肝再生磷酸酶-3上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta促進(jìn)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞侵襲的機(jī)制研究

施景龍 羅興喜 許鶴洋 藍(lán)球生 黃永亮 褚忠華*

肝再生磷酸酶-3上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta促進(jìn)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞侵襲的機(jī)制研究

施景龍1羅興喜2許鶴洋2藍(lán)球生2黃永亮2褚忠華2*

目的探討轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta（TGF?beta）通路在肝再生磷酸酶?3（PRL?3）促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組結(jié)腸癌細(xì)胞TGF?beta水平表達(dá)差異，Transwell侵襲小室法檢測(cè)LoVo細(xì)胞侵襲能力變化，Western blot檢測(cè)相關(guān)通路蛋白水平變化。結(jié)果ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染PRL?3后，穩(wěn)定表達(dá)PRL?3的LoVo細(xì)胞（LoVo?P）與對(duì)照組（LoVo?C）相比，TGF?beta表達(dá)明顯升高（114±11 pg/mL比56±8 pg/ mL，P＜0.01）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)提示不同濃度的TGF?beta中和抗體（1、10、100 ng/mL）作用LoVo?P后其侵襲能力逐漸降低，對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為142.7±11.3個(gè)，實(shí)驗(yàn)組分別為96.1±8.2、67.3±9.4、48.6±6.4個(gè)（P＜0.05）。蛋白印記實(shí)驗(yàn)提示PI3K/AKT信號(hào)通路參與了其誘導(dǎo)侵襲的過(guò)程，使用PI3K抑制劑LY294002（10 mg/mL）后，LoVo?P的AKT磷酸化蛋白的表達(dá)水平降低2.5倍（P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)RL?3能誘導(dǎo)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞分泌TGF?beta，激活PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞侵襲。

肝再生磷酸酶-3；結(jié)腸癌；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta；侵襲

結(jié)直腸癌是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，多數(shù)病人常常由于肝轉(zhuǎn)移而死亡。前期研究表明肝再生磷酸酶-3（phosphatase of regenerating liver?3，PRL?3）的表達(dá)與結(jié)腸癌的TNM分期呈正相關(guān)，提示其參與了結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的過(guò)程［1］，然而其具體機(jī)制尚不清楚，我們前期細(xì)胞因子芯片結(jié)果初步提示PRL?3能夠上調(diào)TGF?beta表達(dá)。本研究擬通過(guò)已構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PRL?3結(jié)腸癌細(xì)胞株，檢測(cè)TGF?beta細(xì)胞因子在PRL?3誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAcGFP?PRL?3的人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)研中心保種；細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640，胰蛋白酶和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、篩選抗生素G418、PI3K抑制劑（LY294002）購(gòu)自Sigma公司；人TGF?beta中和抗體購(gòu)自R&D Systems公司；TGF?beta抗體、兔抗人總AKT（T?AKT）和p?AKT抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；蛋白裂解液，蛋白酶抑制劑（PMSF）及凝膠配制試劑盒均購(gòu)自碧云天生物公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及相關(guān)培養(yǎng)耗材購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇的結(jié)腸癌LoVo?P、LoVo?C細(xì)胞用含10%胎牛血清及100mg/mLG418的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞長(zhǎng)達(dá)80%，用胰酶消化傳代。

1.3 ELISA檢測(cè)

嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，采用雙抗體夾心法，1×106LoVo?P、LoVo?C/孔種于六孔板，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞上清：2～8℃1000×g離心15min取上清，上清立即用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 Western blot法

將培養(yǎng)后的LoVo細(xì)胞加入1%PMSF的蛋白裂解液處理，提取細(xì)胞中的總蛋白并定量，取蛋白樣品40μg，加入5×上樣緩沖液，98℃沸水煮5min后上樣。經(jīng)過(guò)十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳膠（PAGE）電泳后，將蛋白恒流200mA 2 h轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF膜置于5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h后與特異性一抗，GAPDH，4℃孵育過(guò)夜。次日用TBST液每次10 min洗膜3次，加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，用增強(qiáng)ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度。

1.5 侵襲實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)室用24孔Transwell小室（8.0-μm）。用無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶5稀釋基質(zhì)膠Matrigel，以40μL/孔均勻涂至Transwell小室上表面。將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基出處理24 h后，用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，將200μL的各組細(xì)胞懸液加入到上室中，同時(shí)下室加入500μL的含有10%FBS的RPMI?1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，甲醛固定，結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野記數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)目。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRL?3能誘導(dǎo)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞分泌TGF?beta

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PRL?3后，分別收集LoVo?P細(xì)胞和LoVo?C細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過(guò)ELISA檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，LoVo?P細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF?beta的蛋白水平明顯較LoVo?C上清高114±11 pg/mL比56±8 pg/mL（P＜0.01）（圖1）。

圖1 PRL?3對(duì)LoVo細(xì)胞TGF?beta蛋白分泌的影響

2.2 中和TGF?beta對(duì)LoVo?P細(xì)胞侵襲性的影響

在LoVo?P細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的TGF?beta細(xì)胞因子中和抗體（1、10、100 ng/mL）后培養(yǎng)24 h后，IgG為對(duì)照組，Lovo?P的侵襲能力移得到抑制，對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為（142.7±11.3）個(gè)，實(shí)驗(yàn)組（1、10、100 ng/mL）穿膜細(xì)胞數(shù)分別為96.1±8.2、67.3±9.4、48.6±6.4個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。結(jié)果提示，中和TGF?beta可以顯著抑制PRL?3誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞的侵襲能力。

圖2 中和TGF?beta對(duì)LoVo?P細(xì)胞侵襲性的影響

2.3 TGF?beta上調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞侵襲

轉(zhuǎn)染后通過(guò)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)提示PRL?3能夠激活PI3K/AKT信號(hào)通路。TGF?beta細(xì)胞因子（10 ng/ mL）刺激LoVo?C后，LoVo?C的AKT磷酸化蛋白的表達(dá)水平升高3.2倍；使用PI3K抑制劑（LY294002）（10mg/mL）后，LoVo?P的AKT磷酸化蛋白的表達(dá)水平降低2.5倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖3）

圖3 TGF?beta/PI3K/AKT通路對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞侵襲的調(diào)控

3 討論

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是我國(guó)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，肝轉(zhuǎn)移是其導(dǎo)致病人死亡的主要原因。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PRL?3的表達(dá)和結(jié)直腸癌的TNM分期呈正相關(guān)，提示其參與了結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的過(guò)程［2］。文獻(xiàn)復(fù)習(xí)表明腫瘤炎癥微環(huán)境能夠促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［3，4］。我們后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，PRL?3蛋白能夠誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞TAM的浸潤(rùn)，從而促進(jìn)結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，提示PRL?3能夠調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞炎癥微環(huán)境導(dǎo)致結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生［5］。本研究通過(guò)ELISA結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PLR?3的LoVo細(xì)胞能夠上調(diào)細(xì)胞因子TGF?beta的表達(dá)，通過(guò)使用TGF?beta中和抗體，可以顯著抑制PRL?3蛋白誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，提示TGF?beta可能是PRL?3的下游信號(hào)分子發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。

研究表明TGF?beta主要通過(guò)Smads信號(hào)通路和非Smads信號(hào)通路廣泛參與細(xì)胞免疫、增殖、生長(zhǎng)和分化的過(guò)程［6］。研究進(jìn)一步證實(shí)TGF?beta能夠通過(guò)Smad3誘導(dǎo)Snail表達(dá)抑制E?cadherin表達(dá)以及Wnt信號(hào)通路參與了腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)化的過(guò)程［7，8］。我們后續(xù)研究證實(shí)TGF?beta所介導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路參與了PRL?3誘導(dǎo)結(jié)腸癌侵襲的過(guò)程，為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

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Phosphatase of regenerating liver?3 prom oted the invasion of LoVo cells through TGF?beta

SHIJinglong1，LUO Xingxi2，XU Heyang2，LAN Qiusheng2，HUANG Yongliang2，CHU Zhonghua2.1Depart?ment of General Surgery，the First People′s Hospital of Nansha District，Guangzhou，511440，Chi?na；2Department ofGastroenteropancreatic Surgery，Sun Yat?sen Memorial Hospital，Sun Yat?sen Universi?ty，Guangzhou510120，China.Corresponding author：CHU Zhonghua，chu9009@163.com

Objective To investigate role of TGF?beta in promoting the colorectal cancer LoVo cells invasion induced by phosphatase of regenerating liver?3（PRL?3）.M ethods ELISA assay was to used to detect the level of TGF?beta in LoVo?P and LoVo?C.Invasion assayswere applied to determine the effect of TGF?beta on the ability of PRL?3.Western blotwas used to detect the proteins of p?AKT and AKT.Results Elisa assay displayed that the protein level of TGF?beta of LoVo?Pwas higher than LoVo?C（114±11 pg/ml vs.56±8 pg/ml，P＜0.01）.When added different dosages of neutralizing antibody of TGF?beta（1，10，00 ng/m l）in culture medium of LoVo?P，the invasion were decreased significantly（96.1±8.2，67.3±9.4 and 48.6±6.4，respectively）and all Pvaluesless than 0.05）.Western blot reminded the proteins of p?AKT in LoVo?Pwere higher than LoVo?C，and the expression of p?AKT in LoVo?Pwas decreased by 2.5?fold after treating LoVo?Pwith the PI3K inhibitor LY294002（10mg/mL）（P＜0.05）.Conclusion PRL?3 could up?regulate the expression of TGF?beta in colorectal cancer LoVo cells and promote the invasion of LoVo cells，in which PI3K/AKT signaling pathwaymay be involved.

PRL?3；colon cancer；TGF?beta；invasion

R735.3+5

A

10.3969/j.issn.1009?976X.2017.03.008

2017-02-19）

廣東省科技計(jì)對(duì)外科技合作項(xiàng)目（2013B051000025，2015A050502021）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（B2014133）；廣東省自然科學(xué)基金（2014A030313054）

1511440廣州廣州市南沙區(qū)第一人民醫(yī)院普外科；2510120廣州中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院胃腸外科

*通訊作者：褚忠華，Email：chu9009@163.com