非諾貝特緩解非酒精性脂肪性肝病的體外機(jī)制研究

郭駿，陳玉媛，葉楓，李斌，徐傳瑞，

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢 4300302華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科，武漢 430030

非諾貝特緩解非酒精性脂肪性肝病的體外機(jī)制研究

郭 駿1， 陳玉媛1， 葉 楓2△， 李 斌1， 徐傳瑞1，

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢 4300302華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科，武漢 430030

目的 利用細(xì)胞模型研究非諾貝特在緩解非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中的作用及其分子機(jī)制。方法 首先以0～0.9 mmol/L梯度濃度的油酸處理正常肝細(xì)胞LO2 48 h建立脂肪肝細(xì)胞模型；同時(shí)，以非諾貝特處理正常細(xì)胞或模型組細(xì)胞48 h，然后用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力，用油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成或抑制情況，利用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中的三酰甘油(TG)以及上清液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平，蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中蛋白激酶B(AKT)、p-AKT、FSAN及Nrf2蛋白水平，并使用2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基(ROS)含量。結(jié)果 油酸濃度超過(guò)0.5 mmol/L后細(xì)胞活力顯著降低，非諾貝特可抑制高濃度油酸對(duì)細(xì)胞的損傷。油酸處理后細(xì)胞中出現(xiàn)大量脂滴，細(xì)胞內(nèi)TG含量以及上清液中的ALT、AST水平顯著升高，給予非諾貝特處理后細(xì)胞中脂滴減少，TG、ALT和AST含量均顯著降低。油酸處理后細(xì)胞中AKT、p-AKT、FSAN和Nrf2蛋白水平升高，給予非諾貝特可抑制上述蛋白水平的升高。同時(shí)，非諾貝特逆轉(zhuǎn)了由油酸導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS累積。結(jié)論 非諾貝特可以抑制油酸引起的脂肪積累，并緩解脂肪累積導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，其機(jī)制是通過(guò)下調(diào)AKT/FSAN信號(hào)通路，從而降低ROS水平，進(jìn)而減少ROS導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。

非酒精性脂肪性肝??； 非諾貝特； 蛋白激酶B(AKT)； 活性氧自由基

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一類與乙醇攝入以及丙型肝炎病毒等其它明確肝損傷因素?zé)o關(guān)的、以肝細(xì)胞脂肪變性及脂質(zhì)蓄積為特點(diǎn)的肝臟疾病[1]。隨著生活水平提高，世界范圍內(nèi)的肥胖人群越來(lái)越多[2]，歐洲地區(qū)有超過(guò)50%人群超重，23%的女性以及20%的男性為肥胖人群[3]。成年肥胖人群中NAFLD的發(fā)病率高達(dá)80%～90%[4]，其中40%～50%發(fā)展為肝纖維化[5]，NAFLD正嚴(yán)重威脅人類健康。雖然有大量研究聚焦于此，但是對(duì)于其發(fā)病機(jī)制以及過(guò)程所知有限[6]。非諾貝特已應(yīng)用于臨床多年，具有良好的降低血脂功能。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)非諾貝特可以抑制非酒精性脂肪肝發(fā)展并緩解非酒精性脂肪肝肝炎，但其作用機(jī)制還不清楚[7]。本研究中，我們建立了NAFLD的體外模型，并利用該模型研究了非諾貝特對(duì)NAFLD的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。我們的結(jié)果顯示非諾貝特的降脂作用抑制了蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路，并降低了活性氧自由基(ROS)水平，進(jìn)而減少了ROS導(dǎo)致的肝損傷。因此我們的研究在細(xì)胞水平上揭示了非諾貝特治療NAFLD的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人正常肝細(xì)胞LO2購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心；DMEM培養(yǎng)液以及胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；三酰甘油(TG)測(cè)定試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒以及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；細(xì)胞活力測(cè)定試劑盒CCK-8、油紅O、油酸、DCFH-DA均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；非諾貝特購(gòu)自百靈威科技有限公司；AKT、p-AKT、FSAN、Nrf2以及β-actin蛋白抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及NAFLD模型的建立 LO2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清(FBS)以及100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2及飽和濕度環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合達(dá)75%后用含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)濃度為0.25%的胰酶進(jìn)行消化后傳代培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LO2細(xì)胞進(jìn)行鋪板，12孔板按5×104/孔接種細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)24 h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，同時(shí)按照油酸濃度為0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9 mmol/L的梯度進(jìn)行給藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行油紅O染色，觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的分布情況，當(dāng)油酸濃度到達(dá)0.5 mmol/L時(shí)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多，差異顯著，由此確定LO2細(xì)胞NAFLD模型造模成功。

1.2.2 CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力 取匯合達(dá)75%生長(zhǎng)良好的LO2細(xì)胞，利用胰酶消化后加入適量培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104/mL，之后以100 mL/孔的量接種于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)24 h待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)后加入不同濃度的油酸或非諾貝特繼續(xù)培養(yǎng)48 h，之后加入CCK-8溶液使其終濃度為10 μg/mL，37℃孵育1.5 h，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)值計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=(A給藥-A空白)/(A0給藥-A空白)×100%。其中，A給藥：具有細(xì)胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A空白：具有培養(yǎng)液和CCK溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度；A0給藥：具有細(xì)胞、CCK溶液而沒(méi)有藥物溶液的孔的吸光度。

1.2.3 油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴 取匯合達(dá)75%生長(zhǎng)良好的LO2細(xì)胞，利用胰酶消化后加入適量培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，按5×104/孔接種于12孔板中，預(yù)培養(yǎng)24 h待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)后加入不同濃度的油酸或非諾貝特繼續(xù)培養(yǎng)48 h，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細(xì)胞2次后加入10%中性甲醛固定10 min，加入油紅O溶液避光孵育15 min，去除染液加入75%乙醇浸沒(méi)5 min，PBS沖洗2次后加入蘇木精染液復(fù)染1 min，雙蒸水漂洗2次后顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 TG、ALT、AST試劑盒檢測(cè)TG及培養(yǎng)上清ALT及AST水平 取匯合達(dá)75%生長(zhǎng)良好的LO2細(xì)胞，利用胰酶消化后加入適量培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，按105/孔接種于6孔板中，預(yù)培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的油酸或非諾貝特繼續(xù)培養(yǎng)48 h，之后收集上清液利用試劑盒測(cè)定ALT及AST。PBS浸潤(rùn)下將細(xì)胞刮下再利用超聲破碎細(xì)胞，利用試劑盒測(cè)定細(xì)胞中TG水平。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞AKT、p-AKT、FSAN、Nrf2蛋白含量 如1.2.4項(xiàng)所述用油酸或非諾貝特處理細(xì)胞，之后加入含蛋白酶抑制劑(cocktail)的裂解液冰上裂解細(xì)胞，離心收取上清液后利用BCA試劑盒測(cè)定相應(yīng)蛋白濃度，所有樣品根據(jù)蛋白定量結(jié)果上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上后，低脂牛奶孵育后分別進(jìn)行一抗和二抗雜交。然后膠片曝光分析各個(gè)樣品中蛋白的相對(duì)含量并以蛋白β-actin作為內(nèi)參。即測(cè)量各條帶的吸光度，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin吸光度的比值來(lái)反映目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 ROS試劑盒檢測(cè)細(xì)胞ROS含量 如1.2.4項(xiàng)所述用油酸或非諾貝特處理細(xì)胞，之后去除培養(yǎng)液，加入無(wú)血清培養(yǎng)液配制的終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA溶液，于37℃孵育20 min后，以無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌3次，于熒光顯微鏡下觀察熒光的強(qiáng)弱并使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 非諾貝特抑制油酸導(dǎo)致的細(xì)胞損傷

首先建立了NAFLD細(xì)胞模型并檢測(cè)了高脂培養(yǎng)下的細(xì)胞活力。如圖1所示，當(dāng)油酸濃度超過(guò)0.4 mmol/L后隨著油酸濃度升高LO2細(xì)胞活力迅速降低，當(dāng)濃度達(dá)到0.9 mmol/L時(shí)LO2的細(xì)胞活力小于對(duì)照組的10%。結(jié)果表明，高濃度的油酸具有細(xì)胞毒性。油酸濃度為0.9 mmol/L時(shí)細(xì)胞活力值低于對(duì)照組的10%，不利于觀察非諾貝特的逆轉(zhuǎn)作用，0.6 mmol/L時(shí)細(xì)胞活力為對(duì)照組的40%，細(xì)胞本身就可恢復(fù)活力，不利于觀察非諾貝特的保護(hù)作用，而0.8 mmol/L時(shí)細(xì)胞活力約為對(duì)照組的25%，故選擇0.8 mmol/L的油酸濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

非諾貝特處理對(duì)細(xì)胞活力的影響如圖1所示，0.8 mmol/L油酸可顯著抑制LO2的細(xì)胞活力，而給予非諾貝特進(jìn)行干預(yù)可部分恢復(fù)LO2的細(xì)胞活力且呈現(xiàn)濃度依賴性，當(dāng)非諾貝特濃度達(dá)到20 mmol/L時(shí)細(xì)胞活力可恢復(fù)至80%以上。該結(jié)果說(shuō)明，在利用油酸制備的NAFLD細(xì)胞模型中，非諾貝特可以有效抑制細(xì)胞損傷。

與正常組比較，**P<0.01；n=3圖1 油酸及非諾貝特對(duì)LO2細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of oleic acid and fenofibrate on cell viability of LO2

2.2 非諾貝特抑制胞內(nèi)脂滴累積

在給予油酸處理LO2細(xì)胞48 h后進(jìn)行油紅O染色以觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的累積情況。如圖2所示，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)無(wú)明顯紅色或僅為淡紅色；而油酸處理后的細(xì)胞可觀察到隨油酸濃度的升高細(xì)胞內(nèi)紅色加深，范圍擴(kuò)大。0.8 mmol/L油酸誘導(dǎo)的同時(shí)給予非諾貝特進(jìn)行干預(yù)，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)的紅色變淡，范圍變小。這些結(jié)果表明高濃度油酸可以導(dǎo)致脂肪在細(xì)胞內(nèi)大量累積，而非諾貝特可以抑制脂肪在細(xì)胞內(nèi)的累積。

A：0 mmol/L油酸；B：0.2 mmol/L油酸；C：0.4 mmol/L油酸；D：0.8 mmol/L油酸；E：0.8 mmol/L油酸+20 mmol/L非諾貝特圖2 油紅O染色觀察LO2細(xì)胞內(nèi)脂滴(×200)Fig.2 LO2 cells are stained with oil red O and observed by microscope(×200)

2.3 非諾貝特顯著降低細(xì)胞中TG含量

如圖3所示，油酸可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)TG的大量積累，且細(xì)胞內(nèi)TG含量隨油酸濃度升高而升高，呈現(xiàn)濃度依賴性。在給予非諾貝特干預(yù)后細(xì)胞中的TG含量有一定的下降，且非諾貝特濃度為20 mmol/L時(shí)，TG含量下降最明顯。該結(jié)果說(shuō)明非諾貝特抑制了細(xì)胞內(nèi)TG的合成。

與正常組比較，*P<0.05 **P<0.01，與0.8 mmol/L油酸組比較，##P<0.01；n=3圖3 油酸及非諾貝特對(duì)LO2細(xì)胞中TG含量影響Fig.3 Effects of oleic acid and fenofibrate on TG level in LO2 cells

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT及AST含量變化

如圖4所示，給予油酸處理48 h后，上清液中ALT及AST變化趨勢(shì)一致，隨油酸濃度的升高而升高。在給予非諾貝特干預(yù)后，ALT及AST變化趨勢(shì)依然保持一致，與0.8 mmol/L油酸組相比，加入非諾貝特干預(yù)后上清液中的ALT及AST含量顯著降低，接近正常組含量。這說(shuō)明非諾貝特確實(shí)抑制了高脂導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。

2.5 非諾貝特降低細(xì)胞AKT、p-AKT、FASN及Nrf2含量

在油酸處理以及非諾貝特干預(yù)后利用Western blot檢測(cè)了細(xì)胞中AKT、p-AKT、FASN及Nrf2蛋白含量變化。結(jié)果如圖5所示，油酸處理后細(xì)胞中與脂質(zhì)合成和代謝相關(guān)的信號(hào)通路蛋白AKT、p-AKT以及FASN酶均顯著升高，而在給予非諾貝特干預(yù)后與單獨(dú)油酸處理組相比，細(xì)胞中的AKT、p-AKT及FASN的蛋白含量均明顯下降。油酸處理后細(xì)胞中促進(jìn)氧化應(yīng)激的蛋白Nrf2上調(diào)，而加入非諾貝特后Nrf2顯著降低。這些結(jié)果說(shuō)明非諾貝特抑制了脂肪合成后，下調(diào)了AKT相關(guān)通路以及與氧化應(yīng)激相關(guān)的Nrf2因子水平。

2.6 非諾貝特降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量

給予油酸及非諾貝特處理48 h后通過(guò)DCFH-DA染色后在熒光顯微鏡下觀察，同時(shí)使用酶標(biāo)儀定量分析比較油酸以及非諾貝特對(duì)LO2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響。結(jié)果如圖6所示，給予0.8 mmol/L油酸處理后細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著上升，而在非諾貝特的干預(yù)后ROS降低至接近正常細(xì)胞水平。

與正常組比較，*P<0.05 **P<0.01；與0.8 mmol/L油酸組比較，#P<0.05 ##P<0.01；n=3圖4 油酸及非諾貝特作用下上清液中ALT、AST含量變化Fig.4 Effect of oleic acid and fenofibrate on ALT and AST levels in supernatant

圖5 LO2細(xì)胞中AKT、p-AKT、FASN、Nrf2蛋白含量Fig.5 Protein expression levels of AKT，p-AKT，F(xiàn)ASN and Nrf2 in LO2 cells

3 討論

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是目前研究最熱門的疾病之一，也是我國(guó)愈來(lái)愈常見(jiàn)的慢性肝病，發(fā)病率高達(dá)20%～27%[8]。NAFLD是一種以TG為主的脂類物質(zhì)在肝臟中蓄積導(dǎo)致病理改變的肝臟疾病[9]，臨床上還伴有血清中ALT及AST升高，并將此作為診療依據(jù)之一[10-12]。

A：顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光(×200)；B：酶標(biāo)儀定量檢測(cè)熒光強(qiáng)度；與正常組比較，**P<0.01；與0.8 mmol/L油酸組比較，##P<0.01；n=6圖6 DCFH-DA染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平Fig.6 ROS level in LO2 cells detected by DCFH-DA staining

非諾貝特是一種氯貝丁酸衍生物類血脂調(diào)節(jié)藥，通過(guò)抑制極低密度脂蛋白和TG的生成并同時(shí)促進(jìn)其分解代謝，進(jìn)而降低血低密度脂蛋白、膽固醇和TG水平。在近些年的一些研究中，逐漸發(fā)現(xiàn)非諾貝特對(duì)NAFLD有一定的治療作用[7，13]。這說(shuō)明非諾貝特可以抑制脂肪在肝臟中的積累，并抑制脂肪肝導(dǎo)致的損傷，但其作用機(jī)制還不甚清楚。

本研究中，我們利用NAFLD細(xì)胞模型，首先觀察了非諾貝特對(duì)高脂LO2細(xì)胞活力的影響。我們發(fā)現(xiàn)油酸對(duì)LO2具有顯著的細(xì)胞毒性，而非諾貝特處理后細(xì)胞活力得到恢復(fù)，這與其對(duì)NAFLD的治療特性一致[14-15]。這個(gè)結(jié)果也說(shuō)明利用細(xì)胞模型研究非諾貝特對(duì)NAFLD的保護(hù)機(jī)制是可行的。

我們進(jìn)一步研究了非諾貝特對(duì)脂肪肝脂肪積累的影響以及抑制肝損傷的作用。通過(guò)油紅O染色觀察到油酸誘導(dǎo)LO2細(xì)胞中的脂滴大量累積，同時(shí)測(cè)得TG、ALT、AST含量升高，所有結(jié)果均表明本研究中建立的體外模型與臨床實(shí)際表現(xiàn)一致。在給予非諾貝特干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)脂滴減少、TG、ALT、AST含量降低，這些結(jié)果表明非諾貝特抑制脂肪積累后降低了脂肪積累導(dǎo)致的肝臟損傷。

大量研究表明NAFLD的發(fā)生發(fā)展與PI3K/AKT信號(hào)通路激活[16-17]以及氧化應(yīng)激[18-19]密切相關(guān)，且脂肪酸合成酶作為脂肪酸合成代謝的限速酶在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要角色[20-21]，通過(guò)檢測(cè)油酸以及非諾貝特處理后細(xì)胞中的AKT、p-AKT、FASN等脂肪合成相關(guān)蛋白，證實(shí)了非諾貝特可以逆轉(zhuǎn)由油酸誘導(dǎo)的AKT信號(hào)通路的活化。

另外，大量文獻(xiàn)報(bào)道脂肪合成過(guò)多會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)ROS水平上升，從而導(dǎo)致肝臟損傷[18-19]。我們的研究也顯示非諾貝特處理后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著下降，同時(shí)ROS相關(guān)細(xì)胞因子Nrf2水平也顯著降低，這些結(jié)果表明非諾貝特對(duì)脂肪性肝炎的保護(hù)作用與下調(diào)ROS水平、抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷有關(guān)。

綜上所述，本研究通過(guò)油酸誘導(dǎo)LO2細(xì)胞建立了NAFLD的體外模型，并利用該模型研究非諾貝特對(duì)脂肪性肝炎的保護(hù)作用機(jī)制。我們的結(jié)果在細(xì)胞水平證實(shí)了非諾貝特通過(guò)下調(diào)AKT/FSAN信號(hào)通路和降低ROS積累，達(dá)到降低脂肪積累和減輕細(xì)胞損傷的作用。

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(2017-02-20 收稿)

Therapeutic Effects of Fenofibrate on Nonalcoholic Fatty Liver Diseaseinvitroand Related Mechanism

Guo Jun1，Chen Yuyuan1，Ye Feng2△etal

1DepartmentofPharmacyTongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China2DepartmentofPediatrics，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

Objective To investigate the role of fenofibrate in treating non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)in cellular model and the related mechanism.Methods NAFLD cell model was established by treating LO2 cells with oleic acid (from 0 to 0.9 mmol/L).The cells were treated with fenofibrate (from 0 to 20 mmol/L)for 48 h.CCK-8 kit was used to determine the LO2 cell viability with or without treatment.Oil Red O staining was used to observe lipid droplets in LO2 cells microscopically.Lab-used experiment kits were used to assess TG level in cells and ALT，AST levels in cell supernatants.Protein levels of AKT，p-AKT，F(xiàn)SAN and Nrf2 were detected using Western blotting.DCFH-DA was used to detect reactive oxygen species(ROS)in cells.Results Oleic acid with concentration over 0.5 mmol/L significantly inhibited cell viability.Fenofibrate significantly reversed cytotoxicity induced by high concentration of oleic acid.Lipid droplets and TG within LO2 cells，and ALT/AST in cell supernatant were increased by treatment with oleic acid.Fenofibrate reversed the increase of lipid drops，TG，ALT and AST induced by oleic acid.Oleic acid up-regulated the levels of AKT，p-AKT，F(xiàn)SAN and Nrf2，while fenofibrate reversed the up-regulation of those proteins.Fenofibrate reduced the oleic acid-induced accumlation of ROS in cells.Conclusion Fenofibrate can inhibit lipid accumulation and alleviate cell damage induced by oleic acid through inhibiting AKT/FSAN pathways and reducing ROS levels.

non-alcoholic fatty liver disease； fenofibrate； AKT； reactive oxygen species

R575.5

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.005

郭 駿，男，1993年生，碩士研究生，E-mail：1270079810@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：doctoryf@126.com