它能調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)［3］，參與發(fā)育、造血、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡，和腫瘤的發(fā)生過(guò)程［4］。目前研究已發(fā)現(xiàn)miRNA與腫瘤、癌癥的發(fā)生存在密切的關(guān)聯(lián)，在一些腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)miRNA存在異常表達(dá)，造成腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移［5］。miRNA?135a是miRNA?135家族的重要組成成員，定位于3號(hào)染色體p21.1，已發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌、結(jié)直腸癌、結(jié)腸癌、肝癌、惡性腦膠質(zhì)瘤等一系列腫瘤發(fā)生過(guò)程中異常表達(dá)，同時(shí)miRNA?135a與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲密切相關(guān)［6-8］。但是miRNA?135a在肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義尚未完全明確。

本研究利用Real?time quantification PCR方法檢測(cè)臨床20例已確診患者的肝癌組織中miRNA?135a的miRNA表達(dá)情況，此外我們利用miRNA?135amimics模擬物轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞存活率和形成單克隆細(xì)胞能力的變化，同時(shí)檢測(cè)與miR?135a調(diào)控相關(guān)的靶基因FOS、PI3、Jak2、Stat3的表達(dá)水平，進(jìn)而研究miRNA?135a在肝癌中的表達(dá)情況以及其在臨床診斷治療中的意義。

1 材料和方法

1.1 肝癌組織標(biāo)本的收集

肝癌病例組織樣本取自廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院（中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院增城院區(qū)）普外科腫瘤標(biāo)本庫(kù)2014年1月至2015年12月手術(shù)切除癌變組織的肝癌患者20例，其中男性13例，女性7例，年齡范圍為32～73歲，平均年齡為52.0±0.5歲。所取樣本均經(jīng)過(guò)病理學(xué)證實(shí)，每例標(biāo)本大小約為1 cm× 1 cm×1 cm，另取上述與其配對(duì)的同一患者癌旁的正常肝組織（距離肝癌組織邊緣約2～3 cm以外，經(jīng)過(guò)病理證實(shí)無(wú)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)）作為對(duì)照組，20例患者術(shù)中、術(shù)前均未接受放療、化療及免疫治療，標(biāo)本收集經(jīng)過(guò)廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬均知情同意。所取標(biāo)本均在離體后30min內(nèi)經(jīng)過(guò)無(wú)菌無(wú)核酸酶水沖洗后置于凍存管，液氮迅速冷凍后放入-80℃冰箱中保存。

1.2 試劑和儀器

RNA提取試劑盒購(gòu)于廣州永諾生物科技有限公司，熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于TAKARA（日本）；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，HepG2細(xì)胞株購(gòu)自廣州永諾生物科技有限公司，MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，人miRNA?135a模擬物（miR?135amimics）序列UAUGGCUUUUUAUUC?CUAUGUGA、miRNA?135a模擬物陰性對(duì)照（nega?tive control，miR?135a mimics NC）序列UUCUCC?GAACGUGUCACGUTT，均購(gòu)自廣州永諾生物科技有限公司；儀器為美國(guó)Bio?Rad熒光定量PCR儀；引物設(shè)計(jì)與合成由深圳華大基因研究院提供。

1.3 miR?135a在肝癌組織與正常癌旁組織中的表達(dá)

1.3.1 組織中總RNA的提取使用廣州永諾生物科技有限公司試劑盒提取總RNA，分別稱(chēng)取100mg肝癌組織及癌旁組織，常溫下加入裂解液1mL篩網(wǎng)研磨，吸取裂解液后加入氯仿混勻；4℃下離心后留取上清液約400μL，加入等體積聚合液后混勻倒入內(nèi)置管，經(jīng)過(guò)洗脫液2次洗脫，4次高速離心交叉進(jìn)行，將內(nèi)置管套入新的Ep管中，在膜中央加入5μLRNase?free H2O，靜置1min后離心獲得總RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)收集到RNA的OD260/280值。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real?time quantification PCR）實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)采用廣州永諾生物科技有限公司miRNA Real?time PCR Assay Kit實(shí)時(shí)定量反應(yīng)體系，采用美國(guó)Bio?Rad實(shí)時(shí)反應(yīng)PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。以U6作為內(nèi)參，檢測(cè)miRNA?135a的表達(dá)。反應(yīng)體系中所用的引物如下：

miRNA?135a F：5′?TGCTTTGTCTACATTTGG?GA?3′

miRNA?135a R：5′?ATTCTAACATTTCTCACAT TCA?3′

內(nèi)參U6 F：5′?CGCTTCGGCAGCACATATAC?3′

R：5′?TTCACGAATTTGCGTGTCAT?3′。

反應(yīng)體系的總體積為20μL，其中包含2× miRNA qPCR Mix（With SYBR Green）10μL，正向引物（Forward primer）0.4μL，濃度10μM，反向引物（Reverse primer）0.4μL，濃度10μM，剩余體積用雙蒸水補(bǔ)齊。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min，然后94℃20 s、60℃20 s和72℃40 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.4 miRNA?135amimics模擬物轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞及其對(duì)細(xì)胞形成單克隆能力和存活率的影響

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及miRNA?135amimics轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并置于37℃恒溫、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)至細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨機(jī)將細(xì)胞分成轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組（negative control，NC）和轉(zhuǎn)染miRNA?135amimics組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，PBS洗滌2次，0.25%胰酶消化后，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)細(xì)胞/mL，將HepG2細(xì)胞接種到6孔培養(yǎng)板上，12 h后細(xì)胞達(dá)到80%～90%的融合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

用250μL無(wú)血清培養(yǎng)基分別稀釋LipofectamineTM2000（5μL）和miRNA?135amimics（5μL）或陰性對(duì)照mimics（5μL）。溫育5min后混合稀釋好的LipofectamineTM2000和mimics，用手指彈勻，溫育25min后分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞在37℃、5% CO2中孵育6 h后更換正常細(xì)胞培養(yǎng)基，HepG2細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)60 h。陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞用0.25%的胰酶消化并離心。PBS液重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至EP管中（每組各收集1管），10 000×g離心5min。各EP管內(nèi)加入細(xì)胞裂解液（8mol/L尿素，4%CHAPS，5mL/L 2%Bio?lyte，1%TBP）300μL，冰浴30 min（期間振蕩2～3次）后15 000×g離心30 min。上清液采用Branford法測(cè)定蛋白濃度。重復(fù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)程并分批收集細(xì)胞3批。

1.4.2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的單克隆形成能力細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞稀釋成1×104cell/mL，再稀釋成1×103cell/mL接種于96孔板，分別吸取50μL接種即50個(gè)cell/孔，100μL接種即100個(gè)cell/孔，200μL接種即200個(gè)cell/孔。每組細(xì)胞設(shè)立3個(gè)平行復(fù)孔。然后讓細(xì)胞在含10%FBS的DMEM（高糖）培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，最后用結(jié)晶紫染色細(xì)胞克隆。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果中平板為1次代表性的結(jié)果。計(jì)算克隆形成率%=（單克隆細(xì)胞數(shù)÷接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.4.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR?135a mimics轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞存活率在實(shí)驗(yàn)前一天將細(xì)胞以1× 105cell/mL的密度接種于96孔板，100μL/孔，培養(yǎng)12 h后待細(xì)胞貼壁，每孔加入MTT溶液10μL，反應(yīng)4 h后棄去培養(yǎng)液，加入DMSO 150μL/孔，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光值，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)OD值?空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值?空白對(duì)照組OD值）×100%。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miRNA?135a相關(guān)調(diào)控靶基因表達(dá)

HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA?135a后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)在miRNA?135a表達(dá)提高的情況下相關(guān)調(diào)控靶基因FOS、PI3、Jak2、Stat3的mRNA表達(dá)水平。四種基因和內(nèi)參基因引物序列如表1所示。反應(yīng)體系的總體積為20μL，其中包含2× miRNA qPCR Mix（With SYBR Green）10μL，正向引物（Forward primer）0.4μL，反向引物（Reverse primer）0.4μL，miRNA 0.5μL，剩余體積用雙蒸水補(bǔ)齊。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min，然后94℃20 s、60℃20 s和72℃40 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

表1 FOS、PI3、Jak2、Stat3基因引物序列

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

待測(cè)miRNA的表達(dá)量采用2?△△CT法確定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，計(jì)量資料先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，進(jìn)一步的組間表達(dá)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA?135a在肝癌組織中的表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定20例肝癌病例組織與正常癌旁組織中的miRNA?135a表達(dá)水平，以距離肝癌組織邊緣2～3 cm的正常組織（癌旁組織）作為對(duì)照組。結(jié)果顯示（如表2及圖1散點(diǎn)圖所示），miRNA?135a在正常組織和肝癌組織中均有表達(dá)；將癌旁正常組織和肝癌組織兩組樣本用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，miRNA?135a的表達(dá)在正常組織中相對(duì)更高，且兩組之間存在顯著性差異（P＜0.05）。

表2 20例臨床肝癌組織中m iRNA?135a的表達(dá)水平

2.2 轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞中miR?135a的表達(dá)水平

人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組（negative control，NC）、轉(zhuǎn)染miRNA?135a inhibitor組和轉(zhuǎn)染miRNA?135a mimics組，轉(zhuǎn)染48 h后分別收集inhibitor及mimics組細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA?135a的表達(dá)。結(jié)果顯示，miR?135a在陰性對(duì)照組HepG2細(xì)胞中的本底表達(dá)較低，幾乎難以被檢測(cè)到。細(xì)胞株內(nèi)miR?NA?135a含量太低，抑制miRNA?135a無(wú)意義，取消抑制組。而轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miRNA?135a的表達(dá)水平相較于陰性對(duì)照組（NC）顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），如圖2?？梢?jiàn)，轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞miRNA?135a表達(dá)提高。

圖1 20例肝癌及癌旁組織中m iRNA?135a表達(dá)散點(diǎn)圖

圖2 m iRNA?135a在轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 miRNA?135a轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞單克隆形成能力和細(xì)胞存活率的影響

為研究轉(zhuǎn)染miRNA?135a對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞克隆形成率的影響，采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)（PCF）檢測(cè)兩組細(xì)胞形成單克隆的能力。NC組和轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)后分別計(jì)數(shù)，各吸取兩組細(xì)胞50、100、200個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，兩組細(xì)胞克隆形成率如表3所示，圖3為三次平板實(shí)驗(yàn)中具有代表性的一次結(jié)果。結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA?135amimics后細(xì)胞形成率明顯減少（接種細(xì)胞個(gè)數(shù)50，P＜0.05；接種細(xì)胞個(gè)數(shù)100，P＜0.05；接種細(xì)胞個(gè)數(shù)200，P＜0.05），不同細(xì)胞接種數(shù)下兩組細(xì)胞的克隆形成率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？梢?jiàn)，HepG2細(xì)胞中miRNA?135a表達(dá)量升高時(shí)會(huì)降低細(xì)胞形成單克隆的能力。

圖3 NC組和轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞平板克隆形成情況

采用MTT比色法測(cè)定轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞的存活率，如圖4，結(jié)果顯示，HepG2轉(zhuǎn)染miRNA?135amimics后，第一天細(xì)胞存活率（48.5±0.7）%相較于NC組（51.0±1.3）%（F=0.576，P＞0.05），第二天細(xì)胞存活率（67.2±1.0%）相較于NC組（72.9±3.3）%（F=6.622，P＞0.05）無(wú)顯著差異，第三天細(xì)胞存活率（78.5±1.4）%相較于NC組（92.0±2.2）%（F= 1.535，P＜0.05）顯著下降?？梢?jiàn)轉(zhuǎn)染miR?135a的HepG2細(xì)胞存活率明顯下降。

2.4 調(diào)控miR?135a相關(guān)靶基因的表達(dá)

miRNA?135a模擬物轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞，進(jìn)一步檢測(cè)miR?135a表達(dá)提高對(duì)相應(yīng)靶基因FOS、PI3、Jak2、Stat3表達(dá)的影響。如圖5所示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中FOS、PI3、Jak2、Stat3的mRNA表達(dá)量相較于NC組均顯著降低（P＜0.05）。

表3 轉(zhuǎn)染m im ics后HepG2細(xì)胞克隆形成率

表3 轉(zhuǎn)染m im ics后HepG2細(xì)胞克隆形成率

注：與NC組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

細(xì)胞接種數(shù)/個(gè)50 100 200 NC組單克隆形成率/% 44.5±0.41 48.2±0.24 50.5±0.67 mimics組單克隆形成率/% 8.7±0.26**11.8±0.24**14.3±0.56**

圖4 NC組和轉(zhuǎn)染組HepG 2細(xì)胞存活率

3 討論

圖5 HepG2細(xì)胞中m iR?135a可能調(diào)控靶基因mRNA水平

由于腫瘤基因治療和分子靶向治療手段上的發(fā)展和進(jìn)步，目前對(duì)肝癌治療的研究在用藥、化療聯(lián)合靶向基因治療方面非?；钴S。miRNA是一類(lèi)能調(diào)控基因表達(dá)的因子，與癌癥的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)，人類(lèi)腫瘤中存在miRNA的失衡表達(dá)，miRNA在不同類(lèi)型的腫瘤中表達(dá)情況不同［9，10］。miR?135家族編碼三個(gè)miRNAs定位于染色體3p21.1、12q23.1、1q32.1，其中miR?135a是miR?135家族的重要成員之一［11］，在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，miR?135a與癌癥細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲有關(guān)。

本研究通過(guò)檢測(cè)miR?135a在20例肝癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR?135a在肝癌組織與癌旁組織中差異表達(dá)，且有3組樣品miR?135a的表達(dá)在肝癌組織中顯著高于相對(duì)應(yīng)的癌旁組織，15組樣品miR?135a的表達(dá)在癌旁組織中顯著高于肝癌組織，這就提示miR?135a可能與肝癌的發(fā)生機(jī)制相關(guān)，也可能成為肝癌診斷和預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)，Shin等人發(fā)現(xiàn)miR?135a在胃癌中的表達(dá)量與臨床分期呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)［12］，這就預(yù)示著miR?135a在腫瘤中的表達(dá)量與患者的臨床分期、治療情況密切相關(guān)；我們利用miR?135a轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)miR?135a的表達(dá)量顯著提高，同時(shí)細(xì)胞形成單克隆能力和細(xì)胞存活率均顯著下降，說(shuō)明肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR?135a會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，起到抑癌的作用。殷保兵等人發(fā)現(xiàn)miR?135a在膽囊癌中具有抑癌作用，且在膽囊癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，在膽囊癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR?135a可通過(guò)G1期阻滯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，且可能是通過(guò)調(diào)控VLDLR基因?qū)崿F(xiàn)的［13］，Tang等人發(fā)現(xiàn)miR?135a通過(guò)調(diào)節(jié)HOXA10的表達(dá)在卵巢上皮癌中發(fā)揮抑癌的作用［8］。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)過(guò)表達(dá)miR?135a時(shí)FOS、PI3、Jak2、Stat3表達(dá)均受到抑制，Wu等人發(fā)現(xiàn)miR?135a能抑制胃癌細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步探究其靶向基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR?135a直接影響Jak2的表達(dá)，Jak2是細(xì)胞因子通路中的一種細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶，miR?135a表達(dá)上調(diào)時(shí)直接導(dǎo)致Jak2表達(dá)下調(diào)并減少Sata3激活，說(shuō)明Jak2和Stata3均是miR?135a發(fā)揮抑癌作用的靶向基因［14］。因此可以推斷miR?135a過(guò)表達(dá)降低肝癌細(xì)胞的存活起到抑制肝癌發(fā)生的作用，并且這些生物學(xué)功能的改變是因?yàn)閙iR?135a過(guò)表達(dá)引起細(xì)胞內(nèi)相關(guān)靶基因表達(dá)水平改變所致。本研究表明miR?135a在肝癌細(xì)胞中與正常組織中存在差異表達(dá)，且在肝癌細(xì)胞的發(fā)生進(jìn)程中起到抑制作用，它可能成為肝癌生物治療中的一個(gè)候選靶點(diǎn)。

［1］Li L，Liang H，Wang Y，et al.microRNA?141 inhibits cell proliferation and invasion and promotes apoptosis by targeting hepatocyte nuclear factor?3βin hepatocellular carcinoma cells［J］.BMC cancer，2014，14：879.

［2］Yunqiao L，Vanke H，Jun X，Tangmeng G.MicroRNA?206，down?regulated in hepatocellular carcinoma，suppresses cell proliferation and promotesapoptosis［J］.Hepatogastroenterology，2014，61（133）：1302-1307.

［3］Chen Y，Zhang J，Wang H，et al.miRNA?135a promotes breast cancer cellmigration and invasion by targeting HOXA10［J］.BMC cancer，2012，12：111.

［4］Zamore PD，Benjamin H.Ribo?gnome：the big world of small RNAs［J］.Science，2005，309（5740）：1519-1524.

［5］Tang H，Li RP，Liang P，et al.miR?125a inhibits themigra?tion and invasion of liver cancer cells via suppression of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway［J］.Oncol Lett，2015，10（2）：681-686.

［6］Yamada Y，Hidaka H，Seki N，et al.Tumor?suppressivemi?croRNA?135a inhibits cancer cell proliferation by targeting the c?MYC oncogene in renal cell carcinoma［J］.Cancer Sci，2012，104（3）：304-312.

［7］Ren JW，Li ZJ，Tu C.MiR?135 post?transcriptionally regulates FOXO1 expression and promotes cell proliferation in humanma?lignantmelanoma cells［J］.Int JClin Exp Pathol，2014，8（6）：6356-6366.

［8］Weiwei T，Yi J，Xiaoxin M，Lei X.MiR?135a functions as a tumor suppressor in epithelial ovarian cancer and regulates HOXA10 expression［J］.Cell Signal，2014，26（7）：1420-1426.

［9］Zhou W，Li X，Liu F.MiR?135a promotes growth and invasion of colorectal cancer viametastasis suppressor 1 in vitro［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2012，44（10）：838-846.

［10］Leung CON，Wen D，Tian?Min Y，et al.miR?135a leads to cervical cancer cell transformation through regulation ofβ?catenin via a SIAH1?dependent ubiquitin proteosomal pathway［J］.Carcinogenesis，2014，35（9）：1931-1940.

［11］湯偉偉.miR?135a及17?β雌二醇在卵巢上皮性癌中作用的研究［D］.南京醫(yī)科大學(xué)，2011.

［12］Shin JY，Kim YI，Cho SJ，et al.MicroRNA 135a suppresses lymph node metastasis through down?regulation of ROCK1 in early gastric cancer［J］.PLoSOne，2014，9（1）：e85205.

［13］殷保兵，王一飛，楊光華，等.miR?135a?5p抑制膽囊癌細(xì)胞增殖的研究［J］.外科理論與實(shí)踐，2014，22（2）：140-144.

［14］Wu H，Huang M，Cao P，etal.MiR?135a targets JAK2 and in?hibits gastric cancer cell proliferation［J］.Cancer Biol Ther，2012，13（5）：281-288.

Expression ofm iRNA?135a in the Hepatic carcinoma and its clinical significance

Objective To explore the expression ofmiRNA?135a（miR?135a）in the hepatic carcinoma and its clinical significance.M ethods The level of expression ofmiR?135a in the hepatic carcinoma tissues of 20 patients with hepatic carcinoma and the commensurate adjacent normal liver tissueswere detected by real?time quantitation PCR.HepG2 cellswere transfected withmiR?135amimics mediated by liposomal transfection reagent and the expression of miR?135a in the transfected HepG2 cellswere detected by real?time quantitation PCR.The changesof cell clone formation ratand cellviability were analyzed by tablet clone formation experiment（PCF）and MTTmethod，respectively.Meanwhile，the expression of the related genes ofmiR?135a regulation were analyzed to discover the role ofmiR?135a in maintain normal function.Results The miR?135a was detected in both hepatic carcinoma and commensurate adjacent normal liver tissues.The expression ofmiR?135a in the commensurate adjacentnormal liver tissues were significantly higher than that in the hepatic carcinoma（P＜0.05）.Compared with negative control，the expression ofmiR?135a in themiR?135amimics transfected HepG2 cellswas significantly increased（P＜0.05），however，the clone formation rate and viability were significantly decreased（P＜0.05）.And the expression ofmiR?135a regulation related genes including FOS，PI3，Jak2，Stat3 were all down regulated（P＜0.05）.These data suggested that the up?regulated ofmiR?135a could inhibited the clone formation rate and decrease the cell viability.Conclusion miR?135a was differently expression in hepatic carcinoma and normal liver tissues and the up?regulated ofmiR?135a could inhibited the clone formation rate and decrease the cell viability.miR?135a contributed to the viability and occurrence of hepatic carcinoma by regulated of the related genes directly or indirectly，miR?135amay became the important target for clinical treatmentand prognosis ofhepatic carcinoma.

miR?135a；HepG2；miR?135amimics；Hepatic carcinoma

R735.7

A

10.3969/j.issn.1009?976X.2017.03.002 LIWenhong1，ZENG Xiancheng2，WANG Jie3.1Department ofGeneralSurgery，Zengcheng People′s Hospital，Guang?zhou 511300，China；2Department of General Surgery，the 2nd Provincial Hospital of Guangdong，Guangzhou 518037，China；3Department ofHepatobiliary and Pancreatic Surgery，Sun Yat?sen Memorial Hospital，Sun Yat?sen University，Guangzhou 510120，China.Corresponding author：WANGJie，sumsjw@ 163.com

2017-03-19）

2014年廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導(dǎo)項(xiàng)目（20141A010111）；廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院青年醫(yī)學(xué)人才培育基金（2015-QN-004）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013J4100081）；廣州市衛(wèi)生局項(xiàng)目（20141A011117；20151A011112）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81372565）

1511300廣州增城區(qū)人民醫(yī)院普外科；2518037廣州廣東省第二人民醫(yī)院普外二科；3510120廣州中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院肝膽胰外科

*通訊作者：王捷，E?mail：sumsjw@163.com