基于MiSeq分析川中黑山羊瘤胃細(xì)菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)

陳蕓，劉旗，鄧俊良*，任志華，楊顏銥，高爽

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基于MiSeq分析川中黑山羊瘤胃細(xì)菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)

陳蕓1,2，劉旗1,2，鄧俊良1,2*，任志華1,3，楊顏銥1,2，高爽1,2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川成都 611130；2.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611130；3.環(huán)境公害與動(dòng)物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611130)

采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析川中黑山羊瘤胃細(xì)菌的多樣性及菌群結(jié)構(gòu)。選用3只140日齡健康公羊，其平均體質(zhì)量為(15.53±0.21) kg，飼喂10 d后，于150日齡時(shí)采集瘤胃液(樣品A)，40 d后再次采集瘤胃液(樣品F)，提取瘤胃液細(xì)菌基因組DNA，對(duì)細(xì)菌16S rDNA序列V4區(qū)進(jìn)行MiSeq測(cè)序。結(jié)果顯示：1)從樣品A與樣品F中共獲得高質(zhì)量序列338 830條，聚類后得3 400個(gè)運(yùn)算分類單位(OTU)；2)樣品A的α多樣性指數(shù)高于樣品F的，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3)門水平上，樣品A最高相對(duì)豐度為擬桿菌門的(占總序列數(shù)的40.87%)，其次為厚壁菌門的(27.19%)，樣品F最高相對(duì)豐度為擬桿菌門的(47.12%)，其次為變形菌門的(19.99%)，再次為厚壁菌門的(18.05%)，樣品A厚壁菌門的相對(duì)豐度極顯著高于樣品F的(＜0.01)；4)在屬水平上，樣品A與樣品F的最高相對(duì)豐度均為普雷沃氏菌屬的(樣品A的為25.54%，樣品F的為27.67%)，樣品A中月形單胞菌屬、丁酸弧菌屬、瘤胃球菌屬、琥珀酸弧菌屬、琥珀酸菌屬等的相對(duì)豐度顯著高于樣品F的(＜0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，川中黑山羊瘤胃中相對(duì)豐度最高的菌門為擬桿菌門，相對(duì)豐度最高的菌屬為普雷沃氏菌屬，且兩瘤胃樣品中部分細(xì)菌相對(duì)豐度間的差異顯著。

川中黑山羊；瘤胃細(xì)菌；多樣性；群落結(jié)構(gòu)；MiSeq測(cè)序；擬桿菌門；普雷沃氏菌屬

反芻動(dòng)物的瘤胃內(nèi)棲居著大量的微生物，主要包括古細(xì)菌、細(xì)菌、原蟲和真菌，還有少量噬菌體[1]，它們?cè)诜雌c動(dòng)物的飼料消化和營(yíng)養(yǎng)代謝中發(fā)揮重要作用，如將難消化的植物纖維轉(zhuǎn)換為揮發(fā)性脂肪酸、維生素、微生物蛋白等，滿足宿主的營(yíng)養(yǎng)需求[2]。瘤胃內(nèi)細(xì)菌含量可達(dá)到微生物總量的95%[3]，是瘤胃微生物中最主要的功能類群[4]，與宿主的營(yíng)養(yǎng)狀況有直接聯(lián)系。川中黑山羊是四川中部地區(qū)皮肉兼用的地方山羊，主要分布在四川省金堂縣、樂至縣等，其肉用性能優(yōu)良，母羊繁殖能力強(qiáng)[5]，具有生長(zhǎng)快、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性良好等優(yōu)點(diǎn)[6–7]，是中國(guó)現(xiàn)階段大力發(fā)展的優(yōu)質(zhì)肉用品種[8]。川中黑山羊1～6月齡時(shí)生長(zhǎng)發(fā)育極快[9]，適合于生產(chǎn)肥羔[10]。微生物的多樣性和菌群結(jié)構(gòu)與反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)有直接聯(lián)系，但關(guān)于川中黑山羊瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)的研究尚少。筆者采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)研究150、190 d(6月齡前后)川中黑山羊的瘤胃微生物多樣性和菌群結(jié)構(gòu)，探索瘤胃細(xì)菌與川中黑山羊生長(zhǎng)性能的關(guān)系，旨在為川中黑山羊的臨床飼養(yǎng)管理及營(yíng)養(yǎng)研究提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

選取140日齡、體重約(15.53±0.21)kg的健康雄性(未閹割)川中黑山羊6只，單欄飼喂，混合精料量按體重的2%供給，粗料為新鮮青草，每天08:00和17:00飼喂(飼喂精料后給足青草)，全天自由飲水。羊舍溫度20 ℃。

1.2樣品采集及基因組DNA的提取

飼喂10 d后，隨機(jī)選取3只，晨飼前以真空泵胃管抽吸法[8]采集瘤胃液(100 mL/只)，并將其標(biāo)記為樣品A(150日齡)；此后40 d再次采集瘤胃液，并將其標(biāo)記為樣品F (190日齡)。將采集的瘤胃液充分混合均勻后用孔徑0.15 mm的 4層滅菌紗布過(guò)濾，分裝在5 mL 離心管中，迅速置于－70 ℃冰箱中保存。

于每個(gè)樣品各取2 mL 瘤胃液，經(jīng)1 000 r/min離心5 min后，取上清液，按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技公司)說(shuō)明提取DNA，采用微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2 000)測(cè)定DNA濃度及純度，并采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。提取的總基因組DNA于－20 ℃保存，備用。

1.316S rDNA基因的擴(kuò)增及MiSeq測(cè)序

細(xì)菌基因組文庫(kù)構(gòu)建及上機(jī)測(cè)序均由上海派森諾科技有限公司完成。以總DNA為模板，對(duì)細(xì)菌16S rRNA V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立DNA文庫(kù)，所采用的細(xì)菌通用引物為520F(5–GCACCTAAYT GGGYDTAAAGNG–3)和802R(5–TACNVGGGTA TCTAATCC–3)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，用Axygen膠回收純化試劑盒(AxyPrep DNA Gel Extration Kit，APGX–500)回收V4區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量和質(zhì)量控制，采用Illumina的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit構(gòu)建Illumina測(cè)序文庫(kù)，合格的文庫(kù)采用MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)進(jìn)行2×300 bp的雙端測(cè)序。

1.4數(shù)據(jù)分析

測(cè)序原始數(shù)據(jù)以FASTQ格式保存。首先用FLASH軟件(V1.2.7)篩選雙端序列，除去錯(cuò)配堿基，獲得每個(gè)樣品的有效序列，再用QIIME軟件識(shí)別疑問序列(＜150 bp或 5端引物錯(cuò)配堿基數(shù)>1的序列)。隨后，通過(guò)QIIME軟件(V1.8.0)檢查并剔除嵌合體序列，獲得每個(gè)樣品的高質(zhì)量序列。用QIIME軟件對(duì)高質(zhì)量序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分，選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列，并將OUT代表序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)(Release 13.8，http://greengenes. secondgenome.com/)的模板序列進(jìn)行比對(duì)，獲取每個(gè)OTU所對(duì)應(yīng)的分類學(xué)信息。用QIIME軟件繪制序列數(shù)及對(duì)應(yīng)OTU數(shù)的稀疏曲線，并分別計(jì)算每個(gè)樣本的α多樣性指數(shù)(包括Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannom指數(shù))，并獲得每個(gè)樣本在各分類水平的組成。用R軟件對(duì)屬水平的群落組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行PCA分析。采用SPSS Statistics 20統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)A樣品與F樣品菌群的相對(duì)豐度進(jìn)行配對(duì)樣本檢驗(yàn)，以＜0.05作為差異顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果與分析

2.1OTU聚類分析和Alpha多樣性分析結(jié)果

通過(guò)Illumina Miseq高通量測(cè)序后，6個(gè)瘤胃液樣品共獲得有效序列373 177條，經(jīng)質(zhì)量控制后獲得高質(zhì)量序列338 830條，平均每個(gè)樣品56 471條，序列平均長(zhǎng)度為225 bp。高質(zhì)量序列按97%相似性歸并后，分別獲得樣品A和樣品F的OTU數(shù)為1 831、1 569，2個(gè)樣品共享OTU數(shù)為1 311個(gè)，共享OUT數(shù)分別占樣品A、樣品F的71.6%、83.55%，表明2組樣品中含有大量相同種類的細(xì)菌，且樣品A中所獲得的OTU數(shù)高于樣品F的。

細(xì)菌Alpha多樣性用于反映單個(gè)樣品內(nèi)部的物種豐富度和均勻度，其中，Chao指數(shù)和ACE指數(shù)側(cè)重反映樣品中物種的豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)側(cè)重反映群落的均勻度。與樣品F相比，樣品A的豐富度指數(shù)(Chao指數(shù)和Ace指數(shù))稍高，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05 )；二者多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù))的差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。樣品A和樣品F的文庫(kù)覆蓋率均在99%以上，表明本試驗(yàn)的測(cè)序量可以覆蓋各樣品大多數(shù)微生物，代表了樣品的真實(shí)情況，能較好地反映瘤胃液中細(xì)菌群落種類和結(jié)構(gòu)的多樣性。

表1　Alpha多樣性指數(shù)(n=3)

2.2組間的相似性分析

由基于UniFrac的加權(quán)主坐標(biāo)分析(PCoA)結(jié)果(圖1)可見，第1主成分的貢獻(xiàn)率為33.38%，第2主成分的貢獻(xiàn)率為24.90%，第1主成分明顯地將樣品分成了2部分，樣品A分布在圖的左邊，樣品F分布在圖的右邊，表明樣品A和樣品F瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異性。

圖1　瘤胃液樣品菌群結(jié)構(gòu)Unifrac的加權(quán)主坐標(biāo)分析結(jié)果

2.3門水平及屬水平上的菌群結(jié)構(gòu)

從樣品A和樣品F中均鑒定出24個(gè)細(xì)菌門類。各樣品門水平上的菌落組成見圖2(相對(duì)豐度大于0.1%)，兩樣品的菌群主要來(lái)自擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)、無(wú)壁菌門(Tenericutes)、螺旋體門(Spirochaetes)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、TM7、綠彎菌門(Chloroflexi)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、護(hù)養(yǎng)菌門(Synergistetes)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)和SR1；衣原體門(Chlamydiae)、梭桿菌門(Fusobacteria)、廣古菌門(Euryarchaeota)、酸桿菌門(Acidobacteria)等相對(duì)豐度低于0.1%的菌門在圖2中未列出。樣品A中的最優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門，其相對(duì)豐度為40.87%；其次為厚壁菌門，其相對(duì)豐度為27.19%。樣品F中的最優(yōu)勢(shì)菌門也為擬桿菌門，其相對(duì)豐度為47.12%；其次為變形菌門(19.99%)，再次為厚壁菌門(18.05%)，并且樣品A中厚壁菌門的相對(duì)豐度顯著高于樣品F的(＜0.01)。樣品A與樣品F相對(duì)豐度間存在顯著差異的其他菌門見表2。

圖2　瘤胃液中相對(duì)豐度較高的15個(gè)菌門

表2　兩樣品中相對(duì)豐度差異顯著或極顯著的菌門(n=3)

數(shù)據(jù)后大寫字母示在0.01水平差異顯著；數(shù)據(jù)后小寫字母示在0.05水平差異顯著。

樣品A和樣品F中均鑒定出86個(gè)細(xì)菌菌屬。兩樣品中相對(duì)豐度較高的有25個(gè)已知菌屬(圖3)，其中相對(duì)豐度最高的菌屬為普雷沃氏菌屬(樣品A為25.53%，樣品F為27.67%)，其次是琥珀酸弧菌屬(樣品A為7.56%，樣品F為3.99%，＜0.05)，其余菌屬的相對(duì)含量均較低，如月形單胞菌屬 () 、丁酸弧菌屬 ()。樣品A與樣品F間相對(duì)豐度差異顯著(＜0.05)的菌屬共有9個(gè)，差異極顯著(＜0.01)的菌屬共2個(gè)(表3)。樣品A和樣品F中均發(fā)現(xiàn)了大量未分類菌屬。這些未分類菌屬占總細(xì)菌含量的42.15%～47.71%。

圖3　瘤胃液中相對(duì)豐度較高的25個(gè)菌屬

表3　兩樣品中相對(duì)豐度差異顯著或極顯著的菌屬(n=3)

3　討論與結(jié)論

反芻動(dòng)物瘤胃微生物群落對(duì)宿主的健康發(fā)揮重要作用，其結(jié)構(gòu)與組成常被用于評(píng)估宿主的健康狀況[11]。本研究中150 日齡川中黑山羊瘤胃中細(xì)菌的多樣性高于190日齡的，但二者的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能是組內(nèi)方差過(guò)大。

本研究中，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門為川中黑山羊瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌門。該結(jié)果與反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌門研究結(jié)果[12–14]一致，這3種菌門在植物纖維降解過(guò)程中起重要作用[15]。本試驗(yàn)中川中黑山羊瘤胃細(xì)菌相對(duì)豐度最高的為擬桿菌門(樣品A為40.87%，樣品F為47.12%)，但綿羊瘤胃內(nèi)相對(duì)豐度最高的為厚壁菌門(44.37%)[16]，蒙古羊瘤胃相對(duì)豐度最高的為擬桿菌門(67%)[17]，表明不同品種羊瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相對(duì)豐度存在一定的差異。

川中黑山羊瘤胃中細(xì)菌的最優(yōu)勢(shì)菌屬為普雷沃氏屬，這與針對(duì)其他品種山羊及其他反芻動(dòng)物進(jìn)行研究的結(jié)果[18]一致，這可能與普雷沃氏菌屬具有多重功能及多種基因型[19]有關(guān)。普雷沃氏菌屬中布氏普雷沃氏菌、普雷沃氏短桿菌和棲瘤胃普雷沃氏菌等均具有蛋白酶活性和纖維素酶基因[20]，日糧中添加淀粉會(huì)使普雷沃氏菌豐度升高[21](主要由于普雷沃氏菌屬產(chǎn)生大量復(fù)合酶[22]加速了淀粉的降解)。

本研究中150 日齡川中黑山羊瘤胃中厚壁菌門細(xì)菌的含量極顯著高于190 日齡的(＜0.01)，這與文獻(xiàn)[23]的研究結(jié)果相似。韓旭峰[23]發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門細(xì)菌的相對(duì)豐度與日齡呈正相關(guān)，而厚壁菌門和互養(yǎng)菌門細(xì)菌的相對(duì)豐度隨日齡的增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。本研究中，150 日齡川中黑山羊瘤胃中厚壁菌門月形單胞菌屬、丁酸弧菌屬、琥珀酸菌屬的相對(duì)豐度顯著高于190 日齡的。該結(jié)果與文獻(xiàn)[23]的結(jié)果一致。150 日齡川中黑山羊瘤胃中變形菌門琥珀酸弧菌屬細(xì)菌的相對(duì)豐度極顯著高于190日齡的(＜0.01)，說(shuō)明二者的主要差異來(lái)自于厚壁菌門和變形菌門。胃腸道內(nèi)厚壁菌門的相對(duì)含量與機(jī)體的肥胖成正相關(guān)。該菌門相對(duì)豐度的增加與機(jī)體對(duì)能量的攝入呈正相關(guān)[24]，且厚壁菌門中丁酸弧菌屬、琥珀酸菌屬細(xì)菌為瘤胃內(nèi)重要的纖維降解菌，變形菌門中琥珀酸弧菌屬細(xì)菌為半纖維素降解菌[25]。由此可推測(cè)，這幾種功能菌相對(duì)豐度的降低可能會(huì)降低瘤胃對(duì)植物纖維的分解代謝，從而影響瘤胃的消化功能及宿主生長(zhǎng)性能[26]。1～6月齡川中黑山羊的平均生長(zhǎng)速率大于6月齡以上黑山羊的[10]，可見，厚壁菌門相對(duì)豐度降低是6月齡以上川中黑山羊生長(zhǎng)減緩的主要原因。

綜上所述，川中黑山羊瘤胃細(xì)菌多樣性隨日齡增長(zhǎng)有所降低，但150日齡的與190日齡的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；瘤胃細(xì)菌相對(duì)豐度最高的菌門為擬桿菌門，相對(duì)豐度最高的菌屬為普雷沃氏菌屬；厚壁菌門相對(duì)豐度的降低與川中黑山羊生長(zhǎng)速率有一定的相關(guān)性。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王庫(kù)

Analysis the bacterial diversity in rumen and their community structure from Chuanzhong black goat using MiSeq sequencing technology

CHEN Yun1,2，LIU Qi1,2，DENG Junliang1,2*，REN Zhihua1,3，YANG Yanyi1,2，GAO Shuang1,2

(1.College of Veterinary Medicine, Sichuan Agriculture University, Chengdu 611130,China; 2.Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, Chengdu 611130,China; 3.Key Laboratory of Environmental Hazards and Animal Diseases of Sichuan Province Colleges and Universities, Chengdu 611130,China)

The study was designed to reveal the bacterial diversity in rumen and their community structure from Chuanzhong black goatusing MiSeq sequencing technology. Three140–day–old and weight of (15.53±0.21)kg Chuanzhong black goats were selected for collecting rumen liquid after normal feeding of 10 d (sample A),after 40 d ,the rumen fluid was collected again(sample F), respectively. Total DNA were extracted for amplifying V4 area in 16S rDNA, and their products were sequenced by Illumina MiSeq sequencing system. The results showed that: 1) A total of 338 830 high quality valid sequences from the sample A and the sample F, 3 400 operational taxonomic units were obtained. 2) The alpha diversity index of sample A was higher than that of sample F, however, their difference did not reach to statistical significance level. 3) At phylum level, the most abundant phylum in sample A was Bacteroidetes (accounted for 40.87% of the total sequences), followed by Firmicutes (it accounted for 27.19% of the total); the most abundant phylum in sample F was Bacteroidetes (accounted for 47.12% of the total sequences) followed by Proteobacteria(it accounted for 19.99% of the total), and Firmicutes(it accounted for 18.05% of the total); the relative abundance of Firmicutes in sample A was very significantly higher than that in sample F (＜0.01). 4) At genus level, the most abundant genera was(sample A was 25.54%, sample F was 27.67%); the relative abundance of,,,andin sample A was significantly higher than that in sample F (＜0.05). In conclusion,was the most abundant phylum in the rumen bacterial community of Chuanzhong black goats, andwas the most abundant genus; there were significant difference between sample A and sample F.

Chuanzhong black goat; rumen bacteria; diversity; community structure; MiSeq sequencing;Bacteroidetes;

10.13331/j.cnki.jhau.2017.03.012

S826.8

A

1007-1032(2017)03-0286-06

2017–01–26

2017–04–08

“長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目( IRT0848)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)“雙支”計(jì)劃項(xiàng)目(03572070)

陳蕓(1992—)，女，云南昭通人，碩士研究生，主要從事反芻動(dòng)物消化道微生物研究，609835279@qq.com；

，鄧俊良，博士，教授，主要從事營(yíng)養(yǎng)代謝病及中毒病研究，dengjl213@126. com

投稿網(wǎng)址：http://xb.hunau.edu.cn