柴黃清胰活血顆粒乙醇提取工藝

趙劍+李靜+李志+蒲清榮+黃銳+羅群

摘要：目的優(yōu)選柴黃清胰活血顆粒的最佳乙醇提取工藝。方法采用乙醇回流提取法、乙醇超聲提取法和乙醇滲漉提取法，提取柴黃清胰活血顆粒中部分中藥材，用HPLC法測(cè)定其指標(biāo)性成分延胡索乙素的含量，選取延胡索乙素含量最高的提取方法作為柴黃清胰活血顆粒的乙醇提取工藝，并通過(guò)正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選其最佳提取工藝。結(jié)果乙醇回流提取法與乙醇滲漉法提取的延胡索乙素含量較高，且含量相差不大，結(jié)合實(shí)踐，采用乙醇滲漉法提取延胡索乙素，其最佳滲漉提取工藝為：浸泡36 h，乙醇濃度55%，乙醇用量10倍，滲漉流速3 ml·min-1。結(jié)論該工藝客觀可行，穩(wěn)定合理，可為工藝生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：滲漉提取法；正交設(shè)計(jì)；高效液相色譜；延胡索乙素；柴黃清胰活血顆粒

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2017）06-0074-03

【Abstract】Objective： To optimize the best ethanol extraction process of Chaihuang Qingyi Huoxue Granule. Methods： Ethanol reflux extraction， ethanol ultrasonic extraction and ethanol percolation extraction were used to extract part of medicinal materials from Chaihuang Qingyi Huoxue Granule and HPLC was used to determine content of tetrahydropalmatine. The highest content extraction of tetrahydropalmatine was taken as ethanol extraction technology of Chaihuang Qingyi Huoxue Granule， and its optimal extraction process was optimized by orthogonal design. Results： The ethanol reflux extraction and ethanol percolation extraction could extract higher amount of content with less different content. In practice， the ethanol percolation extraction was used to extract tetrahydropalmatine. The optimum extraction process was as follows： 36-hour soaking， 55% of ethanol concentration， 10 times of ethanol dosage， 3 ml·min-1 of percolation flow rate. Conclusion： The process is objective and feasible， stable and reasonable， which can provide a theoretical basis for its production.

【Key words】percolation extraction， orthogonal design， HPLC， tetrahydropalmatine， Chaihuang Qingyi Huoxue Granule

柴黃清胰活血顆粒是西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院協(xié)定處方，主要由生大黃、柴胡、延胡索、丹參、梔子、黃芩、白芍等14味中藥組成。具有清熱解毒、活血消腫、通腑瀉熱、理氣止痛的功效，用于急性胰腺炎的治療。處方中延胡索所含有效成分延胡索乙素和丹參所含有效成分：丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮、異隱丹參酮等成分，易溶于醇、醚等有機(jī)溶劑[1～2]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，延胡索乙素具有鎮(zhèn)痛抗炎作用，提高模型大鼠應(yīng)激能力，提高小鼠抗疲勞能力及耐缺氧能力等作用[3]。為了最大限度地提取上述中藥的有效成分，筆者考慮使用乙醇提取柴黃清胰活血顆粒的有效成分，采用70%乙醇回流提取、超聲提取和滲漉提取上述中藥材，用HPLC法測(cè)定其中指標(biāo)性成分延胡索乙素的含量，選取延胡索乙素含量最高的提取方法作為柴黃清胰活血顆粒的乙醇提取工藝，并通過(guò)正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選其最佳提取工藝[4～5]。

1儀器與材料

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司），SPD-20A紫外可見(jiàn)檢測(cè)器LCsolution色譜工作站；UltimateTM C18鍵合硅膠柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；JPGT0328超聲提取器（武漢嘉鵬電子有限公司），NRB17S3W電冰箱（日本松下）；HH數(shù)顯電熱恒溫水浴箱（江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；ZK072型電熱真空干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠）；AUW120D電子天平（日本島津）；延胡索乙素（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110726-201516，供含量測(cè)定用）；延胡索（CORYDALIS RHIZOMA）、丹參（SALVIAE MILTIORRHIZAE RADIX ET RHIZOMA）均購(gòu)于瀘州市天植中藥飲片公司，經(jīng)瀘州市藥檢所中藥室袁常珍主任鑒定均符合《中國(guó)藥典》2015年版相關(guān)要求；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果。

2.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)UltimateTM C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（三乙胺調(diào)PH值至6.4）（52：48），流速：1 mL·min-1，溫度：25℃，波長(zhǎng)：280 nm，進(jìn)樣量10 μL，在此條件下，延胡索乙素峰和供試品中其他相鄰組分色譜峰的分離度較好，按延胡索乙素峰計(jì)算，理論板數(shù)按延胡索乙素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000[6～7]。

2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取延胡索乙素對(duì)照品7.1 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解并定容至刻度，搖勻，得對(duì)照品母液，再取上述溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得濃度為0.0355 mg·mL-1對(duì)照品溶液

2.3線性范圍的考察分別精密吸取上述對(duì)照品溶液2.5、5、10、15、20 μL注入高效液相色譜儀，按擬定的色譜條件測(cè)定，將峰面積（Y）與質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得到回歸方程：Y=899714X+12003，R2=0.9998（n=5）表明對(duì)照品在0.0889～0.71 μg之間與峰面積線性關(guān)系良好，見(jiàn)圖1-3。

2.4乙醇提取方法比較

2.4.1乙醇回流提取法取延胡索、丹參粉碎成粗顆粒（過(guò)10目篩），分別精密稱取延胡索20 g，丹參30 g，置500 mL磨口燒瓶中，加熱回流提取2次，每次加入70%的乙醇400 mL，浸泡30 min，提取1 h，過(guò)濾，合并濾液減壓濃縮至少量，60 ℃恒溫干燥，得粗提物。

2.4.2乙醇超聲提取法取延胡索、丹參粉碎成粗顆粒（過(guò)10目篩），分別精密稱取延胡索20 g，丹參30 g，置500 mL燒杯中，超聲提取2次，每次加入70%的乙醇400 mL，浸泡30 min，提取1 h，過(guò)濾，合并濾液減壓濃縮至少量，60 ℃恒溫干燥，得粗提物。

2.4.3乙醇滲漉提取法取延胡索、丹參粉碎成粗顆粒（過(guò)10目篩），分別精密稱取延胡索20 g，丹參30 g，取70%乙醇400 mL，先用適量的乙醇浸泡30 min，使其均勻潤(rùn)透，取脫脂棉一團(tuán)，用浸泡液潤(rùn)濕后墊在滲漉筒底部鋪平，裝筒，將剩余的乙醇加入，加蓋密閉24 h，以1 mL·min-1流速滲漉，收集完滲漉液，減壓濃縮至少量，60 ℃恒溫干燥，得干浸膏。

2.4.4準(zhǔn)確稱取上述3種干浸膏1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入溶劑（濃氨：甲醇=1：20）50 mL，稱定重量，冷浸1 h，加熱回流1 h，放至室溫，稱定重量，加甲醇補(bǔ)足損失重量，搖勻，濾過(guò)，即可得供試品溶液。各精密吸取10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定峰面積，計(jì)算胡索乙素含量。結(jié)果：乙醇回流提取法測(cè)得胡索乙素含量為0.8489 mg·g-1，乙醇超聲提取法測(cè)得胡索乙素含量為0.5864 mg·g-1，乙醇滲漉法測(cè)得胡索乙素含量為0.8318 mg·g-1。通過(guò)比較，乙醇回流提取法和乙醇滲漉法提取的胡索乙素含量相差不大，考慮到丹參中的丹參酮ⅡA的熱穩(wěn)定性較差[8]，故采用滲漉法作為乙醇提取工藝。擬采用正交設(shè)計(jì)，優(yōu)選乙醇滲漉法的最佳提取條件。

2.5乙醇滲漉工藝優(yōu)選以乙醇濃度、浸泡時(shí)間、加醇量、滲漉流速四因素、三水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)法安排實(shí)驗(yàn)，以干浸膏、胡索乙素含量為指標(biāo)，優(yōu)選乙醇滲漉工藝最佳條件。取延胡索、丹參粉碎成粗顆粒（過(guò)10目篩），準(zhǔn)確稱取9份樣品，每份含延胡索20 g，丹參30 g。按表1中9種工藝條件組合進(jìn)行滲漉提取，提取液減壓濃縮至少量，60 ℃恒溫干燥成干浸膏，備用。見(jiàn)表1。

2.6供試品溶液的制備 分別取9種試驗(yàn)后的干浸膏各0.5 g精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入溶劑（濃氨：甲醇=1：20）50 ml，稱定重量，冷浸1h，加熱回流1h，放至室溫，稱定重量，加甲醇補(bǔ)足損失重量，搖勻，濾過(guò)，即可得供試品溶液。

2.7方法學(xué)考察

2.7.1精密度考查精密吸取延胡索乙素對(duì)照品溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，RSD為1.01%，表明儀器精密度較高。

2.7.2穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液，分別于制備后0，2，4，6，8，10 h按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果胡索乙素峰面積的RSD為0.62%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.3重復(fù)性試驗(yàn)取同一供試品溶液6份，分別按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果胡索乙素峰面積的RSD為0.67%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7.4加樣回收試驗(yàn)取6份6號(hào)正交試驗(yàn)干浸膏0.5 g精密稱定重量，精密加入對(duì)照品母液溶液（0.71 mg·mL-1）0.5 mL按2.6項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算胡索乙素峰的平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.8結(jié)果正交實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果方差分析見(jiàn)表3-4。

通過(guò)直觀分析可知，各因素對(duì)乙醇滲漉提取工藝的影響順序?yàn)锳>B>D>C。方差分析表明，A因素對(duì)胡索乙素轉(zhuǎn)移率影響顯著，其他因素則無(wú)顯著影響，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際考慮，確定其最佳提取工藝為A1B3C3D3，即加10倍量55%乙醇，浸泡36 h，以3 mL·min-1的速度滲漉。

2.9工藝驗(yàn)證按處方量稱取藥材3份，按選定的最佳提取工藝提取，即加10倍量55%乙醇，浸泡36 h，以3 mL·min-1的速度滲漉，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果胡索乙素轉(zhuǎn)移率為：56.73%、57.21%、57.11%，表明該工藝穩(wěn)定可行、重復(fù)性較好。

3討論

本試驗(yàn)粗略地比較了3種不同的乙醇提取方法，其中乙醇加熱回流提取工藝和乙醇滲漉工藝提取得到的胡索乙素含量最高。在大生產(chǎn)中，滲漉提取工藝既有較高的提取率，又能為生產(chǎn)企業(yè)節(jié)約生產(chǎn)成本，是一種理想的提取工藝。

本實(shí)驗(yàn)在選擇流動(dòng)相時(shí)使用緩沖鹽溶液，分別對(duì)甲醇—緩沖鹽系統(tǒng)及乙腈—緩沖鹽系統(tǒng)進(jìn)行色譜考察，甲醇—緩沖鹽溶液系統(tǒng)對(duì)色譜柱的壓力過(guò)高，容易對(duì)色譜柱造成損害，更對(duì)色譜圖造成誤差，因此不采用，使用乙腈—緩沖鹽系統(tǒng)，色譜峰峰形較好，分離度較高[9～10]。

由于9個(gè)實(shí)驗(yàn)的出膏率不一樣，采用干浸膏中胡索乙素的含量作為數(shù)據(jù)分析的依據(jù)，結(jié)果沒(méi)有可比性，正交試驗(yàn)方差分析數(shù)據(jù)也不準(zhǔn)確，所以本試驗(yàn)采用胡索乙素的轉(zhuǎn)移率作為考察指標(biāo)。

3.4本試驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定胡索乙素含量，分離效果好，操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，測(cè)定結(jié)果為優(yōu)選柴黃清胰活血顆粒乙醇滲漉提取工藝提供參考依據(jù)。為柴黃清胰活血顆粒進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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