Wnt/β-catenin信號通路在鼻咽癌組織的異常激活

黃孝文， 崔偉偉， 王寶鳳， 崔永華

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，武漢 430030

實驗研究

Wnt/β-catenin信號通路在鼻咽癌組織的異常激活

黃孝文， 崔偉偉， 王寶鳳， 崔永華

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，武漢 430030

目的 探討Wnt/β-catenin信號通路的異常激活在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展機制中可能的作用。方法 以10例正常鼻咽組織為對照，運用免疫組織化學技術(shù)檢測24例鼻咽癌組織中Wnt2和β-catenin的表達水平及其在癌細胞中的定位情況；運用實時定量PCR技術(shù)和蛋白免疫印跡技術(shù)分別檢測鼻咽癌組織中Wnt2和β-catenin基因和蛋白的表達水平。結(jié)果 免疫組化檢測結(jié)果顯示，在鼻咽癌標本中，Wnt2的表達明顯高于對照組織，且陽性染色主要位于細胞質(zhì)內(nèi)；β-catenin在細胞膜上的表達量顯著低于對照組織，而在細胞質(zhì)和細胞核中的表達呈明顯上調(diào)。實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，Wnt-2 mRNA在鼻咽癌組織中的表達量明顯高于對照組織(P<0.01)；β-catenin mRNA表達量則低于對照組織(P=0.016)。蛋白免疫印跡技術(shù)檢測結(jié)果表明，Wnt2蛋白在鼻咽癌組織中的表達高于對照組織，而β-catenin蛋白在受檢腫瘤標本中的含量亦呈明顯上調(diào)。結(jié)論 Wnt2、β-catenin在鼻咽癌組織中存在明顯的異常表達，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路的異常激活可能是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的重要分子機制之一。

鼻咽癌； Wnt/β-catenin信號通路； 異常激活

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國南部地區(qū)常見的頭頸部惡性腫瘤。目前，鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機制尚未完全闡明。有研究發(fā)現(xiàn)β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在鼻咽癌組織存在異常表達，但Wnt(wingless-type MMTV integration site family member)/β-catenin信號通路的激活在其病理機制中的作用尚未見報道。本研究應用免疫組織化學技術(shù)、實時定量PCR技術(shù)和蛋白免疫印跡技術(shù)分別檢測鼻咽癌組織中Wnt2和β-catenin的表達情況，探討Wnt/β-catenin信號通路的異常激活在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用，進而為其分子靶向治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

①免疫組織化學實驗：羊抗兔單克隆抗體Wnt-2(Abcam，美國)，羊抗兔多克隆抗體β-catenin(三鷹公司，武漢)，過氧化物酶標記的親和素-生物素-酶復合體二抗試劑盒(博士德公司，武漢)等。②實時定量PCR實驗：RNA提取液Trizol(Fermentas公司，加拿大)，RT-PCR mix(TaKaRa公司，大連)，RT-PCR引物(生物工程技術(shù)服務有限公司，上海)，RT-PCR SYBR green(Fermentas公司，加拿大)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，大連)，RT-PCR儀(羅氏診斷應用科學公司，德國)，PCR擴增儀(Roche公司，瑞士)，熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)等。③Western blot實驗：RIPA裂解液(碧云天公司，濟南)，Cooktail(Roche公司，瑞士)，SDS-PAGE凝膠試劑盒(博士德公司，武漢)，蛋白上樣緩沖液(博士德公司，武漢)，SDS(Sigma公司，美國)，Tris-base(Sigma公司，美國)，PVDF膜(博士德公司，武漢)等。

1.2 研究對象

1.2.1 病例資料 從2012年11月到2014年12月在武漢同濟醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科門診就診的病例中，隨機選取疑診鼻咽腫瘤的患者30例?；颊咧髟V包括頸部包塊10例(33.3%)，頭痛6例(20.0%)，耳鳴耳閉5例(16.7%)，涕中帶血5例(16.7%)，鼻塞4例(13.3%)；所有病例的電子鼻咽鏡檢查結(jié)果均提示鼻咽新生物可能。另隨機選取非咽喉病患者10例作為正常對照組。

1.2.2 標本采集與處理 在患者知情并同意的情況下，對每一病例分別于表面麻醉下行內(nèi)鏡輔助鼻咽組織活檢術(shù)。對所獲取的病理標本，取部分組織以多聚甲醛固定后送臨床病理學檢查，剩余組織立即放入消毒的離心管，并迅速放入液氮中，隨之保存于-80℃冰箱備用。

1.2.3 病理學檢查結(jié)果及研究分組 對所有研究對象的鼻咽活檢組織進行臨床病理學檢測，根據(jù)最終病理結(jié)果分組：30例疑癌患者中6例確診為鼻咽慢性炎癥，予以剔除；余24例確診為不同分化程度和角化類型的鼻咽鱗狀細胞癌，為實驗組。非咽喉病患者10例，病理檢查均排除鼻咽腫瘤和炎癥，為對照組。實驗組24例中男18例，女6例，平均年齡50.1歲；對照組10例中男6例，女4例，平均年齡44.8歲。

1.3 Wnt2、β-catenin的免疫組織化學染色

對全部標本行常規(guī)石蠟包埋切片。以0.01 mmol/L PBS緩沖液來代替一抗作為陰性對照，以Wnt2、β-catenin蛋白表達陽性的乳腺癌組織作為陽性對照，對全部鼻咽組織標本進行免疫組織化學檢測。顯微鏡下觀察并采圖，記錄染色部位和染色程度。

1.4 Wnt2、β-catenin mRNA的實時定量PCR檢測

Trizol法提取鼻咽組織標本的總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，反應結(jié)束后，將產(chǎn)物cDNA放入-20℃冰箱保存。按試劑盒說明進行Wnt2、β-catenin的實時定量PCR反應。Wnt2、β-catenin及GAPDH基因片段的引物序列分別為：Wnt2上游引物5′-GCTCCCTCTGCTCTTGACCT-3′，下游引物5′-GCACATTATCGCACATCACC-3′；β-catenin上游引物5′-GGGTCCTCTGTGAACTTGCT-3′，下游引物5′-AATCTTGTGGCTTGTCCTCA-3′；GAPDH上游引物5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，下游引物5′-TTCTAGACGGCAGGTCAGGT-3′。采集RT-PCR數(shù)據(jù)，用2-ΔΔCt方法求得目的基因相對于內(nèi)參基因的相對表達量。

1.5 Wnt2、β-catenin蛋白的Western blot檢測

參照試劑盒說明書提取Wnt2和β-catenin的總蛋白，進行免疫印跡檢測，將所得印跡放于曝光儀內(nèi)曝光，并進行圖像分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，采用Mann-Whitney U檢驗對實驗組和對照組兩獨立樣本的實驗數(shù)據(jù)行非參數(shù)檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Wnt2、β-catenin的免疫組織化學染色及定位

由圖1可見，Wnt2在鼻咽癌組織中呈陽性表達，其染色定位于細胞質(zhì)內(nèi)，即胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)均勻一致的棕黃色顆粒，其中強陽性62.5%(15/24)，中等陽性37.5%(9/24)。Wnt2在正常鼻咽組織細胞質(zhì)內(nèi)基本無表達。

由圖2可見，β-catenin在鼻咽癌組織中胞膜陽性表達減弱或消失，胞質(zhì)或胞核呈陽性表達，其中強陽性54.2%(13/24)，中等陽性33.3%(8/24)。在正常鼻咽組織中呈胞膜陽性表達，即細胞膜出現(xiàn)均勻的著色，胞質(zhì)和胞核無染色(7/10)。

圖1 鼻咽癌組織(A)及正常鼻咽組織(B)Wnt2免疫組織化學染色(×400)Fig.1 Immunohistochemical staining of Wnt2 in NPC(A)and control nasopharyngeal tissues(B)(×400)

圖2 鼻咽癌組織(A)及正常鼻咽組織(B)β-catenin免疫組織化學染色(×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of β-catenin in NPC(A)and control nasopharyngeal tissues(B)(×400)

2.2 Wnt2、β-catenin mRNA表達

采用實時熒光定量PCR檢測鼻咽組織Wnt2、β-catenin mRNA表達，結(jié)果如圖3所示：與正常鼻咽組織比較，鼻咽癌組織中Wnt2 mRNA相對表達量增高(P<0.01)，β-catenin mRNA相對表達量降低(P=0.016)。

圖3 實時熒光定量PCR檢測Wnt2、β-catenin mRNA表達Fig.3 Real time fluorescence-based quantitative PCR detection of Wnt2 and β-catenin mRNA in NPC and control tissues

2.3 Wnt2、β-catenin蛋白表達

采用Western blot技術(shù)檢測Wnt2、β-catenin蛋白表達，結(jié)果如圖4所示：Wnt2、β-catenin蛋白在鼻咽癌組織中的表達量均高于正常鼻咽組織。

1～3：正常鼻咽組織；4～6：鼻咽癌組織圖4 Western blot檢測Wnt2、β-catenin蛋白表達Fig.4 Wnt2 and β-catenin protein expression in NPC and control tissues detected by Western blotting

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細胞內(nèi)某些信號通路的異常激活有著密切關(guān)系，而Wnt/β-catenin信號通路是近年來學者們研究的熱點。Wnt蛋白是一類富含絲氨酸且有19種家族成員的分泌型糖蛋白，以自分泌或旁分泌的方式產(chǎn)生后，Wnt蛋白與細胞膜上的特異性受體結(jié)合，激活經(jīng)典的Wnt信號通路，作用于下游的靶基因，參與細胞生命活動的調(diào)控、細胞極化以及遷移等[1-2]。Wnt信號通路還可能通過抑制細胞凋亡來促進腫瘤細胞的增殖[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，該通路中的Wnt2蛋白參與了多種腫瘤的發(fā)生，如乳腺癌[4]、結(jié)直腸癌和胃癌[5-6]、食管癌[7]、胰腺癌[8]等。而β-catenin是一種多功能細胞骨架蛋白，在正常情況內(nèi)，它與E-鈣黏蛋白及α-catenin等形成復合體，介導細胞粘附，在維持細胞穩(wěn)定、防止細胞遷移等方面發(fā)揮重要作用[9]。此外，作為Wnt通路十分重要的信號分子，β-catenin在基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用。當Wnt信號被異常激活時，原本定位于細胞膜的β-catenin則在細胞質(zhì)內(nèi)大量積聚，同時其降解受到抑制，進而可能易位進入細胞核，激活下游的靶基因，導致后者轉(zhuǎn)錄增加，從而促進腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。已有研究報道β-catenin在多種腫瘤中存在異常表達，而且與部分腫瘤的進展相關(guān)聯(lián)[10-13]。

基于上述研究結(jié)果，我們推測Wnt/β-catenin信號通路在鼻咽癌中也極可能存在異常激活。為了證實這一假設，本研究運用免疫組織化學技術(shù)、實時定量PCR技術(shù)和Western blot法分別檢測了鼻咽癌標本中Wnt2和β-catenin的表達情況。實驗結(jié)果顯示，一方面，在鼻咽癌組織中Wnt2呈高表達，在正常鼻咽組織標本中呈顯著的低表達，而實時定量PCR檢測結(jié)果也證實，Wnt2 mRNA在鼻咽癌標本中表達量明顯高于正常鼻咽組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，這與其他作者對結(jié)腸、直腸癌組織的Wnt2檢測結(jié)果[5]是一致的。Western blot檢測的結(jié)果也進一步證實了Wnt2的表達趨勢，即在鼻咽癌中表達升高。另一方面，與正常鼻咽標本比較，β-catenin在鼻咽癌標本胞膜上的表達顯著降低，而在胞質(zhì)和胞核中表達升高，表明β-catenin在胞質(zhì)出現(xiàn)了異常積聚且易位進入了胞核。實時定量PCR檢測結(jié)果顯示β-catenin mRNA在鼻咽癌組織中的表達量明顯低于正常鼻咽組織(P=0.016)。這個結(jié)果似乎與免疫組化所見不盡一致。如上所述，正常情況下，β-catenin與E-鈣黏蛋白在細胞表面形成復合物共同參與細胞間的粘附，這是β-catenin的主要存在形式。當發(fā)生癌變時，細胞表面的E-鈣黏蛋白受到破壞，與其結(jié)合的β-catenin明顯減少，后者大量進入胞質(zhì)內(nèi)，加之降解受阻，導致β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)大量積聚，并可能易位進入細胞核。因此β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)的積聚和增多是該蛋白從胞膜轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)且降解受阻所導致的結(jié)果，并非由于基因表達量的增高所造成。β-catenin在胞質(zhì)積聚且易位進入胞核是否反饋抑制其基因表達，有待進一步研究。本研究的Western blot檢測發(fā)現(xiàn)β-catenin蛋白在鼻咽癌組織中的表達較正常鼻咽組織明顯上調(diào)，這一現(xiàn)象可能是β-catenin蛋白在胞質(zhì)和胞核異常分布且降解受阻的結(jié)果。這一結(jié)果與其他作者在其他類型腫瘤的研究結(jié)果[10-12]一致。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，在鼻咽癌組織中，Wnt2基因及蛋白的表達均上調(diào)，同時β-catenin蛋白含量升高，并且出現(xiàn)胞質(zhì)和胞核的異常聚集，提示異常激活的Wnt/β-catenin信號通路極可能是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的重要機制之一。隨著相關(guān)研究的不斷深入和突破，Wnt/β-catenin分子通路有望成為鼻咽癌基因靶向治療的新目標。

[1] Miller J R.The wnts[J].Genome Biol，2002，3(1)：1-15.

[2] Cadigan K M，Nusse R.Wnt signaling：a common theme in animal development[J].Genes Dev，1997，11(24)：3286-3305.

[3] Zeng Z Y，Zhou Y H，Zhang W L，et al.Gene expression profiling of NPC reveals the abnormally regulated Wnt signaling pathway[J].Hum Pathol，2007，38(1)：120-133.

[4] 郭變琴，吳立翔,汪先桃，等.Wnt2在乳腺癌組織及患者血清中的表達及意義[J].細胞與分子免疫學雜志，2013，29(6)：633-636.

[5] Katoh M.Frequent up-regulation of WNT2 in primary gastric cancer and colorectal cancer[J].Int J Oncol，2001，19(5)：1003-1007.

[6] 劉龑航，劉映輝，董錫釣.Wnt2，APC及c-myc在胃癌中的表達[J].中國老年學雜志，2013，33(23)：5838-5840.

[7] Fu L，Zhang C，Zhang L Y，et al.Wnt2 secreted by tumour fibroblasts promotes tumour progression in oesophageal cancer by activation of the Wnt/β-catenin signalling pathway[J].Gut，2011，60(12)：1635-1643.

[8] Jiang H，Li Q，He C，et al.Activation of the Wnt pathway through Wnt2 promotes metastasis in pancreatic cancer[J].Am J Cancer Res，2014，4(5)：537-544.

[9] Morin P J.β-catenin signaling and cancer[J].Bioessays，1999，21(12)：1021-1030.

[10] Dong B，Lee J S，Park Y Y，et al.Activating CAR and β-catenin induces uncontrolled liver growth and tumorigenesis[J].Nat Commun，2015，6：5944.

[11] Xu X，Kim J E，Sun P L，et al.Immunohistochemical demonstration of alteration of β-catenin during tumor metastasis by different mechanisms according to histology in lung cancer[J].Exp Ther Med，2015，9(2)：311-318.

[12] Nie E，Zhang X，Xie S，et al.β-catenin is involved in Bex2 down-regulation induced glioma cell invasion/migration inhibition[J].Biochem Biophys Res Commun，2015，456(1)：494-499.

[13] Jamieson C，Sharma M，Henderson B R.Targeting the β-catenin nuclear transport pathway in cancer[J].Semin Cancer Biol，2014，27：20-29.

(2017-02-23 收稿)

Aberrant Activation of Wnt/β-catenin Signaling Pathway in Nasopharyngeal Carcinoma Tissues

Huang Xiaowen，Cui Weiwei，Wang Baofengetal

DepartmentofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

Objective To investigate expression of Wnt2 and β-catenin in nasopharyngeal carcinoma (NPC)，so as to explore the possible role of aberrant activation of Wnt/β-catenin signaling pathway in the mechanism of tumorigenesis and development of NPC.Methods With 10 normal nasopharyngeal tissue samples as control，Wnt2 and β-catenin expression levels and localization in the NPC cells of 24 cases were detected by using immunohistochemistry.The mRNA and protein expression levels of Wnt2 and β-catenin in the NPC tissues were detected respectively by using real-time quantitative PCR and Western blotting.Results Immunohistochemistry illustrated that the expression of Wnt2 was significantly higher in the NPC than in the control nasopharyngeal tissues，and the positive staining was mainly located in the cytoplasm；the expression of β-catenin on the cell membrane in the NPC was significantly lower than that of the control tissues，however，β-catenin in the cytoplasm and the nucleus of NPC was significantly up-regulated.Real-time quantitative PCR showed that the expression of Wnt2 mRNA in the NPC tissue was significantly higher than that in the control tissues(P<0.01)，and the expression of β-catenin mRNA was significanlty lower than that of the control tissues(P=0.016).Western blotting revealed that the expression of Wnt2 protein in the NPC tissue was higher than that in the control tissues，and the content of β-catenin protein was significantly increased in the tested NPC samples.Conclusion There are significantly abnormal expression levels of Wnt2 and β-catenin in NPC，suggesting that aberrant activation of Wnt/β-catenin signaling pathway may be one of important molecular mechanisms of tumorigenesis and development of NPC.

nasopharyngeal carcinoma； Wnt/β-catenin signaling pathway； aberrant activation

R739.63

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.011

黃孝文，男，1962年生，主任醫(yī)師，E-mail：xwhuang@tjh.tjmu.edu.cn