牛糞堆肥中溶解性有機物對銅綠微囊藻生理生化及 產毒特性的影響

林毅青，吳根義，許振成，邵繼海

?

牛糞堆肥中溶解性有機物對銅綠微囊藻生理生化及 產毒特性的影響

林毅青，吳根義，許振成，邵繼海*

(湖南農業(yè)大學資源環(huán)境學院，湖南長沙 410128)

提取牛糞堆肥中的溶解性有機物(dissolved organic matter, DOM)，并將DOM轉移至含有銅綠微囊藻FACHB905細胞的培養(yǎng)液中，DOM含量以溶解性有機碳(DOC)質量濃度進行衡量，分別控制培養(yǎng)液中DOC的終質量濃度為0、15、30、60、90、120 mg/L(分別記為CK、T1、T2、T3、T4、T5)。通過測定藻細胞密度、色素含量和藻毒素含量，研究DOM對銅綠微囊藻生理生化及產毒特性的影響。結果表明：1)FACHB905受DOM影響，在處理后第2天，各DOM處理的細胞密度與CK相比均有所增加，T4處理的細胞密度(5.97×106個/mL)最大，比CK增加了21.67%，處理后第4天，T1、T2、T3處理均能夠促進細胞生長，T2處理的細胞密度(9.23×106個/mL)最大，比CK增加了15.27%，而T4、T5處理抑制細胞生長，處理后第6天，僅T1及T2處理能夠促進細胞生長，T1處理的細胞密度(13.34×106個/mL)最大，比CK增加了10.35%，而T3、T4、T5處理抑制細胞生長；2)堆肥來源DOM能夠抑制藻毒素的合成，單位細胞藻毒素Microcystin–LR含量在處理后第2天T5處理的最低，比CK下降了53.13%，而Dha7–Microcystin–LR含量在處理后第4天T5處理的最低，與CK比較下降了78.51%；3)各DOM處理對單位細胞內Chl–和Carotenoid的合成沒明顯影響。

牛糞堆肥；溶解性有機物(DOM)；銅綠微囊藻；藻細胞密度；藻毒素

近年來，農業(yè)面源污染已超過工業(yè)生產污染。農業(yè)生產所造成的環(huán)境問題日益突出[1–2]。隨著中國農業(yè)產業(yè)結構的調整和新型畜禽養(yǎng)殖模式的構建，規(guī)?；B(yǎng)殖技術水平得以提升，大量畜禽糞便隨之產生。這些糞便如果不經處理就難以被周邊土地消納。畜禽糞便隨意堆放已對大氣環(huán)境、水質安全和土壤微生物多樣性造成了嚴重影響[3–4]。

糞便高溫堆肥與利用是農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要組成部分，也是目前世界上實現畜禽糞便資源化最常見和最有效的方法之一[5]。畜禽糞便和糞便堆肥中豐富的N、P等營養(yǎng)元素及溶解性有機物質(dissolved organic matter, DOM)可隨灌溉排水、降水等向自然水體、湖泊遷移，水體富營養(yǎng)化和其他水質方面的問題隨之出現。目前，有關堆肥的研究主要是針對N、P、K等營養(yǎng)元素含量以及不同C/N調控對農作物生長的影響等[6–9]，而針對堆肥來源DOM 對水生生物影響的研究尚少。藍藻水華優(yōu)勢種FACHB905屬于藍藻門(Cyanophyta)微囊藻屬()。筆者對牛糞堆肥中DOM進行提取，以1株FACHB905為受試對象，對堆肥中DOM作用于藍藻細胞的生理生化和產毒特性進行研究。現將結果報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

牛糞堆肥采自湖南畜牧獸醫(yī)研究所內的有機肥廠。試驗菌株FACHB905由中科院水生生物研究所(武漢)提供。

1.2方法

1.2.1藻細胞的培養(yǎng)與計數

將接種于BG–11培養(yǎng)基[10]中的FACHB905置于人工氣候培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，光照度為30 μmol/( m2·s)，明暗周期比為12 h︰12 h。采用血球計數板法測定細胞密度，在顯微鏡下記錄細胞數。

1.2.2各DOM處理的設計

將風干、研磨后的堆肥肥料過2 mm篩，按1∶20()的比例將肥料(干重)和超純水混合，于(22±2)℃、200 r/min震蕩24 h，隨后以12 000、4 ℃離心20 min，收集上清液，過0.45 μm濾膜，濾液即為堆肥DOM溶液。將DOM轉移至含有銅綠微囊藻FACHB905細胞的培養(yǎng)液中，測定 DOM中溶解性有機碳 (DOC) 的質量濃度，按DOC質量濃度設置0、15、30、60、90、120 mg/L共6個處理(分別記為CK、T1、T2、T3、T4、T5)。DOC濃度采用Vario TOC select儀器測定。

1.2.3藻細胞中色素濃度的測定

FACHB905細胞內葉綠素(Chl–)、類胡蘿卜素(Carotenoid)濃度采用紫外可見分光光度計測定[11]。取4 mL藻液于10 mL離心管中，在10 000、4 ℃條件下離心10 min，棄上清液，加入4 mL 80%的丙酮，于4 ℃靜置24 h，在此期間不定時取出待測試樣，手動搖勻。24 h后取出待測樣品，離心，收集上清液，用紫外可見分光光度計測定663、645、470 nm處的吸光度值。Chl–、Carotenoid濃度分別參照文獻[12]中方法進行計算。

1.2.4藻細胞內毒素含量的測定

細胞內藻毒素的提取與檢測參照文獻[13]中方法進行改良。取適量藻液于10 000、4 ℃離心10 min，棄上清。各樣品中加入1.5 mL 80%甲醇溶液，超聲5 min，搖床震蕩1 h。收集甲醇溶液過0.45 μm濾膜，采用高效液相色譜(HPLC)進行檢測。HPLC(Angilent 1200 series，美國)配有C18柱(Hypersil GOLD，250 mm × 4.6 mm，5 μm)和紫外檢測器(G1314B)，檢測波長為238 nm，柱溫35 ℃，流動相為甲醇(A)和水(0.05% TFA，B)，A、B體積比為45∶55，流速為1 mL/min。線性梯度洗脫程序為0～20 min，A、B體積比為45∶55至90∶10；＞20～21 min，A、B體積比為90∶10至45∶55；＞21～25 min，A、B體積比為45∶55。

2　結果與分析

2.1DOM對藻細胞生長的影響

由圖1可知，處理第2天，各DOM處理的細胞密度均比CK的大，其中T4處理的最大，為5.97×106個/mL，比CK高21.67%；處理第4天，T1、T2、T3處理的細胞密度均比CK的大，其中T2處理細胞的密度最大(9.23×106個/mL)，比CK的高15.27%，而T4、T5處理的細胞密度均比CK的??；處理第6天，僅T1、T2處理的細胞密度比CK的大，其中，T1處理的細胞密度最大(13.34×106個/mL)，比CK的高10.35%，而T3、T4、T5處理的細胞密度均比CK的小，T5處理的細胞密度最小，為6.91×106個/mL，比CK的低42.79%。可見，短期內(2 d)各DOM處理均可促進細胞生長，而隨時間推移，僅低濃度DOM處理(T1、T2處理)可促進細胞生長，高濃度DOM處理(T3、T4、T5處理)抑制細胞生長。

圖1　不同處理時間各處理細胞的密度

2.2DOM對藻細胞色素合成的影響

Chl–和Carotenoid是FACHB905細胞內重要的色素組成成分。由圖2、圖3可知，DOM對FACHB905單位細胞中Chl–、Carotenoid合成的影響不明顯。處理第2天，T4、T5處理中雖然單位細胞的Chl–含量與CK相比略有降低，但在處理后第4、第6天，T4、T5處理Chl–含量比CK的高。處理后第2天和第4天，各處理Carotenoid的含量沒有明顯變化；處理后第6天，除T3處理的數值較低外，其他處理的Carotenoid含量與CK基本相當。

圖2　不同處理時間各處理每1萬個細胞中含Chl–a的量

圖3　不同處理時間各處理每1萬個細胞中含Carotenoid的量

2.3DOM對藻毒素合成的影響

由圖4可知，處理后第2天，各處理每1萬個細胞內含藻毒素MC–LR的量均比CK的低，T5處理的最低(0.15 ng)，比CK(0.32 ng)下降了53.13%；在處理后第4天，T2、 T3、 T4、T5處理對MC–LR合成的抑制作用加強，MC–LR含量幾乎維持在試驗初期(處理后第2天)的最低含量；處理后第6天，T3處理的MC–LR含量最低，僅為0.17 ng，比CK下降了56.41%。由圖5可知，單位細胞內Dha7–MC– LR含量變化受DOM影響下降明顯；處理后第2天的T4處理Dha7–MC–LR含量最低，比CK 下降了62.18%；處理后第4和第6天，T5處理的Dha7–MC–LR含量最低，比CK 分別下降了78.51%和69.11%?？梢?，牛糞堆肥DOM對于FACHB905細胞內2種藻毒素合成的抑制作用明顯。

圖4　不同處理時間各處理每1萬個細胞中含MC–LR的量

圖5　不同處理時間各處理每1萬個細胞中含Dha7–MC–LR的量

3　結論與討論

堆肥DOM的主要成分為木質素類化合物、含N雜環(huán)類化合物、脂肪酸類物質、蛋白質和其他有機酸類物質[14–15]，其中含N化合物和其他有機酸類物質(如碳水化合物、氨基酸等)均有助于藍藻細胞的生長[16–18]。隨著DOM濃度的升高和處理時間的延長，DOM中木質素類化合物對于藍藻細胞生長的抑制作用明顯[19]。本研究中，處理后第4天和第6天，高濃度DOM處理(T4、T5處理) 使培養(yǎng)液中FACHB905細胞密度下降。

牛糞堆肥來源DOM 對FACHB905細胞內Chl–a和Carotenoid合成的影響不大[20]。藍藻細胞內Chl–a與Carotenoid的合成途徑非常復雜，受到Mg、Cu、Zn、Ni、Mn等多種微量金屬元素的影響[21–22]，而DOM對該類金屬的遷移轉化影響明顯[23]。本研究中雖然沒有對培養(yǎng)液中金屬離子含量、形態(tài)等進行測定，但各DOM處理FACHB905細胞內Chl–a和Carotenoid含量與CK差異不明顯，推測DOM對培養(yǎng)液中金屬離子的調控對藍藻細胞內色素的合成具有重要作用。

牛糞堆肥來源DOM能夠抑制FACHB905單位細胞內藻毒素的合成。隨處理時間的延長，T2、T3、T4、T5處理可明顯抑制單位細胞內MC–LR的合成，其含量與試驗初期(處理2 d)的最低含量無明顯變化。DOM處理對Dha7–MC– LR合成的抑制作用明顯。藻毒素合成受Mcy基因家族的控制，且合成路徑極為復雜[24]，而堆肥來源DOM可能對其代謝途徑和相關控制基因造成破壞，進而抑制細胞內MC–LR和Dha7–MC–LR的合成。

由本試驗結果及其分析可得到如下結論：當牛糞堆肥來源DOM中DOC的質量濃度為15～120 mg/L時，處理后第2天，各DOM處理均促進FACHB905細胞的生長，而在處理后第4天，T4、T5處理抑制細胞生長，第6天僅T1處理能夠促進細胞生長，T3、T4、T5處理抑制細胞生長的作用明顯。各DOM處理均抑制細胞內藻毒素的合成，在6 d的處理中，單位細胞藻毒素中Microcystin–LR的含量以處理后第2天T5處理的最低，比CK低53.13%；Dha7–Microcystin–LR含量以處理后第4天T5處理的最低，比CK低78.51%。DOM對細胞內色素合成無明顯影響。畜禽糞便污染是農業(yè)面源污染的主要來源，所以，控制牛糞堆肥中DOM的排放和延長DOM對藻細胞處理的時間，可有效抑制藍藻細胞的生長和藍藻細胞中藻毒素的合成。

[1] 周麗娟．重慶市循環(huán)農業(yè)測度與農業(yè)面源污染負荷的關系[D]．重慶：西南大學，2008．

[2] 雷蕾，梁勤爽，陳玉成，等．模擬水田環(huán)境下畜禽糞便對氮磷釋放的影響[J]．湖南農業(yè)大學學報(自然科學版)，2011, 37(5):546-550.DOI:10.3724/SP.J.1238.2011. 00546．

[3] 張鵬飛．基于畜禽糞便不同處理方式的農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)能值分析[D]．鄭州：河南農業(yè)大學，2015．

[4] 曾鵬宇，但浩，王昌全，等．施用豬糞對稻麥產量和土壤磷素積累與淋失的影響[J]．湖南農業(yè)大學學報(自然科學版)，2016，42(2):202-207. DOI:10.13331/j. cnki.jhau.2016.02.018．

[5] 易境．豬場廢棄物堆肥中芽孢桿菌屬和梭菌屬細菌的分子生態(tài)學研究[D]．武漢：華中農業(yè)大學，2013．

[6] 楊雪，連賓，朱曉玲，等．添加鉀礦粉對雞糞堆肥中N、P、K含量的影響[J]．地球與環(huán)境，2012，40(2)：286–292．DOI:10.14050/j.cnki.1672–9250.2012.02.018．

[7] 張建華，田光明，姚靜華，等．不同調理劑對豬糞好氧堆肥效果的影響[J]．水土保持學報，2012，26(3)：131–135．DOI:10.13870/j.cnki.stbcxb.2012.03.025．

[8] 徐路魏．蔬菜廢棄物堆肥化過程中碳氮轉化規(guī)律[D]．楊凌：西北農林科技大學，2016．

[9] 宋小林，劉強，榮湘民，等．豬糞堆肥與化肥配施對水稻產量及氮素利用率的影響[J]. 湖南農業(yè)大學學報(自然科學版)，2011，37(4):440-445. DOI:10.3724/SP.J. 1238.2011.00440．

[10] RIPPKA R，DERUELLES J，WATERBURY J B，et al. Generic assignments，strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria[J]．Microbiology，1979，111(1)：1–61．DOI:10.1099/00221287–111–1–1．

[11] SHAO J，HE Y，CHEN A，et al．Interactive effects of algicidal efficiency ofsp．B50 and bacterial community on susceptibility ofwith different growth rates[J]．International Biodeteriora- tion & Biodegradation，2015，97：1–6．DOI:10.1016/j. ibiod.2014.10.013．

[12] 李合生．植物生理生化實驗原理和技術[M]．北京：高等教育出版社，2000：135．

[13] SHAO J，WU X，LI R．Physiological responses ofPCC7806 to nonanoic acid stress[J]．Environmental Toxicology，2009，24(6)：610–617．DOI:10.1002/tox.20462．

[14] AMIR S，LEMEE M H，MERLINA G，et al．Structural characterization of humic acids，extracted from sewage sludge during composting，by thermochemolysis–gas chromatography–mass spectrometry[J]．Process Bioche- mistry，2006，41(2)：410–422．DOI:10.1016/j.procbio. 2005.07.005．

[15] KILLOPS S D，KILLOPS V J．Introduction to organic geochemistry[M]．London：Blackwell Publishing，2005．

[16] 葉琳琳，張民，孔繁翔，等．水生生態(tài)系統(tǒng)藍藻固氮作用研究進展與展望[J]．湖泊科學，2014，26(1)：9–18．

[17] 王玉萍，袁憲正，師曉爽，等．碳源對銅綠微囊藻生理特性及微囊藻毒素產率的影響[J]．環(huán)境工程學報，2014，8(7)：2714–2718．

[18] DAI R，LIU H，QU J，et al．Effects of amino acids on microcystin production of the[J]. Journal of Hazardous Materials，2009，161(2)：730–736. DOI:10.1016/j.jhazmat.2008.04.015．

[19] PILLINGER J，COOPER J，RIDGE I．Role of phenolic compounds in the antialgal activity of barley straw[J]. Journal of Chemical Ecology，1994，20(7)：1557– 1569．DOI:10.1007/BF02059880．

[20] ROSSINI–OLIVA S，MINGORANCE M，PE A A．Effect of two different composts on soil quality and on the growth of various plant species in a polymetallic acidic mine soil[J]．Chemosphere，2017，168：183–190.DOI: 10.1016/j.chemosphere.2016.10.040．

[21] KüPPER H，?ETLíK I，SPILLER M，et al．Heavy metal–induced inhibition of photosynthesis：targets of in vivo heavy metal chlorophyll formation[J]．Journal of Phycology，2002，38(3)：429–441．DOI:10.1046/j.1529– 8817.2002.01148.x．

[22] 史典義，劉忠香，金危危．植物葉綠素合成、分解代謝及信號調控[J]．遺傳，2009，31(7)：698–704．DOI:10. 3724/SP.J.1005.2009.00698．

[23] ZHANG M，ZHANG H．Co–transport of dissolved organic matter and heavy metals in soils induced by excessive phosphorus applications[J]．Journal of Environmental Sciences，2010，22(4)：598–606．DOI:10. 1016/S1001–0742(09)60151–0．

[24] 譚嘯峰．銅綠微囊藻中微囊藻毒素合成蛋白的結構研究[D]．北京：中國科學技術大學，2014．

責任編輯：王賽群

英文編輯：王庫

Effects of DOM in compost of cattle’s manure on the physiological and toxin–producing characteristics ofFACHB905

LIN Yiqing，WU Genyi，XU Zhencheng，SHAO Jihai*

(College of Resources and Environment, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Dissolved organic matter (DOM)originated from compost of cattle manure had been extracted and added toFACHB905 to study its effects on the physiological and toxin–producing characteristics via the determination of cell growth, pigments content and algal toxins content. The concentration of DOM was evaluated by using dissolved organic carbon (DOC). The final concentrations of DOC designed for cultural medium, marked as CK, T1, T2, T3, T4 and T5, were 0, 15, 30, 60, 90 and 120 mg/L, respectively.The results showed that: 1)Cell density influenced by DOM increased in treatments T1 to T5 at day 2; The maximum growth rate occurred in treatment T4 (5.97×106cells/mL) at day 2, with a 21.67% increase than that of CK. DOM could increase cell growth in treatments T1 to T3 but inhibit cell density in treatments T4 and T5 at day 4, the maximum growth rate occurred in treatment T2 (9.23×106cells/mL) with a 15.27% increase than that of CK. DOM could only promote the cell growth in treatments T1 and T2, but inhibit cell density in treatments T3 to T5 at day 6, the maximum growth rate occurred in treatment T1 (13.34×106cells/mL) with a 10.35% increase than that of CK. 2)Compost source of DOM inhibited the synthesis of algal toxins, the lowest content of Microcystin–LR in cells was occurred in treatment T5 at day 2, with a 53.13% decrease than that of CK. The lowest content of Dha7–Microcystin–LR in cells was occurred in treatment T5 at day 4, with a 78.51% decrease than that of CK. 3)There was no significant effect among DOM treatments on the synthesis of Chl–or carotenoid in cells.

compost of cattle manure; dissolved organic matter (DOM);FACHB; cell density; microcystins

10.13331/j.cnki.jhau.2017.03.017

X713

A

1007-1032(2017)03-0315-05

2017–04–16

2017–05–08

科技部水專項(2014ZX07206001–03)

林毅青(1988—)，男，博士研究生，湖南長沙人，主要從事環(huán)境微生物研究，48993656@qq.com；

，邵繼海，博士，副教授，主要從事環(huán)境微生物研究，shao@hunau.net

投稿網址：http://xb.hunau.edu.cn