小鼠中兩種感覺功能評價方法的比較

陳美玲 李莉 陳煜穎 陳炳豪 宋衛(wèi)東 王川 嚴勵 楊川

小鼠中兩種感覺功能評價方法的比較

陳美玲 李莉 陳煜穎 陳炳豪 宋衛(wèi)東 王川*嚴勵 楊川

目的比較熱板測痛試驗與up?down測試機械痛這兩種感覺功能評價方法的穩(wěn)定性、準確性。方法用10只體重20～25 g的雄性C57BL/6J小鼠，分別用智能熱板測痛儀、Von Frey Hair Test纖維絲測痛儀進行熱痛的反應(yīng)潛伏期、50%機械性撤足閾值的測試，比較這兩種感覺功能評估方法的穩(wěn)定性、準確性。結(jié)果3次測量的熱痛的反應(yīng)潛伏期分別為26.24±7.36 s、22.28±7.78 s、20.80±6.85 s，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；左足3次測量的機械性撤足閾值分別為：2.69±1.22 g、2.71±1.19 g、2.58±1.15 g，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；右足3次測量的機械性撤足閾值分別為：2.97±1.07 g、2.99±1.03 g、2.99±1.04 g，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論3次測量的熱痛之間無明顯差異，3次測量的左右足機械痛之間無明顯差異。

感覺功能；熱痛；機械痛

感覺功能檢查包括淺感覺、深感覺、復(fù)合感覺多重方向，主要檢查單一神經(jīng)支配區(qū)的觸覺、痛覺、壓覺、溫度覺、兩點辨別覺、振動覺及復(fù)合感覺。感覺功能障礙以淺感覺障礙為主包括觸覺痛覺溫度覺。感覺功能的檢查對神經(jīng)功能情況的判斷有重要意義［1］。周圍神經(jīng)損傷后感覺功能障礙主要表現(xiàn)為感覺減退或消失、感覺過敏、主觀麻木感、自發(fā)疼痛等。實驗中常使用的測定感覺功能的方法包括：熱板測痛試驗、光熱甩尾試驗、壓爪實驗、50%機械性撤足閾值的測試等行為學(xué)實驗。由于行為學(xué)實驗跟操作者的差異、實驗動物之間的個體差異、同一動物前后測量的差異、實驗條件等因素的影響，導(dǎo)致行為學(xué)實驗相對不穩(wěn)定、客觀性降低，本研究主要比較熱板測痛試驗測定小鼠對熱痛的反應(yīng)潛伏期，經(jīng)典的up?down測試法檢測小鼠的機械性撤足閾值這兩種方法的穩(wěn)定性、準確性等方面的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J小鼠，體重20～25 g，雄性，10只；儀器：YLS?6A型智能熱板測痛儀（上海精密儀器儀表有限公司）、Von Frey Hair Test纖維絲測痛儀（美國Stoelting公司）。實驗方法：小鼠的購買和飼養(yǎng)實驗動物來源：SPF級野生型近交系C57BL/6J小鼠由中山大學(xué)動物實驗中心提供。飼養(yǎng)在中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中藥與海洋藥物實驗室SPF級屏障環(huán)境動物房進行，按照SPF級動物飼養(yǎng)標準進行飼養(yǎng)，屏障環(huán)境內(nèi)溫度控制在20～25℃，濕度為40%～70%，采用12 h/12 h晝夜明暗交替照明。飼料、墊料、飲水均經(jīng)過高溫高壓滅菌處理，墊料每周更換2～3次。飼養(yǎng)員及研究員的各項操作均嚴格按照屏障環(huán)境標準操作規(guī)程執(zhí)行。

1.2 試驗方法和步驟

1.2.1 熱板測痛試驗小鼠在室內(nèi)適應(yīng)30min；熱板測痛儀調(diào)至50℃，將透明有孔玻璃罩于熱板周圍；將小鼠放置于熱板上，同時開始計時；以小鼠舔后足、原地跳躍或明顯縮腿為反應(yīng)陽性，立即終止計時，記錄反應(yīng)潛伏期（latency）。每只小鼠重復(fù)3次試驗，分3天實驗，每天早上9：00開始測量。

1.2.2 50%機械性撤足閾值的測試使用經(jīng)典的up?down測試法檢測小鼠的機械性撤足閾值［2］。第一次正式測試動物前，需要讓動物在測試環(huán)境適應(yīng)2～3次，每次30min，目的是防止動物因探索新環(huán)境等行為而影響測試結(jié)果。以后的每次正式測試前，動物也需要有約30min的適應(yīng)時間。待動物安靜后，才能正式測試。在保證實驗環(huán)境安靜且光照適宜后，將待測小鼠置于2mm×2mm孔隙的金屬網(wǎng)格上。用固定大小的有機玻璃盒隔開各只小鼠（一次可放6只），待小鼠適應(yīng)0.5 h后，測定小鼠的機械縮足反射閾值（PWT）。使用不同刺激強度的Von Frey Filaments（vFFs）刺激小鼠的第3、4足趾的趾間皮膚，觀察小鼠可能發(fā)生的縮足反應(yīng)。刺激強度一般從0.4 g開始，若vFFs纖維絲彎曲超過90°時，若小鼠仍不發(fā)生抬足，則視為無反應(yīng)。此時應(yīng)給予相鄰的刺激強度大一級的纖維絲；如果有反應(yīng)，則更換相鄰的刺激強度小一級的纖維絲。每次刺激時間間隔必須大于10 s，直到找到能引起50%抬足反應(yīng)的纖維絲。本實驗中最大刺激強度值為4.0 g，記錄所測小鼠的能引起50%抬足反應(yīng)的纖維絲刺激強度值，即為機械縮足反射閾值（g）。將結(jié)果輸入cellG軟件，得到機械性撤足閾值（PawWithdraw Threshhold）的數(shù)據(jù)［3］。每只老鼠測量3次，分三天進行實驗，每天上午9：00開始實驗。與熱板測痛實驗分開在不同的天數(shù)進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，行單因素方差分析，均數(shù)間差別兩兩比較用LSD及Bonferroni檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熱板測痛試驗

C57小鼠第1次測量的熱痛的反應(yīng)潛伏期26.24±7.36 s，95%CI：20.97～31.51；第2次反應(yīng)潛伏期22.28±7.78 s，95%CI：16.71～27.84，；第3次反應(yīng)潛伏期20.80±6.85 s，95%CI：15.90～25.70。P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。（圖1熱板測痛試驗）2.2 50%機械性撤足閾值的測試

圖1 熱板測通試驗

C57小鼠左足第1次測量的機械性撤足閾值：2.69±1.22 g，95%CI：1.81～3.56；第2次測量的機械性撤足閾值2.71±1.19 g，95%CI：1.86～3.57；第3次測量的機械性撤足閾值2.58±1.15 g，95%CI：1.76～3.41。P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

C57小鼠右足第1次測量的機械性撤足閾值：2.97±1.07 g，95%CI：2.20～3.74；第2次測量的機械性撤足閾值2.99±1.03 g，95%CI：2.25～3.73；第3次測量的機械性撤足閾值2.99±1.04 g，95%CI：2.26～3.74。P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2 50%機械性撤足閾值的測試）

圖2 50%機械性撤足閾值的測試

3 討論

感覺由神經(jīng)纖維傳導(dǎo)，按周圍神經(jīng)纖維的直徑大小和傳導(dǎo)速度不同，神經(jīng)纖維還可被分為A、B、C三類，A依據(jù)其平均傳導(dǎo)速度，又進一步分為α、β、γ、δ四類。感覺（觸覺、壓覺、溫度覺）神經(jīng)和運動神經(jīng)傳導(dǎo)的神經(jīng)纖維互不相同。由于神經(jīng)纖維的不同，導(dǎo)致對不同的感覺反應(yīng)性可能不同。臨床上應(yīng)用的神經(jīng)功能評價主要是針對運動功能、感覺功能、自主神經(jīng)功能以及神經(jīng)電生理等的評價［4］。感覺功能的檢查對神經(jīng)功能情況的判斷有重要意義。臨床上，神經(jīng)功能評價還是主要依賴被檢者的癥狀、體征及量化評分表，主觀性較強，目前神經(jīng)電生理檢查、肌電檢查和體感誘發(fā)電位對于判斷神經(jīng)損傷的部位和程度以及幫助觀察損傷神經(jīng)再生及恢復(fù)情況有著重要價值［5］，另外神經(jīng)活檢的限制性較大，也受被檢者的意愿影響，普遍進行的可能性很低。但是對觸覺、痛覺、壓覺、溫度覺等感覺的評估仍然是目前感覺功能的評估中必不可缺的極其重要部分。

在動物實驗中，感覺神經(jīng)功能的評價行為學(xué)實驗是很重要的一部分，也有很多神經(jīng)功能評分標準，幾種常用的評分標準跟臨床神經(jīng)功能評分相似［6］。另外電生理實驗、神經(jīng)活檢也對神經(jīng)功能的評價有重要作用，且電生理實驗、神經(jīng)的組織學(xué)實驗更具有客觀性、準確性，但是行為學(xué)實驗測量痛覺、壓覺、溫度覺等對實驗動物感覺功能的評價起著十分重要的作用。在測量感覺功能的行為學(xué)實驗受操作者的差異、實驗動物之間的個體差異、同一動物前后測量的差異、實驗條件等因素的影響，導(dǎo)致行為學(xué)實驗相對不穩(wěn)定、客觀性降低。本研究主要比較熱板測痛試驗測定小鼠對熱痛的反應(yīng)潛伏期，經(jīng)典的up?down測試法檢測小鼠的機械性撤足閾值這兩種方法的穩(wěn)定性、準確性等方面的差異。熱痛測量實驗中，后進行的熱痛反應(yīng)潛伏期有降低的趨勢，可能與動物的學(xué)習(xí)、記憶、敏感性降低［7］等有關(guān)；但是左、右足的機械痛的閾值測量中前后都無明顯差異，且左右足的閾值接近，推測50%機械性撤足閾值的測試實驗更具穩(wěn)定性、準確性的可能性。另外，在科研實驗中，深入研究感覺神經(jīng)功能的機制、通路、疼痛因子等［8，9］，探討出現(xiàn)感覺功能改變可能出現(xiàn)的分子改變，可對感覺功能的評價進行更好的詮釋，更具客觀性、準確性，也更具有實驗意義和臨床價值。

［1］Omer GE Jr.Methods of assessment of injury and recovery of peripheral nerves［J］.Surg Clin North Am，1981，61（2）：303-319

［2］Chaplan SR，Bach FW，Pogrel JW，et al.Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw［J］.J Neurosci Methods，1994，53（1）：55-63.

［3］Ying YL，Wei XH，Xu XB，et al.Over?expression of P2X7 receptors in spinal glial cells contributes to the development of chronic postsurgical pain induced by skin/muscle incision and retraction（SMIR）in rats［J］.Experimental Neurol，2014，261：836-843

［4］呂榮.周圍神經(jīng)損傷修復(fù)及功能恢復(fù)評價［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（8）：1454-1458.

［5］陳銀海，姚紅華，楊忠.強度-時間曲線在周圍神經(jīng)損傷康復(fù)評定中的應(yīng)用價值［J］.中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2007，29（11）：769-771.

［6］Garcia JH，Wagner S，Liu KF，Hu XJ.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral arteryocclusion in rats.Statistical validation［J］.Stroke，1995，26（4）：627-634.

［7］丁斐，沈愛國.神經(jīng)生物學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2012：195-208.

［8］Tsuda M，Shigemoto-Mogami Y，Koizumi S，et al.P2X4 receptors induced in spinalmicroglia gate tactile allodynia after nerve injury［J］.Nature，2003，424（6950）：778-783.

［9］Guan Z，Kuhn JA，Wang X，et al.Injured sensory neuron?derived CSF1 induces microglia proliferation and DAP12?dependent pain［J］.Nat Neurosci，2016，19（1）：94–101.

Comparison of two sensory function evaluation methods in m ice

CHEN Meiling，LI Li，CHEN Yuying，CHEN Binghao，SONGWeidong，WANG Chuan，YAN Li，YANG Chuan.Department of Endo?crinology，Sun Yat?sen Memorial Hospital，SunYat?sen University，Guangzhou，510120.Corresponding author：WANGChuan，195544590@qq.com

Objective To compare the two sensory function evaluationmethods as the hot plate pain test and up?down mechanical pain test about their stability and accuracy.Methods Ten Male C57BL/6Jmice weighed 20 to 25 g were included，and the thermo?hot plate pain detector was used to measure the response latency in hot pain，the Von Frey Hair Test fiber was used tomeasure the 50% mechanical drop threshold.The stability and accuracy of the two sensory function assessmentmethods were compared.Results The three times of response latency to heat pain were 26.24±7.36 s，22.28± 7.78 s，20.80±6.85 s and there was no significant difference between these three groups（P＞0.05）.The three timesmechanicalwithdrawal thresholds of left footwere：2.69±1.22 g，2.71±1.19 g，2.58±1.15 g and there was no significant difference between these three groups（P＞0.05）.The three timesmechanical withdrawal thresholds of right footwere 2.97±1.07 g，2.99±1.03 g，2.99±1.04 g and therewas no signifi?cant difference between these three groups（P＞0.05）.Conclusion There was no significant difference between the three times hot painsmeasure，and no significant difference in both three times of the left and right footmechanical pain.

sensory function；hotpain；mechanical pain

R-332

A

10.3969/j.issn.1009?976X.2017.03.018

2017-04-25）

廣東省科技計劃項目（2016B020238001）

510120廣州中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院內(nèi)分泌科

*通訊作者：王川，E?mail：195544590@qq.com