黑眉錦蛇腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

時云朵，孫豪

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黑眉錦蛇腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

時云朵1，孫豪2*

(1.四川省水產(chǎn)學(xué)校，四川成都 611730；2.雅安市農(nóng)業(yè)局畜牧發(fā)展中心，四川雅安 625000)

采用PCR–DGGE和Q–PCR技術(shù)，分析黑眉錦蛇空腸、回腸和直腸中菌群的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示：黑眉錦蛇空腸、回腸和直腸中菌群的多樣性指數(shù)分別為2.84、3.14、2.69，均勻度分別為0.78、0.86、0.74，豐富度分別為17.20、23.40、14.80，且各腸段中均以厚壁菌門細(xì)菌和擬桿菌門細(xì)菌居多，總菌和厚壁菌門細(xì)菌、擬桿菌門細(xì)菌的豐度分別達(dá)108.07、106.82和106.30CFU/g以上，梭菌屬細(xì)菌、乳酸菌屬細(xì)菌和細(xì)菌的豐度均達(dá)105.05CFU/g以上，且其豐度均隨腸道沿頭部向尾部的方向呈先增加后降低的趨勢，直腸中的豐度低于空腸中的；腸球菌屬細(xì)菌和腸桿菌科細(xì)菌的豐度均在106.11CFU/g以上，其在直腸中的豐度高于空腸中的。結(jié)果表明：黑眉錦蛇腸道中擬桿菌門細(xì)菌和厚壁菌門細(xì)菌為優(yōu)勢菌群；菌群的豐度隨腸道沿頭部向尾部的方向呈先增加后降低的趨勢；益生菌在直腸中的豐度低于在空腸中的，有害菌在直腸中的豐度高于在空腸中的。

黑眉錦蛇；腸道菌群；微生態(tài)；益生菌

黑眉錦蛇()是一種大型無毒蛇，性情溫順，常被當(dāng)作另類寵物飼養(yǎng)[1]，其肉味鮮美，有較高的營養(yǎng)和保健價值，肉、膽、蛻均可作為優(yōu)良的天然藥材，皮是制作工藝品的上乘材料。在黑眉錦蛇養(yǎng)殖中，口腔炎、腸炎和消化不良綜合征是其主要的消化系統(tǒng)疾病。目前，蛇類疾病的防治主要是用抗生素類藥物，而抗生素類藥物嚴(yán)重影響其食用和藥用價值[2]。腸道中的正常菌群與機體的消化和健康密切相關(guān)[3]。目前，對動物腸道中菌群的研究主要針對哺乳類，對爬行類的研究較少，且多采用活菌培養(yǎng)法。Iqbal等[4]用活菌培養(yǎng)法對眼鏡蛇腸道中的需氧和兼性厭氧菌群進(jìn)行了研究，但未揭示腸道中的菌群結(jié)構(gòu)。現(xiàn)代分子技術(shù)已成為微生態(tài)研究的主要技術(shù)。Sun等[5]采用PCR–DGGE和Q–PCR技術(shù)揭示了獺兔胃腸道中的菌群結(jié)構(gòu)；Hill[6]等應(yīng)用PCR–DGGE技術(shù)揭示了響尾蛇腸道中的菌群結(jié)構(gòu)。筆者采用PCR–DGGE和Q–PCR技術(shù)分析黑眉錦蛇空腸、回腸和直腸中的菌群結(jié)構(gòu)，旨在為黑眉錦蛇腸道微生態(tài)的研究和黑眉錦蛇源益生菌的篩選提供參考依據(jù)，并為其人工健康養(yǎng)殖提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1試驗動物及樣品采集

試驗動物購自云南省某養(yǎng)殖場。選5條成年健康的黑眉錦蛇，喂養(yǎng)1周后，用75%的乙醇棉球擦拭其體表。用乙醚對其麻醉后斷頭處死，于無菌環(huán)境取其空腸、回腸和直腸中的內(nèi)容物，－80 ℃保存，備用。

1.2主要試劑與儀器

DcodeTM突變檢測系統(tǒng)、PCR儀和熒光定量PCR儀購自Bio–Rad公司；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mege公司；SYBR?Premix ExTM II、pMD?19–T載體和2×MasterMix(含染料)購自寶生物工程(大連)有限公司；大腸桿菌()DH5α購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3細(xì)菌總DNA的提取和16S rDNA V3區(qū)的擴增

嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒的使用說明抽提細(xì)菌總DNA，測定其濃度后置于－20 ℃冰箱保存，備用。細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)通用引物序列[5]為314f–GC(5–CCTACGGGAGGCAGCAG–3，下劃線部分為“GC”夾子序列)和518(5–AT TACCGCGGCTGCTGG–3)。PCR擴增體系(25 μL)：2×MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各0.01 nmol，模板DNA 20 ng，用ddH2O補足至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。

1.4PCR–DGGE電泳和條帶克隆測序

PCR–DGGE電泳凝膠的濃度為35%~57.5%。變性方向與電泳方向一致。電泳緩沖液為1×TAE，100 V、60 ℃條件下電泳16 h。凝膠經(jīng)銀染后用Bio–Rad?GS800凝膠成像系統(tǒng)拍照。切割回收DGGE圖譜中的部分特異和共性條帶，進(jìn)行克隆測序。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和目的細(xì)菌的Q–PCR測定

以總DNA為模板對細(xì)菌特異性引物(表1)進(jìn)行PCR擴增。2%瓊脂糖凝膠電泳后，對目的條帶進(jìn)行膠回收和克隆測序。抽提陽性克隆質(zhì)粒，測定質(zhì)粒的濃度和260 nm/280 nm值。以10倍梯度稀釋的重組質(zhì)粒為模板，用特異性引物進(jìn)行Q–PCR，繪制目的細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以總DNA為模板對菌特異性引物進(jìn)行Q–PCR。擴增體系(25 μL)：2×SYBR Premix ExII 12.5 μL，50×ROX reference dye II 0.5 μL，上、下游引物各0.01 nmol，模板DNA 20 ng，用ddH2O補足25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，適宜退火溫度退火15 s，40個循環(huán)，在退火后拍照；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，從60 ℃到95 ℃每隔0.5 ℃變性5 s拍照。

表1　細(xì)菌引物序列

NR134139.1、KT363960.1和AY271254.1分別表示假單胞菌屬細(xì)菌、氣單胞菌屬細(xì)菌和細(xì)菌的16S核糖體基因序列登錄號。

1.6數(shù)據(jù)分析

將DGGE圖譜用Quantity one進(jìn)行數(shù)字化和標(biāo)準(zhǔn)化后，用NTSYS 2.10和SPSS 19.0軟件進(jìn)行聚類分析和主成分分析(PCA)，并根據(jù)文獻(xiàn)[7]計算腸道中菌群的多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度。將Q–PCR試驗數(shù)據(jù)取自然對數(shù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果與分析

2.1黑眉錦蛇腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

黑眉錦蛇腸道菌群的PCR–DGGE圖譜(圖1–b)中，條帶的數(shù)量及位置表示其腸道中細(xì)菌的豐富度和種類，顏色深的條帶代表其腸道中的優(yōu)勢菌群。由圖1可知，黑眉錦蛇的空腸、回腸和直腸樣品均有豐富的條帶，但條帶數(shù)目、位置及顏色深淺均具有較大差異，其空腸、回腸和直腸樣品的平均條帶數(shù)為17.20、23.40和14.80，回腸樣品條帶的顏色較空腸的和直腸的深，表明回腸中的菌群結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，且菌群豐度更大；聚類圖(圖1–a)顯示黑眉錦蛇各腸段樣品分別聚為一族，空腸的和直腸的聚為一大族，個體間回腸樣品的相似性系數(shù)較空腸的和直腸的低，說明空腸中的菌群結(jié)構(gòu)和直腸中的相似性較高。PCA(圖2)顯示，PCA1將黑眉錦蛇空腸樣品和直腸樣品與回腸樣品區(qū)分為左右兩部分，空腸樣品和直腸樣品間重復(fù)相對集中，而回腸樣品相對分散，表明回腸中的菌群結(jié)構(gòu)不如空腸中的和直腸中的穩(wěn)定。此外，黑眉錦蛇空腸、回腸和直腸中菌群的多樣性指數(shù)分別為2.84、3.14和2.69，均勻度分別為0.78、0.86和0.74，豐富度分別為17.20、23.40和14.80(表2)。

Jej　空腸；Ile　回腸；Rec　直腸。

表2　黑眉錦蛇腸道菌群多樣性指數(shù)和均勻度及豐富度

2.2黑眉錦蛇腸道菌群PCR–DGGE圖譜中回收條帶克隆測序分析

從PCR–DGGE圖譜上回收21條帶(圖1–b箭頭所示)?？寺y序結(jié)果于GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對的結(jié)果見表3。黑眉錦蛇腸道中含有大量的厚壁菌門(Firmicutes)細(xì)菌、擬桿菌門(Bacteroidetes)細(xì)菌、變形菌門(Proteobacteria)細(xì)菌、朊細(xì)菌門(Prion bacterial phyla)細(xì)菌、未培養(yǎng)瘤胃細(xì)菌(uncultured rumen bacterium)、未培養(yǎng)細(xì)菌(uncultured bacterium)和Rhizosphaerae弧菌，其中未培養(yǎng)瘤胃細(xì)菌為直腸中的特有細(xì)菌，摩氏摩根菌、朵麗擬桿菌、小梭文肯菌、Rhizosphaerae弧菌和發(fā)光桿菌為回腸中的特有細(xì)菌。由表3可見，大部分測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌序列的同源性均大于98%，有些的同源性甚至達(dá)100%。在GeneBank數(shù)據(jù)庫中，與條帶12序列同源性最高的(86%)為不可培養(yǎng)細(xì)菌，因此，條帶12序列所代表的細(xì)菌有可能為新的不可培養(yǎng)細(xì)菌；條帶1與未培養(yǎng)瘤胃細(xì)菌、條帶5與摩氏摩根菌、條帶7與小梭文肯菌、條帶14與未培養(yǎng)細(xì)菌和條帶17與Piscium乳球菌序列的相似性分別為95%、97%、93%、95%和96%，推測這些條帶代表的細(xì)菌可能是對應(yīng)細(xì)菌的新種。

表3　黑眉錦蛇腸道菌群PCR–DGGE圖譜特異性條帶和共性條帶的Blast分析結(jié)果

2.3黑眉錦蛇腸道菌群的豐度

由表4可知，黑眉錦蛇空腸、回腸和直腸中的總菌數(shù)分別為108.26、109.71和108.07CFU/g，空腸、回腸和直腸中的厚壁菌門細(xì)菌數(shù)分別為107.02、108.03、106.82CFU/g，空腸、回腸和直腸中擬桿菌門細(xì)菌的豐度分別為106.45、107.35、106.30CFU/g，總菌、厚壁菌門細(xì)菌和擬桿菌門細(xì)菌的豐度隨腸道沿頭部向尾部的方向呈先增加后降低的趨勢，直腸中的菌群豐度低于空腸中的；腸道中梭菌屬細(xì)菌、乳酸菌屬細(xì)菌和細(xì)菌的豐度均達(dá)105.05CFU/g以上，在不同腸段中梭菌屬細(xì)菌、乳酸菌屬細(xì)菌和細(xì)菌豐度的變化趨勢與總菌、厚壁菌門細(xì)菌和擬桿菌門細(xì)菌豐度的變化趨勢相似，而在空腸中未檢出雙歧桿菌屬細(xì)菌。腸道中腸球菌屬細(xì)菌和腸桿菌科細(xì)菌的豐度均在106.11CFU/g以上，直腸中的菌群豐度高于空腸中的，表明黑眉錦蛇腸道中主要的病原菌為腸球菌屬細(xì)菌和腸桿菌科細(xì)菌。此外，腸道中的氣單胞菌屬細(xì)菌、假單胞菌屬細(xì)菌和鏈球菌屬細(xì)菌的豐度均達(dá)到102.47CFU/g，但小于104.12CFU/g，且氣單胞菌屬細(xì)菌、假單胞菌屬細(xì)菌和鏈球菌屬細(xì)菌在腸道中的分布趨勢同腸桿菌科細(xì)菌和腸球菌屬細(xì)菌的分布趨勢相似。

表4　黑眉錦蛇腸道菌群的豐度

3　結(jié)論與討論

動物不同腸段的功能不同，腸道中的菌群結(jié)構(gòu)也存在差異[7]。黑眉錦蛇腸道中棲息著數(shù)量龐大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的菌群，其空腸、回腸和直腸中菌群的結(jié)構(gòu)存在差異，菌群的多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度隨腸道沿頭部向尾部的方向呈先增加后降低的趨勢。這可能與不同腸段的功能相關(guān)。擬桿菌門細(xì)菌、厚壁菌門細(xì)菌和變形菌門細(xì)菌為緬甸蟒腸道中的優(yōu)勢細(xì)菌[8]。本研究中上述3個菌門的細(xì)菌為黑眉錦蛇腸道中的優(yōu)勢細(xì)菌。擬桿菌門細(xì)菌和厚壁菌門細(xì)菌可降解食物中難分解的成分[9]，緬甸蟒進(jìn)食后，其腸道厚壁菌門細(xì)菌的豐度顯著上升，推測厚壁菌門細(xì)菌可促進(jìn)毛發(fā)等難分解食物的降解[8]，據(jù)此類推，厚壁菌門細(xì)菌可能在黑眉錦蛇消化食物的過程中起重要作用。假單胞菌、沙門氏菌、腸桿菌和雷氏普羅威登斯菌等變形菌門細(xì)菌為蛇口腔中的主要病原菌[10]。黑眉錦蛇腸道中也含有摩氏摩根菌、志賀氏菌、弗格森埃希氏菌、阪崎腸桿菌、雷氏普羅威登斯菌和小梭文肯菌等多種變形菌門細(xì)菌。

梭菌、乳酸菌，雙歧桿菌和細(xì)菌是公認(rèn)的益生菌群，分別屬于厚壁菌門細(xì)菌、放線菌門細(xì)菌和疣微菌門細(xì)菌，且均為蛇腸道中的正常菌群[8]。梭菌可分解多種難降解物質(zhì)，是主要的丁酸產(chǎn)生菌[11]；乳酸菌通過產(chǎn)生乳酸和尼生素等抗菌物質(zhì)抑制病原菌的增殖[12]；雙歧桿菌可抑制腸桿菌科細(xì)菌、腸球菌屬細(xì)菌和鏈球菌屬細(xì)菌的增殖[13–15]；細(xì)菌參與腸黏液的降解和產(chǎn)生[16]。緬甸蟒進(jìn)食后，其腸道中的梭菌屬細(xì)菌、乳酸菌屬細(xì)菌、雙歧桿菌屬細(xì)菌和細(xì)菌的豐度增加[8]，推測這些細(xì)菌在蛇對食物的消化過程中起關(guān)鍵作用。本研究中，梭菌屬細(xì)菌、乳酸菌屬細(xì)菌和細(xì)菌的豐度在黑眉錦蛇腸道中的豐度均達(dá)105.05CFU/g以上，它們的豐度隨腸道沿頭部向尾部的方向呈先增加后降低的趨勢，表明黑眉錦蛇腸道中可能的主要益生菌為梭菌屬細(xì)菌、乳酸菌屬細(xì)菌和細(xì)菌，且回腸可能為其主要的消化腸段。雙歧桿菌屬細(xì)菌占比較小，與文獻(xiàn)[8]中緬甸蟒腸道中放線菌門細(xì)菌占比小的研究結(jié)果相似。腸桿菌科細(xì)菌的氣單胞菌屬細(xì)菌、假單胞菌屬細(xì)菌和腸球菌屬細(xì)菌等是病原菌的主要來源，黑眉錦蛇腸道中腸球菌屬細(xì)菌和腸桿菌科細(xì)菌的豐度均在106.11CFU/g以上，表明腸球菌屬細(xì)菌和腸桿菌科細(xì)菌可能是黑眉錦蛇腸道中的主要病原細(xì)菌。這與Iqbal[4]的研究結(jié)果相似。梭菌屬細(xì)菌、乳酸菌和細(xì)菌等益生菌在黑眉錦蛇直腸中的菌群豐度低于空腸中的，而病原菌在直腸中的豐度高于空腸中的，這可能與益生菌易于粘附腸道上皮形成生物屏障，且不易隨食物殘渣排出體外，并能有效防止病原菌定植而使病原菌易于排出體外有關(guān)。

綜上所述，黑眉錦蛇腸道中的總菌數(shù)達(dá)108.07CFU/g以上，其優(yōu)勢菌群為擬桿菌門細(xì)菌、厚壁菌門細(xì)菌和變形菌門細(xì)菌，主要益生菌群為梭菌屬細(xì)菌、乳酸菌屬細(xì)菌和細(xì)菌，豐度均達(dá)105.05CFU/g以上，而主要病原菌群為腸桿菌科細(xì)菌和腸球菌屬細(xì)菌；菌群多樣性隨腸道沿頭部向尾部的方向呈先增加后降低的趨勢，益生菌群在直腸中的豐度低于在空腸中的，但病原菌群在直腸中的豐度高于在空腸中的?；啬c中的菌群豐富度最高達(dá)109.71CFU/g以上，回腸可能為黑眉錦蛇消化食物的主要腸段。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王庫

Characterization of the intestinal microflora of

SHI Yunduo1, SUN Hao2*

(1.Sichuan Fishery School, Chengdu 611730, China; 2.Development of Animal Husbandry Center, Ya'an Agriculture Bureau, Ya’an, Sichuan 625000, China)

The study was aimed to analyze the intestinal microflora ofby using the polymerase chain reaction–denaturing gradient gel electrophoresis (PCR–DGGE) and fluorescent quantitative–polymerase chain reaction (Q–PCR) techniques. The results shown that diversity index of bacteria in jejunum, ileum and rectum ofwere 2.84, 3.14, and 2.69, respectively; and evenness was 0.78, 0.86, and 0.74; richness was 17.20, 23.40, and 14.80, respectively. Sequence analysis results revealed that the microfloras were mostly Firmicutes and Bacteroidetes. Q–PCR results showed that the abundance of total bacteria, firmicutes and bacteroidetes were more than 108.07, 106.82and 106.30CFU/g respectively; the abundance of,andall reached to 105.05CFU/g, and they had the trend of increase at first and decrease later, and the abundance of rectum was lower than that of jejunum; the abundances ofandbacteriaceae were more than 106.11CFU/g, the abundance of rectum was higher than that of jejunum. The results suggested that the dominant intestinal flora inwereBacteroidetes and Firmicutes; and their abundance both increased at first and then decreased wherever in jejunum, ileum and rectum; the abundance of probiotics in rectum were lower than in jejunum; while, harmful bacteria in rectum were higher than that in jejunum.

; intestinal microflora; microecological; probiotics

10.13331/j.cnki.jhau.2017.03.013

Q959.6+2

A

1007-1032(2017)03-0292-06

2016–10–13

2017–03–20

四川省科學(xué)技術(shù)廳科技支撐計劃項目(2013NI0043)

時云朵(1989—)，女，河北石家莊人，碩士，主要從事動物微生態(tài)研究，shiyunduo01@163.com；

，孫豪，碩士，主要從事動物微生態(tài)研究，sunhaolsyd@163.com

投稿網(wǎng)址：http://xb.hunau.edu.cn