馬克斯克魯維酵母的木糖和阿拉伯糖發(fā)酵

侯勝博，馮華良，高教琪，李益民，袁文杰，白鳳武

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馬克斯克魯維酵母的木糖和阿拉伯糖發(fā)酵

侯勝博1，馮華良1，高教琪1，李益民1，袁文杰1，白鳳武2

1 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連 116023 2 上海交通大學(xué)微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240

侯勝博, 馮華良, 高教琪, 等. 馬克斯克魯維酵母的木糖和阿拉伯糖發(fā)酵. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(6): 923–935.Hou SB, Feng HL, Gao JQ, et al. Fermentations of xylose and arabinose by Kluyveromyces marxianus. Chin J Biotech, 2017, 33(6): 923–935.

馬克斯克魯維酵母作為非常規(guī)酵母在燃料乙醇發(fā)酵中受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。馬克斯克魯維具有天然的發(fā)酵戊糖的能力，但不同菌株的發(fā)酵能力存在較大差異。本研究比較了3株馬克斯克魯維菌株9009/1911/1727 (9009/1911/1727) 在不同溫度下的木糖和阿拉伯糖的發(fā)酵性能差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵溫度下，3株菌在耗糖速率、糖醇產(chǎn)率均表現(xiàn)出了顯著的差異。菌株9009和1727在40 ℃下的發(fā)酵性能均優(yōu)于30 ℃，這充分體現(xiàn)了馬克斯克魯維酵母的高溫發(fā)酵優(yōu)勢(shì)。針對(duì)發(fā)酵差異，采用PCR方法獲得3個(gè)不同菌株的戊糖代謝途徑中的5種關(guān)鍵代謝酶 (XR、XDH、XK、AR和LAD) 的基因序列，并利用Clustalx 2.1進(jìn)行了序列比對(duì)。結(jié)果顯示3株菌的相關(guān)基因與文獻(xiàn)中報(bào)道的1株克魯維酵母的相應(yīng)關(guān)鍵酶氨基酸編碼序列相似性達(dá)98%以上，并且差異的氨基酸不在酶的關(guān)鍵位點(diǎn)處。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)Real-time實(shí)驗(yàn)，對(duì)木糖發(fā)酵差異最為明顯的1727和1911的木糖代謝過(guò)程4個(gè)關(guān)鍵酶 (XR、XDH、XK和ADH) 的基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果顯示對(duì)于耐熱菌株1727，XDH和XK基因表達(dá)量低是導(dǎo)致木糖代謝過(guò)程中木糖醇積累、乙醇產(chǎn)量低的主要原因。最后，將所測(cè)得的馬克斯克魯維酵母的戊糖代謝關(guān)鍵酶序列與其他不同種屬相比對(duì)，確定了其木糖和阿拉伯糖代謝途徑，為進(jìn)一步利用代謝工程方法提高戊糖發(fā)酵性能奠定了基礎(chǔ)。

馬克斯克魯維酵母,木糖發(fā)酵,阿拉伯糖發(fā)酵,代謝途徑，序列比對(duì)

隨著人類對(duì)石油等化石資源的大量開采，能源問(wèn)題日益困擾著我們。燃料乙醇因其具有較高的辛烷值[1]，無(wú)毒，是公認(rèn)的最有可能替代化石能源的環(huán)境友好型生物質(zhì)能源之一。此外，纖維素燃料乙醇由于其原料來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、可再生性等特點(diǎn)受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[2]。

目前，釀酒酵母由于其高的乙醇生產(chǎn)率、耐受性和有效的己糖發(fā)酵能力在乙醇生產(chǎn)中起主要作用[3-4]，但其不能利用木糖和其他的C5糖。雖然通過(guò)外源搭建戊糖的代謝途徑，釀酒酵母獲得了利用戊糖的能力，但戊糖轉(zhuǎn)化率低，乙醇得率低仍是阻礙其在纖維素乙醇生產(chǎn)中應(yīng)用的主要原因。此外，熱帶假絲酵母也常用到纖維素乙醇的發(fā)酵中[5]，但由于其代謝途徑中存在還原力不平衡的問(wèn)題更多地用于木糖醇的生產(chǎn)[6-7]。

近年來(lái)，非傳統(tǒng)酵母包括拜耳接合酵母[8]、東方伊薩酵母[8]、馬克斯克魯維酵母[9-10]和魯氏酵母等越來(lái)越多地應(yīng)用到纖維素乙醇發(fā)酵中。其中的馬克斯克魯維酵母具有在真核微生物中生長(zhǎng)速率最大[11]，可在高達(dá)45–52 ℃溫度下生長(zhǎng)[12]，代謝底物范圍廣 (包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、乳糖等六碳糖和木糖、阿拉伯糖等五碳糖[13]) 等特點(diǎn)，使其替代釀酒酵母成為發(fā)酵木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的良好選擇[14-17]。

在本實(shí)驗(yàn)中，以3株不同的馬克斯克魯維酵母為出發(fā)菌株，研究了其在不同溫度下發(fā)酵戊糖 (木糖和阿拉伯糖) 的情況，對(duì)菌體的生長(zhǎng)、木糖和阿拉伯糖利用率和乙醇、木糖醇、阿拉伯糖醇產(chǎn)量以及副產(chǎn)物產(chǎn)量分別進(jìn)行了測(cè)定。在此基礎(chǔ)上，對(duì)其代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因(木糖代謝途徑：木糖還原酶XR、木糖醇脫氫酶XDH和木酮糖激酶XK；阿拉伯糖代謝途徑：阿拉伯糖還原酶AR和阿拉伯糖醇脫氫 酶LAD) 進(jìn)行了序列測(cè)定及深入分析，試圖在基因水平上解釋其發(fā)酵差異，找出其影響發(fā)酵結(jié)果的關(guān)鍵因素，為構(gòu)建高發(fā)酵性能的菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

馬克斯克魯維酵母()9009、1911、1727均購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物保藏中心，編號(hào)分別為9009、1911和1727。以上菌株由大連理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基(g/L)：無(wú)水葡萄糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基同活化培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：糖類40 (葡萄糖、木糖、阿拉伯糖)，其余成分同種子培養(yǎng)基。

1.1.3 引物

實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列見表1。

表1 文中所用的引物序列

1.1.4 工具酶及試劑盒

引物合成和序列測(cè)序委托生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成。

DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA marker等購(gòu)自TaKaRa (大連) 公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒與瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純以上。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)及發(fā)酵條件

將菌株接種到活化培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，取1 mL活化發(fā)酵液轉(zhuǎn)接到100 mL種子培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)12–16 h。測(cè)定620值，確定其接入木糖發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量，保證其起始接種量一致。

經(jīng)過(guò)兩級(jí)種子活化，將種子液以10%的體積分?jǐn)?shù)接入有效體積為200 mL的500 mL搖瓶培養(yǎng)基中，搖瓶用8層紗布(微量通氣) 封口。30 ℃、150 r/min培養(yǎng)。定時(shí)取樣，并測(cè)定生物量，5 000 r/min離心5 min，液氮凍存菌體以待后續(xù)轉(zhuǎn)錄水平分析，上清液用于糖以及各種代謝產(chǎn)物濃度的測(cè)定。

1.2.2 分析方法

生物量測(cè)定方法: 采用值法，將菌液適當(dāng)稀釋，在波長(zhǎng)為620 nm處測(cè)定其吸光值。

發(fā)酵液代謝產(chǎn)物的分析：發(fā)酵液在5 000 r/min下離心5 min，取上清液，用孔徑為0.22 μm的水膜過(guò)濾，利用高效液相色譜(HPLC) 測(cè)定木糖、阿拉伯糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、甘油、乙酸和乙醇的含量。色譜柱的型號(hào)為SUGAR系列SP0810。流動(dòng)相為純水，流量為0.7 mL/min，分別使用紫外檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm) 和示差檢測(cè)器。

1.2.3 酵母基因組DNA的提取

菌體的培養(yǎng)與收獲：從30 ℃培養(yǎng)2 d的酵母菌平板上挑取一個(gè)單菌落，接入100 mL YPD液體培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)16 h。10 000 r/min離心3 min收集菌體。

菌體的裂解：用無(wú)菌水洗滌菌體2次，向菌體中加入500 μL裂解液,將菌體懸浮，再加入2/3體積的干凈玻璃珠(d=0.5 mm) 和25 μL的5 mmol/L NaCl溶液，高速振蕩破碎細(xì)胞。 12 000 r/min離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中。

基因組DNA的抽提：加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，同上振蕩，10 000 r/min離心1 min。取上清，加入2倍體積95%乙醇后置于–20 ℃放置l h。

高速離心10 min后，用70%乙醇洗滌沉淀，于室溫晾干，并將沉淀溶于適量TE緩沖液 (pH 8.0) 中，加入適量RNase消化RNA，即得酵母基因組DNA樣品，取5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩余的DNA樣品于–20 ℃保存。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)及序列比對(duì)

引物的設(shè)計(jì)：采用PrimerPremier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，按照GenBank的NBRC 1777的戊糖代謝途徑中關(guān)鍵酶(XR、XDH、XK、AR、ADH、XLR) 基因全序列為依據(jù)設(shè)計(jì)上述引物。

序列比對(duì)：1) 登陸NCBI網(wǎng)站，利用網(wǎng)站中的Blast工具對(duì)所測(cè)得的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行序列比對(duì)。2) 利用Clustalx 2.1軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.2.5 酵母RNA提取及Real-time實(shí)驗(yàn)

RNA的提?。菏褂每俁NA提取試劑盒 (天根生化科技股份有限公司)。

Real-time實(shí)驗(yàn)委托生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬克斯克魯維酵母發(fā)酵木糖

經(jīng)木糖為碳源的種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，馬克斯克魯維酵母9009、1911、1727在不同溫度下(30 ℃和40 ℃) 利用木糖的情況如圖1和表2所示。從圖1可以看出，相同發(fā)酵條件下，不同菌株有著不同的生長(zhǎng)狀態(tài)，在耗糖速率、木糖醇產(chǎn)率和乙醇產(chǎn)率上有著明顯的不同。30 ℃條件下，消耗木糖最快的菌株為.1727，發(fā)酵32.94 g/L木糖，產(chǎn)生9.22 g/L的木糖醇，產(chǎn)生少量乙醇。生物量620達(dá)到6左右；其次為.1911，生物量620達(dá)到4左右，6 d消耗29.19 g/L木糖，剩余4.51 g/L殘?zhí)?，無(wú)木糖醇積累，但能產(chǎn)生2.68 g/L的乙醇；消耗木糖最慢的為.9009，雖然生物量最高，620達(dá)到6.7左右，但6 d內(nèi)只消耗28.74 g/L木糖，產(chǎn)生1.89 g/L的木糖醇且基本無(wú)乙醇產(chǎn)生。

而40 ℃條件下，消耗木糖最快的也是.1727，雖然最終生物量620僅達(dá)到4左右，但35.60 g/L木糖可在5 d基本耗完，并能產(chǎn)生19.25 g/L的木糖醇，同樣基本無(wú)乙醇產(chǎn)生；其次是.9009，生物量620最終能達(dá)到4.5左右，但35.60 g/L木糖需要6 d才能耗完，產(chǎn)生13.22 g/L的木糖醇，產(chǎn)生少量乙醇；耗糖最慢的為.1911，生物量620為3.5左右，35.60 g/L木糖發(fā)酵6 d后，還剩余19.79 g/L，產(chǎn)生少量木糖醇和乙醇。

通過(guò)比較不同溫度下菌株的發(fā)酵性能可以看出，菌株.1727和.9009在40 ℃條件下的發(fā)酵性能均優(yōu)于30 ℃，木糖消耗快，并且木糖醇的產(chǎn)量分別由9.22 g/L和1.89 g/L提高至19.25 g/L和13.22 g/L，體現(xiàn)了馬克斯克魯維酵母在高溫條件下發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)。

圖1 三株馬克斯克魯維酵母的木糖發(fā)酵結(jié)果(A、C為其30 ℃溫度下菌體的生長(zhǎng)狀況和發(fā)酵結(jié)果；B、D為其40 ℃溫度下菌體的生長(zhǎng)狀況和發(fā)酵結(jié)果)

表2 木糖為底物時(shí)菌株的生長(zhǎng)參數(shù)

2.2 馬克斯克魯維酵母發(fā)酵阿拉伯糖

經(jīng)在酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)基 (YPD) 種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，接入以阿拉伯糖為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵，其在不同發(fā)酵溫度(30 ℃和40 ℃) 下的發(fā)酵結(jié)果如圖2和表3所示。從發(fā)酵結(jié)果來(lái)看，3株克魯維酵母發(fā)酵阿拉伯糖時(shí)表現(xiàn)出比發(fā)酵木糖時(shí)更大的差異性。

30 ℃發(fā)酵溫度下，7 d的發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵阿拉伯糖最快的為9009，生物量620達(dá)到5，消耗30.70 g/L的阿拉伯糖，產(chǎn)生13.85 g/L的阿拉伯糖醇。其次為1727，生物量達(dá)到3，消耗21.49 g/L阿拉伯糖，剩余17.27 g/L的阿拉伯糖，但有12.22 g/L的阿拉伯糖醇產(chǎn)生。最慢的為1911，生物量只達(dá)到2左右，剩余30.98 g/L的阿拉伯糖，產(chǎn)生6.06 g/L的阿拉伯糖醇。3株菌均無(wú)乙醇產(chǎn)生。

40 ℃發(fā)酵溫度下，發(fā)酵阿拉伯糖速率最快的為1727，37 g/L的阿拉伯糖發(fā)酵6 d剩余4 g/L的阿拉伯糖，產(chǎn)生大約26 g/L的阿拉伯糖醇；其次為9009，37 g/L的阿拉伯糖發(fā)酵7 d剩余5 g/L的阿拉伯糖，產(chǎn)生大約20 g/L的阿拉伯糖醇；最慢的為1911，36 g/L的阿拉伯糖發(fā)酵7 d剩余12.5 g/L的阿拉伯糖，產(chǎn)生18 g/L的阿拉伯糖醇。

比較40 ℃和30 ℃的阿拉伯糖的發(fā)酵結(jié)果，同樣體現(xiàn)了馬克斯克魯維酵母在高溫發(fā)酵方面的優(yōu)勢(shì)。隨溫度的升高，雖然菌株的生長(zhǎng)受到一定影響，但阿拉伯糖醇的產(chǎn)量大幅提高，1727的阿拉伯糖醇產(chǎn)率由30 ℃的0.56 g/g，提高到40 ℃的0.79 g/g；9009的阿拉伯糖醇產(chǎn)率由30 ℃的0.45 g/g，提高到40 ℃的0.63 g/g。

2.3 木糖代謝途徑中關(guān)鍵酶編碼基因的克隆及序列比對(duì)

采用PCR的方法，獲得了馬克斯克魯維酵母中編碼木糖代謝途徑中關(guān)鍵酶(XR、XDH、XK) 基因，送生工生物工程 (上海) 股份有限公司測(cè)序。相應(yīng)關(guān)鍵酶的基因編碼序列已提交到NCBI中，其XR序列登錄號(hào)(9009, 1911, 1727): KX388390–KX388392；XDH序列登錄號(hào)(9009, 1911, 1727): KX455881–KX455883；XK序列登錄號(hào)(9009, 1911, 1727): KX462707–KX462709。以NCBI中已提交的馬克斯克魯維酵母NBRC1777相對(duì)應(yīng)的酶編碼序列為基準(zhǔn)，以其所編碼的氨基酸序列與本文中所用3個(gè)菌株的相應(yīng)基因編碼蛋白序列進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3株菌的3種關(guān)鍵酶氨基酸序列與NBRC1777的相應(yīng)序列相似性都達(dá)98%以上。進(jìn)行Clustalx多序列比對(duì)后，其差異如圖3所示。木糖還原酶的活性位點(diǎn)位于22–24、47、52、81、14、115、173、174、195、221–224、261、276–279、284、287和288處的氨基酸序列[17]，而其序列差異存在于其氨基酸序列為15、320–321、325、327位點(diǎn)，不在其活性位點(diǎn)處；木糖醇脫氫酶的活性位點(diǎn)位于42、44、48、54、57等氨基酸處[18]，而其序列差異存在于9、12、14、211、277處的氨基酸位點(diǎn)，不在其活性位點(diǎn)處。木酮糖激酶的活性位點(diǎn)位于10、12–15、17–91、93等氨基酸處[19]，而其序列差異存在于其氨基酸序列為38、250、414、417、579位點(diǎn)，不在其活性位點(diǎn)處；與其他2株不同的是，在菌株1727中，檢測(cè)到與活性位點(diǎn)相關(guān)的差異位點(diǎn)包括10、12–15、17處的氨基酸序列。這些序列差異的突變，與1727的木糖發(fā)酵及耐熱性之間的相關(guān)性尚需進(jìn)一步深入研究。

圖2 三株馬克斯克魯維酵母的阿拉伯糖發(fā)酵結(jié)果(A、C為其30 ℃溫度下菌體的生長(zhǎng)狀況和發(fā)酵結(jié)果；B、D為其40 ℃溫度下菌體的生長(zhǎng)狀況和發(fā)酵結(jié)果)

表3 阿拉伯糖為底物時(shí)菌株的生長(zhǎng)參數(shù)

圖3 四株馬克斯克魯維酵母的木糖代謝途徑中3個(gè)關(guān)鍵酶的氨基酸序列差異位點(diǎn)

2.4 阿拉伯糖代謝途徑中關(guān)鍵酶編碼基因的克隆及序列比對(duì)

對(duì)馬克斯克魯維酵母中編碼阿拉伯糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶的基因序列(AR和LAD) 進(jìn)行了測(cè)序，其相應(yīng)關(guān)鍵酶的編碼序列結(jié)果已提交到NCBI中，其AR序列登錄號(hào)(9009, 1911,1727): KX455884–KX455886、LAD序列登錄號(hào)(9009,1911,1727): KX591955–KX591957。以NCBI中已提交的馬克斯克魯維酵母DMKU3- 1042相對(duì)應(yīng)的酶編碼序列為基準(zhǔn)，與其所編碼的氨基酸序列進(jìn)行Blast序列進(jìn)行一一比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3株菌與DMKU3-1042的相應(yīng)序列相似性都達(dá)99%以上。并進(jìn)行Clustalx多序列比對(duì)，其差異如圖4所示，其中阿拉伯糖還原酶的活性位點(diǎn)位于28–30、53、58、89、123–124、154–155、178、204–209、230、245–248、253、256–257[20]處的氨基酸序列，而其序列差異存在于其氨基酸序列為163、205、239、271–272位點(diǎn)。阿拉伯糖醇脫氫酶的活性位點(diǎn)位于39、41–42、44、63–65、125–127、149、196–198、213、217、243–246氨基酸處[20]，而序列差異為66、115、211處的氨基酸位點(diǎn)。這些序列差異均不在已知蛋白活性位點(diǎn)處。但從序列差異的結(jié)果來(lái)看，在這兩個(gè)酶的編碼氨基酸中，均是1911與其他3株不同，并且1911發(fā)酵阿拉伯糖的效果最差，因此，這些突變的位點(diǎn)可能與阿拉伯糖的代謝相關(guān)。綜上，與木糖代謝類似，在基因水平上仍無(wú)法解釋3株酵母在阿拉伯糖發(fā)酵性能方面的差異，可能存在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平的調(diào)控。

2.5 關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定

為了在基因轉(zhuǎn)錄水平上解釋其發(fā)酵差異，選取了木糖發(fā)酵差異最為明顯的1727和1911，對(duì)木糖代謝過(guò)程4個(gè)關(guān)鍵酶 (XR、XDH、XK和ADH) 的基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。選取在40 ℃發(fā)酵溫度下，木糖發(fā)酵時(shí)間為0 d、2 d、4 d的菌體，經(jīng)液氮冷凍后，提取RNA并對(duì)其木糖代謝途徑中的4個(gè)關(guān)鍵酶編碼基因(XR、XDH、XK和ADH) 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)，以發(fā)酵第0天的各基因表達(dá)量為1作為標(biāo)準(zhǔn)，得到其不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)處的相對(duì)表達(dá)量，其結(jié)果如圖4所示，從圖5A可以看出在1727中，XR的相對(duì)表達(dá)量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，第4天，XR的相對(duì)表達(dá)量是其第1天的4.5倍，而XDH和XK的表達(dá)量卻隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)沒(méi)有太大變化。這正好與木糖醇的積累相符合，說(shuō)明菌株木糖代謝途徑只走了第一步。而從圖5B可以看出在1911中，XR、XDH、XK三個(gè)基因的表達(dá)量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)變化趨勢(shì)基本一致。此外，從圖5C我們可以看出1911的乙醇脫氫酶的基因表達(dá)量明顯高于1727，這與其乙醇產(chǎn)率明顯高于1727相一致。

圖4 四株馬克斯克魯維酵母的阿拉伯糖代謝途徑中2個(gè)關(guān)鍵酶的氨基酸序列差異位點(diǎn)

從結(jié)果可以看出，木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶的基因表達(dá)量低是導(dǎo)致克魯維酵母發(fā)酵木糖過(guò)程中木糖醇積累和乙醇產(chǎn)率低的主要原因。文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)在木糖代謝途徑中過(guò)表達(dá)木酮糖激酶和木糖醇脫氫酶可以提高乙醇產(chǎn)率[21-24]，因此采用基因工程的方法提高相關(guān)基因的表達(dá)量，同樣是解決克魯維酵母快速發(fā)酵戊糖生產(chǎn)乙醇的選擇。

2.6 馬克斯克魯維酵母的戊糖代謝途徑

通過(guò)與已發(fā)表的馬克斯克魯維酵母[17-20]、拜耳結(jié)合酵母[25]和熱帶假絲酵母[26]對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵酶編碼序列相比對(duì)，根據(jù)其不同物種之間的差異和同一物種的同源性，我們進(jìn)一步確定了馬克斯克魯維酵母中的戊糖代謝途徑如圖6所示。其中在木糖代謝過(guò)程中(圖6,②)，木糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，首先在木糖還原酶(Xylose reductase，XR) 的作用下轉(zhuǎn)化為木糖醇，然后在木糖醇脫氫酶(Xylitol dehydrogenase，XDH) 的作用下形成木酮糖，最后再經(jīng)過(guò)木酮糖激酶(Xylulokinase，XK) 催化形成木酮糖-5-磷酸，由此進(jìn)入戊糖磷酸途徑(PPP) 和糖酵解途徑。

相對(duì)于木糖代謝途徑，L-阿拉伯糖代謝途徑(圖6,④) 相對(duì)復(fù)雜，由4個(gè)交替的氧化還原反應(yīng)組成。L-阿拉伯糖首先被L-阿拉伯糖還原酶(Arabinose reductase，AR) 還原成L-阿拉伯糖醇，再被L-阿拉伯糖醇-4-脫氫酶(L-arabinitol- 4-dehydrogenase，LAD) 轉(zhuǎn)化成L-木酮糖，L-木酮糖經(jīng)L-木酮糖還原酶(L-xylulose reductase，LXR) 還原成木糖醇，木糖醇在木糖醇脫氫酶(D-xylitol dehydrogenase，XDH) 和木酮糖激酶(Xylulokinase，XK) 作用下生成5-磷酸木酮糖，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway，PPP) 進(jìn)一步被代謝。

圖6 木糖和阿拉伯糖代謝途徑(①③分別為細(xì)菌中的木糖和阿拉伯糖代謝途徑；②④分別為真菌酵母中的木糖和阿拉伯糖代謝途徑)

3 結(jié)論

通過(guò)比較3株馬克斯克魯維酵母(9009、1911、1727) 在不同溫度下(30 ℃和40 ℃) 的戊糖發(fā)酵性能，發(fā)現(xiàn)克魯維酵母是適于同步糖化發(fā)酵纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)生物能源的出發(fā)菌株。馬克斯克魯維酵母具有天然發(fā)酵戊糖的能力，并且1727在40 ℃的耗糖速率和木糖醇、阿拉伯糖醇產(chǎn)率明顯高于30 ℃，充分體現(xiàn)了馬克斯克魯維酵母在高溫下的發(fā)酵優(yōu)勢(shì)。菌株1911耗糖速率雖然不如菌株1727快，但其發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的能力比1727高，而9009在戊糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況最好。雖然3株菌代謝戊糖時(shí)表現(xiàn)出顯著差異，但關(guān)鍵酶的編碼基因相差不大，其在轉(zhuǎn)錄水平的差別是導(dǎo)致不同發(fā)酵結(jié)果的原因。采用基因工程的方法提高相關(guān)基因的表達(dá)量，是解決克魯維酵母快速發(fā)酵戊糖生產(chǎn)乙醇的選擇。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Fermentations of xylose and arabinose by

Shengbo Hou1, Hualiang Feng1, Jiaoqi Gao1, Yimin Li1, Wenjie Yuan1, and Fengwu Bai2

1 School of Life Sciences and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116023, Liaoning, China 2 State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China

, as unconventional yeast, attracts more and more attention in the biofuel fermentation. Although this sort of yeasts can ferment pentose sugars, the fermentation capacity differs largely. Xylose and arabinose fermentation by threestrains (9009,1911 and1727) were compared at different temperatures. The results showed that the fermentation performance of the three strains had significant difference under different fermentation temperatures. Especially, the sugar consumption rate and alcohol yield of9009 and1727 at 40 ℃ were better than 30 ℃. This results fully reflect the fermentation advantages ofyeast under high-temperature. On this basis, five genes (XR, XDH, XK, AR and LAD) coding key metabolic enzymes in three different yeasts were amplified by PCR, and the sequence were compared by Clustalx 2.1. The results showed that the amino acid sequences coding key enzymes have similarity of over 98% with the reference sequences reported in the literature. Furthermore, the difference of amino acid was not at the key site of its enzyme, so the differences between three stains were not caused by the gene level, but by transcribed or translation regulation level. By real-time PCR experiment, we determined the gene expression levels of four key enzymes (XR, XDH, XK and ADH) in the xylose metabolism pathway of1727 and1911 at different fermentation time points. The results showed that, for thermotolerant yeast1727, the low expression level of XDH and XK genes was the main factors leading to accumulation of xylitol. In addition, according to the pathway of, which have been reported in NCBI and KEGG, the xylose and arabinose metabolic pathways ofwere identified, which laid foundation for further improving the pentose fermentation ability by metabolic engineering.

, xylose fermentation, arabinose fermentation, metabolic pathway, sequence aligment

10.13345/j.cjb.160458

November 24, 2016; Accepted:January 6, 2017

Wenjie Yuan. Tel: +86-411-84706308; E-mail: ywj@dlut.edu.cn

Supported by:China Postdoctoral Science Foundation (No. 2015M571316), National Key Laboratory Project of Microbial Metabolism (No. MMLKF16-04).

中國(guó)博士后基金項(xiàng)目(No. 2015M571316)，微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(No. MMLKF16-04) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-01-16

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170116.1007.003.html