赤眼鱒Toll樣受體9基因的cDNA全長(zhǎng)克隆及表達(dá)特性分析

金生振，王榮華，周智愚，劉巧林,2，彭慧珍,2，肖調(diào)義,2*

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赤眼鱒Toll樣受體9基因的cDNA全長(zhǎng)克隆及表達(dá)特性分析

金生振1，王榮華1，周智愚1，劉巧林1,2，彭慧珍1,2，肖調(diào)義1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410128；2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德415000)

為探究赤眼鱒()Toll樣受體9基因(toll–like receptor 9,)的結(jié)構(gòu)特性及其參與免疫應(yīng)答草魚(yú)呼腸弧病毒(grass carp reovirus, GCRV)感染時(shí)的表達(dá)特性，采用RACE技術(shù)克隆Sc基因cDNA全長(zhǎng)序列，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)比較分析免疫應(yīng)答GCRV的表達(dá)特性。結(jié)果顯示：的cDNA全長(zhǎng)為3 687 bp，編碼1 059個(gè)氨基酸，有17個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine rich repeats, LRRs)結(jié)構(gòu)域。在被檢測(cè)的9個(gè)組織中均有表達(dá)，在中腎和頭腎中的表達(dá)量最高；感染GCRV后，基因在赤眼鱒和草魚(yú)頭腎中的表達(dá)量均上調(diào)，在赤眼鱒頭腎中的表達(dá)量于感染后12 h達(dá)到峰值，推測(cè)參與了赤眼鱒抗GCRV的免疫應(yīng)答，且在抗GCRV入侵免疫反應(yīng)中赤眼鱒較草魚(yú)的免疫應(yīng)答更為迅速。

赤眼鱒；Toll樣受體9基因；草魚(yú)呼腸弧病毒；草魚(yú)

魚(yú)類(lèi)Toll樣受體(toll–like receptors, TLRs)通過(guò)識(shí)別病原微生物保守的病原相關(guān)分子和調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答的模式來(lái)識(shí)別受體家族(pattern recognition receptors, PRRs)[1–2]。TLRs家族已有多個(gè)不同類(lèi)型的基因在多種脊椎動(dòng)物中被鑒別，在硬骨魚(yú)中已發(fā)現(xiàn)了至少26種TLRs基因[3–4]。最先于小鼠巨噬細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[5]，是先天免疫反應(yīng)中主要的DNA識(shí)別受體，能特異性識(shí)別細(xì)菌或病毒中未甲基化的胞嘧啶–鳥(niǎo)嘌呤核苷酸(CpG)，能促進(jìn)炎性細(xì)胞因子分泌，最終有效控制細(xì)菌或病毒感染[6–7]。屬于典型的I型跨膜蛋白，包括富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine rich repeats, LRRs)結(jié)構(gòu)域的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和Toll/白介素–1受體(Toll–IL–1R, TIR)結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)區(qū)，其傳導(dǎo)的信號(hào)通路主要由髓樣分化因子88 (myeloid differentiation factor 88,88)介導(dǎo)[7]。目前，已在草魚(yú)()、鯉魚(yú)()、鯽()、半滑舌鰨()、大黃魚(yú)()和虹鱒()等魚(yú)類(lèi)中被克隆和鑒定[8–13]。

赤眼鱒()與草魚(yú)同屬雅羅魚(yú)亞科，屬赤眼鱒屬[14]。赤眼鱒被草魚(yú)呼腸弧病毒(grass carp reovirus, GCRV)感染時(shí)比草魚(yú)具有更高的成活率[14–16]。在相關(guān)抗性分子研究中已獲得了赤眼鱒、、和基因參與赤眼鱒免疫應(yīng)答GCRV感染時(shí)發(fā)揮重要作用的結(jié)果[17–20]。筆者克隆赤眼鱒基因()的cDNA全長(zhǎng)序列，研究其結(jié)構(gòu)特性和表達(dá)特性，并比較感染GCRV后基因在草魚(yú)和赤眼鱒頭腎中的表達(dá)差異，以期為參與赤眼鱒抗GCRV的免疫應(yīng)答提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

6月齡的健康赤眼鱒、草魚(yú)購(gòu)于湖南瀏陽(yáng)市北盛鎮(zhèn)烏龍漁場(chǎng)(該漁場(chǎng)為湖南省省級(jí)良種場(chǎng))，為2015年5月繁育個(gè)體，其體長(zhǎng)為(9.40 ± 0.75) cm，體質(zhì)量為(13.50 ± 1.35) g 。赤眼鱒和草魚(yú)各150尾，共300尾。購(gòu)回后放養(yǎng)于80 L/箱的恒溫水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)，28 ℃養(yǎng)殖30 d。每箱放30尾。試驗(yàn)所用GCRV (106毒株，其50為1.78×107/mL)由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所研究員曾令兵惠贈(zèng)。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取及cDNA的合成

從養(yǎng)殖系統(tǒng)中隨機(jī)選取1尾健康赤眼鱒，取其頭腎組織60~80 mg，按TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (TaKaRa, China)的說(shuō)明提取總RNA。用核酸蛋白儀檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度，并用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)其完整性。以完整性好的2 μg RNA(值為1.8~2.0)為模板，按照First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, USA)的說(shuō)明與Oligo(dT)18引物合成cDNA。

1.2.2基因的cDNA全長(zhǎng)克隆

根據(jù)GeneBank中已有鯉科魚(yú)類(lèi)的序列，用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，并用引物TLR9F和TLR9R擴(kuò)增中間序列。根據(jù)獲得的中間序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增的3′ 和5′ 端特異性引物。將得到的PCR產(chǎn)物切膠回收，然后連接至pMD19–T載體，轉(zhuǎn)化后挑取陽(yáng)性克隆送武漢奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。

表1　本研究中所用的引物序列

1.2.3基因的生物信息學(xué)分析

用SeqMan 5.01對(duì)ccDNA的序列進(jìn)行拼接；用蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)Expasy分析c的氨基酸序列；通過(guò)SMART預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)域，用ClustalX 2.1對(duì)TIR結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對(duì)；用MEGA 6.0軟件中的鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4基因的組織表達(dá)特性分析

從養(yǎng)殖系統(tǒng)中隨機(jī)挑選3尾健康赤眼鱒，分別取其腦、鰓、肝胰臟、脾臟、中腎、頭腎、鰭條、心臟、腸等9個(gè)組織，同組織混樣，提取總RNA，用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的完整性，并用核酸蛋白儀檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。選取質(zhì)量和完整性好的RNA約2 μg為模板，按照First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, USA)的說(shuō)明，用模板與Oligo(dT)18引物合成第一鏈cDNA，產(chǎn)物用于下一步試驗(yàn)。用特異性熒光定量引物(ScTLR9–Q– F1103/R1201，=98.84%，2=0.997) 和(CiTLR9– Q–F821/R910，=97.64%，2=0.992) 擴(kuò)增，內(nèi)參基因?yàn)楱C基因。

1.2.5GCRV感染后基因的表達(dá)差異分析

從預(yù)飼養(yǎng)的健康赤眼鱒和草魚(yú)(各150尾)中各選取120尾，每種魚(yú)設(shè)3個(gè)平行攻毒處理組和1個(gè)空白對(duì)照組，每組30尾魚(yú)飼養(yǎng)在養(yǎng)殖系統(tǒng)中。在試驗(yàn)組每尾魚(yú)的腹腔注射200 μL GCRV病毒懸液，對(duì)照組注射等量的無(wú)菌PBS，在0 、6 、12 、24 、48、72、96 、120 h計(jì)8個(gè)時(shí)間點(diǎn)，于每個(gè)試驗(yàn)組選取3尾有出血癥狀的赤眼鱒和草魚(yú)，分別提取其頭腎組織的總RNA。按Fermentas試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，用SYBR Green I染液(TAKARA, China)在CFX96熒光定量PCR儀(Bio–Rad, USA)中進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系：10 μL SYBR? Premix Ex? (TliRNaseH Plus)，上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，稀釋后的cDNA模板為9.6 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線溫度從65 ℃升至95 ℃，每5 s增加0.5 ℃。用Bio–Rad CFX Manager Software 3.1 (Bio–Rad, USA)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析和定量結(jié)果分析，采用2–ΔΔCt法計(jì)算每個(gè)樣品中的相對(duì)表達(dá)量，并用GraphPad Prism 6作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1基因的cDNA全長(zhǎng)與序列分析結(jié)果

基因cDNA全長(zhǎng)為3 687 bp，包括ORF 3 180 bp，編碼1 059個(gè)氨基酸殘基，5'–非編碼區(qū)(UTR) 128 bp和3'–UTR 379 bp (GeneBank登錄號(hào)為KU955845)。預(yù)測(cè)該基因的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為121 610，等電點(diǎn)為8.91。SMART結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：由N–端的信號(hào)肽(SP，1~18 aa)、16個(gè)LRR基序、LRR–CT基序(787~838 aa)和TM(840~862 aa)及TIR(895~1044 aa )組成(圖1)。16個(gè)LRR基序分別為52~77 aa，78~107 aa，115~134 aa，189~209 aa，210~229 aa，276~295 aa，300~328 aa，356~379 aa，383~403 aa，533~559 aa，588~619 aa，642~665 aa，667~686 aa，691~710 aa，715~736 aa，737~757 aa。

圖1　ScTLR9結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果(圖2)顯示：整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分為2支，硬骨魚(yú)類(lèi)分支和哺乳動(dòng)物分支，其中赤眼鱒和草魚(yú)聚為一簇。

圖2　赤眼鱒TLR9氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

不同物種的TIR結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)結(jié)果(圖3)顯示：硬骨魚(yú)類(lèi)基因的TIR結(jié)構(gòu)域氨基酸序列高度保守，同時(shí)的TIR結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)高度保守的區(qū)域：Box 1(YDAFVVFD)、Box 2(LCLEDRDWLPG)和Box 3(FWNNL)。

圖3　不同物種TLR9的TIR結(jié)構(gòu)域同源比對(duì)結(jié)果(黑色線框標(biāo)記部分為3個(gè)保守的基序)

2.2在赤眼鱒不同組織中的表達(dá)

在被檢測(cè)的9個(gè)赤眼鱒組織中均有表達(dá)，其中在赤眼鱒頭腎、中腎中的表達(dá)量較高，在腦中的表達(dá)量次之，在脾臟、心臟中也有一定的表達(dá)，在肝胰臟中的表達(dá)量最低(圖4)。

圖4　不同組織中TLR9的相對(duì)表達(dá)量

2.3GCRV感染后在赤眼鱒和草魚(yú)頭腎中的表達(dá)差異

由圖5可見(jiàn)，在赤眼鱒和草魚(yú)頭腎中的表達(dá)模式存在差異。人工感染GCRV初期(0~12 h)，在赤眼鱒頭腎中的表達(dá)量顯著上調(diào)，并在感染后12 h表達(dá)量達(dá)到最高，在感染后24 h出現(xiàn)下調(diào)；在草魚(yú)頭腎中，人工感染GCRV初期(0~12 h)，的表達(dá)量基本維持不變，在感染后24 h出現(xiàn)明顯的上調(diào)，且在感染后48 h表達(dá)量達(dá)到最高，在感染后72 h 出現(xiàn)下調(diào)(圖5)。

圖5　GCRV感染后TLR9在赤眼鱒和草魚(yú)頭腎中的表達(dá)量

3　結(jié)論與討論

赤眼鱒與草魚(yú)的相似性為97%，與鯉魚(yú)、黑鯽等鯉科魚(yú)類(lèi)的相似性也達(dá)到了87%以上。赤眼鱒由17個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域組成，而草魚(yú)只含有16個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域的胞外區(qū)[8]。在胞外區(qū)的246~259氨基酸殘基處含有2個(gè)CXXC基序。該結(jié)構(gòu)與CpG的結(jié)合及基因調(diào)控[21]有關(guān)。還含有與CpG–DNA相互作用所必須的2個(gè)氨基酸(在蛋白序列上的位置為D547和Y549)[22]。不同物種的TIR結(jié)構(gòu)域多序列對(duì)比結(jié)果表明，基因TIR結(jié)構(gòu)域非常保守，包含3個(gè)保守區(qū)域Box1、Box2和Box3。的3個(gè)保守區(qū)域和的一致。

Real–Time qPCR分析結(jié)果顯示，c在檢測(cè)的9個(gè)組織中均有表達(dá)，在頭腎、中腎中的表達(dá)量較高。草魚(yú)在鰓中的表達(dá)量最高[8]。鯉魚(yú)在中腎中的表達(dá)量最高[9]。鯽魚(yú)、半滑舌鰨、大黃魚(yú)、虹鱒主要集中在脾和頭腎中表達(dá)[10–13]。綜上可見(jiàn)，雖然不同魚(yú)類(lèi)的最高表達(dá)部位不盡相同，但多數(shù)在脾和頭腎中的表達(dá)較高，表明作為一種識(shí)別受體在魚(yú)類(lèi)免疫反應(yīng)發(fā)揮了的重要作用。在魚(yú)類(lèi)先天性免疫反應(yīng)中扮演了重要角色，赤眼鱒比草魚(yú)具有更好的抵抗GCRV的特性[14–16]。在本試驗(yàn)中，感染GCRV后，在赤眼鱒抵抗GCRV時(shí)發(fā)揮了重要作用，且在赤眼鱒、草魚(yú)頭腎中的表達(dá)模式存在明顯差異。在應(yīng)對(duì)GCRV時(shí)，比的應(yīng)答時(shí)間更短，反應(yīng)更迅速，且的相對(duì)表達(dá)量較早達(dá)到峰值，整體相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)高于草魚(yú)的。由以上結(jié)果可推測(cè)在赤眼鱒抵抗GCRV入侵中扮演了重要角色，但由于赤眼鱒和草魚(yú)在結(jié)構(gòu)域上的差異，其在草魚(yú)和赤眼鱒中可能存在不同的識(shí)別機(jī)制和傳導(dǎo)通路[21–22]。具體的識(shí)別機(jī)制和傳導(dǎo)通路還待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，赤眼鱒具有TLRs家族的典型結(jié)構(gòu)特征，由17個(gè)富亮氨酸結(jié)構(gòu)域(LRRs)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和Toll/白介素–1受體結(jié)構(gòu)域(TIR)組成。赤眼鱒在頭腎和中腎中的相對(duì)表達(dá)量較高；在應(yīng)對(duì)GCRV時(shí)，比的應(yīng)答時(shí)間更短，反應(yīng)更快。該結(jié)果提示在赤眼鱒抵抗GCRV入侵時(shí)發(fā)揮了重要作用，但其作用機(jī)制還有待研究。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王庫(kù)

Molecular cloning and expression characteristics of toll–like receptor gene 9 in

JIN Shengzhen1, WANG Ronghua1, ZHOU Zhiyu1, LIU Qiaolin1,2, PENG Huizhen1, 2, XIAO Tiaoyi1,2*

(1.Hunan Engineering Research Center for Utilization of Characteristics of Aquatic Resources, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province, Changde, Hunan 415000, China)

In order to investigate the structural characteristics of the toll–like receptor gene 9 in(), as well as its expression feature on the immune response in case of GCRV infection, the full–length cDNA of genewas cloned using RACE technology in the study, and the expression ofimmune response in GCRV infection was analyzed using real–time qPCR. The results showed that the full–length cDNA ofwas 3 687 bp encoding with a polypeptide of 1 059 amino acid residues and containing 17 LRR domains. ThemRNA was expressed in all collected tissues, and the relative expression level in mesonephros and head kidney were higher than that in other tissues; Under GCRV infection, the expression ofwere up–regulated in head kidney for barbel chub and grass carp, the relative expression level reached its peak in 12 h forin head kidney of barbel chub. It was speculated that the genewas more quickly on the immune response against GCRV invasion in toll–like receptor than that in grass carp, it played an important role on the response to GCRV infection.

; toll–like receptor 9();grass carp reovirus (GCRV);

10.13331/j.cnki.jhau.2017.03.015

S965.199；Q959.46+8

A

1007-1032(2017)03-0304-06

2017–01–12

2017–04–04

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31272652，31572615)

金生振(1992—)，男，碩士研究生，主要從事水生動(dòng)物遺傳育種研究，Jins92927@126.com；

，肖調(diào)義，博士，教授，主要從事水生動(dòng)物遺傳育種研究，tyxiao1128@163.com

投稿網(wǎng)址：http://xb.hunau.edu.cn