錦鯉皰疹病毒潛伏感染實時熒光定量 PCR檢測方法的建立

陳俊杰，李媛媛，陽瑞雪，古晶晶，汪開毓，耿毅，歐陽萍

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錦鯉皰疹病毒潛伏感染實時熒光定量 PCR檢測方法的建立

陳俊杰，李媛媛，陽瑞雪，古晶晶，汪開毓，耿毅，歐陽萍*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川成都611130)

為建立一種特異和敏感的檢測錦鯉皰疹病毒(koi herpesvirus，KHV)潛伏感染的方法，以KHV基因為靶序列設(shè)計特異性引物，通過條件優(yōu)化建立Real–Time PCR檢測方法，并且對該方法進行特異性和敏感性評估及臨床樣品應(yīng)用研究。結(jié)果顯示：建立的方法與鯉痘皰疹病毒、金魚造血器官壞死病病毒和鰻鱺皰疹病毒均無交叉反應(yīng)，特異性強；最低檢出率為42拷貝/μL，靈敏度高。用本方法對63份臨床樣品進行檢測，有錦鯉皰疹病毒病(KHVD)病史的18份樣品的檢測結(jié)果全為陽性，陽性率為100%；從有臨床癥狀的魚中得到的15份樣品的檢測結(jié)果全為陽性，陽性率為100%；30份無任何臨床癥狀魚中的6份被檢測為陽性，陽性率為20%。本試驗中建立的水生動物皰疹病毒潛伏感染快速檢測方法，可為潛伏感染KHV的臨床檢測提供一種快速、敏感和特異的檢測手段，可為KHVD的分子流行病學(xué)調(diào)查和預(yù)防提供參考。

錦鯉皰疹病毒(KHV)；潛伏感染；實時熒光定量PCR (Real–Time PCR)

錦鯉皰疹病毒病(koi herpesvirus disease，KHVD)是由錦鯉皰疹病毒(koi herpesvirus，KHV)感染引起的一種高致病性、高傳染性和高死亡率的疾病。該病特異性高，主要感染鯉魚和錦鯉，引起的主要病理變化為鰓壞死和間質(zhì)性腎炎。該病發(fā)病率高，流行范圍廣，致死率高達80%～100%[1–4]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)和中國都將KHVD列為必須申報的疾病，中國農(nóng)業(yè)部將其列為Ⅱ類動物疫病[5]。KHVD已經(jīng)在世界多個國家和地區(qū)流行，給鯉魚養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失。

目前已經(jīng)建立的錦鯉皰疹病毒病的檢測方法已達10多種，如細胞培養(yǎng)分離技術(shù)、分子生物學(xué)檢測技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)、免疫學(xué)檢測技術(shù)、電鏡觀察和原位雜交技術(shù)[6]等。臨床檢測試驗已證明這些檢測技術(shù)適用于處于急性感染狀態(tài)的魚，對于臨床癥狀不明顯的處于KHV潛伏感染狀態(tài)下的魚，相關(guān)的檢測方法還有待完善。

皰疹病毒有100多種，能夠感染多種動物和人類。皰疹病毒感染的表現(xiàn)形式可以分為急性感染和潛伏感染。目前感染哺乳動物的所有皰疹病毒都已被證實存在潛伏感染。潛伏感染時，病毒以非整合狀態(tài)的基因組形態(tài)游離在宿主細胞核內(nèi)，一定條件下病毒可被重新激活，引起宿主臨床癥狀并導(dǎo)致死亡。潛伏感染的機制目前尚不清楚[7]。2011年，Kathleen等[8]發(fā)現(xiàn)KHV存在潛伏感染，病毒主要潛伏于外周血白細胞中。2013年，Reed等[9]發(fā)現(xiàn)KHV主要潛伏于B淋巴細胞中。

在潛伏感染時，只有部分基因發(fā)生表達，并且表達量會出現(xiàn)下調(diào)，因此，常規(guī)的檢查方法很難檢測到病毒存在。目前，用于錦鯉皰疹病毒潛伏感染檢測的方法只有重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)檢測方法[10]。當(dāng)前用于KHVD急性感染期的檢測方法還不能確切檢出處于潛伏感染狀態(tài)的宿主，容易出現(xiàn)假陰性。在一定條件下，潛伏感染可以轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙愿腥荆斐伤拗魉劳龊图膊”┌l(fā)[11–14]。為了實現(xiàn)對KHV潛伏感染的檢測，筆者以KHV基因為靶序列設(shè)計特異性引物建立了Real–Time PCR檢測方法?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品和菌株及質(zhì)粒載體

錦鯉皰疹病毒(KHV)、鰻鱺皰疹病毒(AngHV)、鯉皰疹Ⅰ型病毒(CyHV–1)和鯉皰疹Ⅱ型病毒(CyHV–2)的DNA樣品、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院魚病研究中心實驗室提供。pMD19－T克隆載體購自Invitrogen公司。錦鯉和鯉魚共63條，10條體質(zhì)量(55±3) g的存在潛伏感染的鯉魚(A組)來自于暴發(fā)KHVD 4個月后的池塘。8條體質(zhì)量(40±3) g存在潛伏感染的錦鯉(B組)為KHV感染試驗后存活下來的錦鯉。15條體質(zhì)量(100±20)g的鯉魚(C組)來自于帶有KHVD臨床癥狀的經(jīng)PCR檢測為正暴發(fā)KHVD的池塘。30條體質(zhì)量(100±20)g的鯉魚(D組)為四川地區(qū)3個鯉魚養(yǎng)殖場隨機采集的樣品。

1.1.2主要試劑

組織DNA提取試劑盒、小劑量質(zhì)粒抽提試劑盒、T4DNA連接酶、膠回收試劑盒和SYBR? Premix EX熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司。

1.1.3引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank公布的KHV美國株(KHV–U，ID為DQ657948.1)、以色列株(KHV–I，ID為DQ177346.1)和歐洲株(KHV–GZ11，ID為KJ627438.1)基因編碼區(qū)(ORF54)的共有序列，采用Primer 5.0和Oligo 6.0設(shè)計特異性引物，上游引物編號為F1，下游引物編號為R1，預(yù)期片段大小為235 bp。臨床樣品檢測中以普通PCR(OIE推薦TK引物)[6]為對照，上游引物編號為F2，下游引物編號為R2，預(yù)期片段大小為409 bp。引物序列見表1。所有引物均由擎科生物(成都)有限公司合成。

表1　引物序列

1.2外周淋巴細胞的分離和標準陽性模板的制備

1.2.1外周淋巴細胞的分離與總DNA提取

將魚浸入含有MS222麻醉劑(100 mg/L)的水中，約5 min后完成麻醉。用含有肝素的1 mL注射器以尾靜脈穿刺法抽血：將已經(jīng)麻醉處理的魚置于解剖盤上，在臀鰭后緣與魚體脊柱垂直的部位進針，直接刺到2個椎體之間凹處的靜脈，采取0.3～0.5 mL魚全血，輕輕倒置搖勻3～5 次，置于4 ℃冰箱保存，備用。

采用紅細胞裂解法分離外周全血淋巴細胞。將抗凝的魚血和紅細胞裂解液按體積比1∶4(0.3 mL新鮮抗凝血與1.2 mL紅細胞裂解液混合)加入到1.5 mL EP管中，輕輕倒置搖勻3～5次。室溫靜置2 min，1 000 r/min離心3～5 min，棄掉上層紅色液體，收集沉淀部分。使用紅細胞裂解液重復(fù)裂解3次，然后用生理鹽水洗滌2～3次。將得到的細胞沉淀用200 μL生理鹽水重懸，置于4 ℃冰箱保存，備用。取適量的外周淋巴細胞懸液，用DNA提取試劑盒提取總DNA(具體操作按說明書進行)，將提取的總DNA于－20 ℃保存，備用。

1.2.2標準品的制備

將KHV接種到KF細胞(koi fin ,KF)中培養(yǎng)，收集病變超過75%的KF細胞反復(fù)凍融3次，離心后吸取上清液，用DNA試劑盒提取KHV基因組作為PCR擴增模板。PCR擴增體系：2×PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L的上下游引物(F1、R1)各1 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O補充到25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。將凝膠回收試劑盒回收目的基因片段克隆到pMD19–T載體上，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，并將PCR和序列測序鑒定為含有目的基因的重組質(zhì)粒按文獻[11]的方法命名(pMD19–T–Sph)。

1.3條件的優(yōu)化與標準曲線的繪制

1.3.1實時熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

實時熒光定量PCR擴增體系20 μL：2×Real Master Mix/20×SYBR Solution 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O補至20 μL。在ABI7500型熒光PCR儀上進行擴增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性3 s，57 ℃退火30 s，68 ℃延伸60 s，40個循環(huán)。對系統(tǒng)自動生成的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。在其他變量相同的條件下，于56～61 ℃對退火溫度進行優(yōu)化，以確定最適反應(yīng)條件。

1.3.2標準曲線的繪制

將pMD19–T–Sph標準質(zhì)粒稀釋到1×109拷貝/μL后再進行10倍系列稀釋，獲得1×102，1×103，1×104，…，1×106拷貝/μL共 5個濃度，制作標準曲線。每個濃度3個重復(fù)。以ddH2O為空白對照進行SYBR實時熒光定量擴增。用StepOne Plus熒光定量PCR儀(ABI)自帶的Step One Software v2.1軟件進行分析，用Excel 2013繪出標準曲線(橫坐標為模板質(zhì)粒DNA起始濃度的對數(shù)值，縱坐標為相應(yīng)的值)。

1.4敏感性和特異性試驗

1.4.1敏感性試驗

將pMD19–T–Sph標準質(zhì)粒進行10倍系列稀釋(4.2×100，4.2×101，4.2×102，…，4.2×109拷貝/μL)。每個濃度取1 μL作為模板。以ddH2O為陰性對照。以優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件進行熒光定量PCR試驗，分別確定所建立方法能檢測出的pMD19–T–Sph標準質(zhì)粒最低拷貝數(shù)。

1.4.2特異性試驗

用建立的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR對CyHV–3以及與該病毒基因組親緣關(guān)系相近的AngHV、CyHV–2和CyHV–1進行擴增，以ddH2O和正常錦鯉基因組DNA為陰性對照，檢測建立方法的特異性。

1.5臨床樣品的檢測

對所采集的臨床樣品進行抽血、外周淋巴細胞分離與總DNA提取，用建立的實時熒光定量PCR方法以及普通PCR方法進行檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1實時熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

通過退火溫度為56～61 ℃的篩選試驗，最終確定出實時熒光定量PCR的擴增條件：在20 μL反應(yīng)體系中，SYBR Green Premix ExⅡ10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O補至20 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性3 s，57 ℃退火30 s，68 ℃延伸60 s，40個循環(huán)。對系統(tǒng)自動生成的數(shù)據(jù)進行處理。

2.2標準曲線

以10倍稀釋的pMD19–T–Sph為模板，以2.1項中的優(yōu)化條件進行RT–PCR擴增。以模板質(zhì)粒DNA起始濃度的對數(shù)值()為橫坐標，以值()為縱坐標得到標準曲線=–3.33+35.83，相關(guān)系數(shù)(2)為0.998，標準曲線的線性關(guān)系良好。

2.3敏感性和特異性試驗結(jié)果

2.3.1敏感性試驗結(jié)果

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒通過ddH2O進行10倍系列稀釋，使用優(yōu)化好的實時熒光定量PCR進行靈敏度檢測。檢測結(jié)果顯示：實時熒光定量PCR的靈敏度為42 拷貝/μL(圖1)。陽性以35個循環(huán)出現(xiàn)條帶為準，后面出現(xiàn)的條帶可能與形成的引物二聚體有關(guān)。

曲線1，曲線2，曲線3，…，曲線7，曲線8分別為標準質(zhì)?？截悢?shù)4.2×107，4.2×106，4.2×105，…，4.2×101，4.2×100拷貝/μL；曲線9　陰性對照(ddH2O)。

2.3.2特異性試驗結(jié)果

應(yīng)用建立的實時熒光定量PCR方法對CyHV–3以及與該病毒親緣關(guān)系相近的AngHV、CyHV–2、CyHV–1進行擴增，并以ddH2O和健康錦鯉基因組DNA為陰性對照，結(jié)果顯示只有CyHV–3有目的條帶(圖2)，說明本研究中建立的方法與KHV親緣關(guān)系較近的病毒無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。

曲線1　CyHV–3；曲線2　CyHV–1；曲線3　CyHV–2；曲線4　AngHV；曲線5　陰性對照；曲線6　陰性對照。

2.4Real–Time PCR重復(fù)性試驗結(jié)果

對同一樣品的3個不同濃度4.2×107、4.2×106和4.2×105拷貝/μL分別進行3個重復(fù)試驗。4.2×107、4.2×106、4.2×105拷貝/μL試驗組的組內(nèi)變異系數(shù)分別為1.06%、1.79%和1.36%，組間變異系數(shù)分別為1.3%、1.55%和1.5%。組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)都小于2%，表明所建立的方法具有較好的重復(fù)性。

2.5臨床樣品的檢測結(jié)果

采用1.2.1中的方法分離外周血淋巴細胞并提取總DNA，使用實時熒光定量PCR和普通PCR檢測方法對63份樣品的檢測結(jié)果顯示：有過KHV病史的魚(A組)的普通PCR檢測陽性率為0，實時熒光定量PCR陽性率為100%；有爛鰓、腹部出血等臨床癥狀的魚(C組)的普通PCR檢測KHV陽性率為80%，熒光定量PCR檢測陽性率為100%；表面健康的魚(D組)的普通PCR陽性檢出率為0，熒光定量PCR檢出率為20%(表2)。

表2　臨床樣品檢測結(jié)果

3　結(jié)論與討論

錦鯉皰疹病毒(KHV)從發(fā)現(xiàn)至今只有短短十幾年時間。除了南美洲，世界各地都有KHVD爆發(fā)引起大面積鯉魚死亡的報道[12]。KHV的快速傳播與其存在潛伏感染有很大關(guān)系，病毒的潛伏期可以長達十幾年甚至為宿主終生歷經(jīng)的時間[8,13]。本研究中針對KHV基因保守區(qū)設(shè)計特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件建立的檢測KHV潛伏感染的Real– Time PCR方法只對KHV進行擴增，不與AngHV、CyHV–2、CyHV–1和錦鯉組織DNA發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。使用熒光定量PCR對pMD19–T–Sph標準陽性質(zhì)粒進行定量檢測，在1×102～1×106拷貝/μL具有良好的線性關(guān)系，最低檢出率為42拷貝/μL，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2%。該方法具有很好的敏感性和重復(fù)性。

臨床樣品檢測結(jié)果顯示，有KHVD病史魚的樣品(A、B組)的普通PCR檢測為陰性，但實時熒光定量PCR檢測為陽性，表明KHV潛伏狀態(tài)下普通PCR檢測方法難以檢測到該病毒，只有高靈敏度檢測方法適用于對該病毒進行檢測，否則容易出現(xiàn)假陰性。爛鰓、腹部出血等臨床癥狀池塘中的魚的普通PCR檢測陽性率達80%，熒光定量PCR檢測陽性率為100%，表明該池塘中的魚正暴發(fā)KHVD。表面健康的魚的PCR檢測結(jié)果全為陰性，但Real–Time PCR陽性率為20%，說明這些樣品中的部分魚存在潛伏感染，其所在魚塘具有暴發(fā)KHVD的可能。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王庫

Method of Real–Time PCR for the detecting latent infection of koi herpesvirus

CHEN Junjie, LI Yuanyuan, YANG Ruixue, GU Jingjing, WANG Kaiyu, GENG Yi, OUYANG Ping*

(College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

To establish a rapid, sensitive and specific approach for detecting the latent infection of koi Herpesvirus (KHV), a Real-Time PCR test was designed through specific primers designed to target KHVgene. Under the optimized reaction conditions, the results showed that this method was specific for latent detection of KHV without cross reaction to other fish pathogenic viruses, including carp pox herpes virus (CyHV–1), goldfish herpes virus (CyHV–2) and eel herpes virus (AngHV–1). The lowest limitation of detection concentration by Real–Time PCR was 42 copies per 1 μL. A total of 63 clinical samples were detected by Real–Time PCR. The result showed that 18 samples out of which had koi herpesvirus disease (KHVD) history, all samples were positive; 15 samples out of which had in clinical signs and the positive rate was 100%; 30 samples out of which had no any clinical symptoms, and 6 out of the 30 samples were positive, the positive rate was 20%. In conclusion, the approach provides a rapid, sensitive and reliable molecular tool for detecting latent infection of koi Herpesvirus.

koi herpesvirus (KHV); latent infection; Real–Time PCR (RT–PCR)

10.13331/j.cnki.jhau.2017.03.016

S941.41

A

1007-1032(2017)03-0310-05

2016–10–09

2017–01–13

中國博士后科學(xué)基金(2015M582563)；教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金(教外司留[2015]311號)

陳俊杰(1990—)，男，山東臨沂人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)病原微生物及病理學(xué)研究；

，歐陽萍，講師，博士，主要從事家畜病理學(xué)研究，ouyang.ping@live.cn

投稿網(wǎng)址：http://xb.hunau.edu.cn