長沙地區(qū)南瓜的小西葫蘆黃花葉病毒檢測及其分子進(jìn)化分析

劉嘉裕，戴良英，劉勇，張德詠，譚新球，李迅，唐前君

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長沙地區(qū)南瓜的小西葫蘆黃花葉病毒檢測及其分子進(jìn)化分析

劉嘉裕1a,2，戴良英1a,2，劉勇3，張德詠3，譚新球3，李迅1a,4，唐前君1a,1b,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)a.植物保護(hù)學(xué)院；b.病毒研究所，湖南長沙410128；2.植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128；3.湖南省植物保護(hù)研究所，湖南長沙410125；4.愛荷華州立大學(xué)植物病理與微生物系，美國艾奧瓦州 50010)

對(duì)長沙地區(qū)160份南瓜疑似病毒病樣品進(jìn)行小西葫蘆黃花葉病毒(，ZYMV)檢測，檢出率達(dá)46.9%。為進(jìn)一步明確長沙地區(qū)ZYMV分離物的分類地位和分子進(jìn)化特征，克隆獲得了1個(gè)長沙地區(qū)ZYMV 外殼蛋白基因，與GenBank已報(bào)道的ZYMV 外殼蛋白基因比對(duì)，并進(jìn)行基因重組、系統(tǒng)發(fā)生、遺傳差異、選擇壓力、種群結(jié)構(gòu)和基因漂流分析。結(jié)果顯示：長沙地區(qū)ZYMV 外殼蛋白基因沒有發(fā)生明顯的重組，突變與負(fù)選擇作用是其進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力，種群結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，但正處于擴(kuò)張的趨勢中；ZYMV不同分離物外殼蛋白基因形成3個(gè)有明顯地理相關(guān)性的美洲、歐洲和亞洲種群，美洲和歐洲種群與亞洲種群之間基因交流不頻繁，可能受到遺傳漂變的影響，而歐洲種群與亞洲種群之間基因交流較頻繁。

南瓜；小西葫蘆黃花葉病毒；外殼蛋白；分子進(jìn)化；長沙地區(qū)

小西葫蘆黃花葉病毒屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyvirudae)馬鈴薯Y病毒屬()，該病毒1981年由LISA[1]和LECOQ[2]分別在意大利和法國的小西葫蘆上首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，后在美國[3]、歐洲[4]、中東[5]和中國臺(tái)灣[6]迅速蔓延。1991年，鄭光宇等[7]首次報(bào)道在中國新疆發(fā)現(xiàn)小西葫蘆黃花葉病毒。小西葫蘆黃花葉病毒現(xiàn)已成為侵染葫蘆科植物的主要病毒之一。ZYMV侵染的寄主主要有葫蘆科、豆科、藜科、莧科植物。近年ZYMV的發(fā)生有加重的趨勢，湖南省葫蘆科種植區(qū)是該病毒侵染發(fā)病的重災(zāi)區(qū)。

ZYMV病毒粒體為彎曲線狀，是一種(+)ssRNA病毒，基因組全長約9.6 kb，編碼1個(gè)多聚蛋白，通過其內(nèi)部3種病毒蛋白酶加工形成10個(gè)功能蛋白[8]。ZYMV病毒的檢測方法[9–10]、發(fā)生起源與傳播[11–12]、基因組序列[13]已有較多研究。ZYMV基因組ORF編碼的最后1個(gè)蛋白是由837個(gè)核苷酸編碼的外殼蛋白(coat protein, CP)，CP包裹病毒RNA形成彎曲線狀病毒粒子[1]，CP亞基在沒有病毒RNA的情況下可以通過聚集形成類似的結(jié)構(gòu)。

CHEN等[14]將ZYMV 的CP基因的氨基酸核心區(qū)和C端序列分成5個(gè)種群；GU等[15]將所有的ZYMV分成5個(gè)或者6個(gè)種群，個(gè)別中國分離物單獨(dú)1個(gè)群組；LIN等[16]以相對(duì)保守的CP基因核苷酸序列進(jìn)行分類，將11個(gè)不同來源的ZYMV分成4個(gè)種群；BANANEJ[17]將ZYMV分離物分成2個(gè)種群(A和B)，種群A在全球都有分布，種群B主要來源于中國；趙芹等[18]對(duì)廣東地區(qū)冬瓜的ZYMV進(jìn)行檢測，克隆CP基因，并進(jìn)行同源性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，將ZYMV 病毒劃分為 7 個(gè)基因型，廣東分離物均屬于同一基因型Ⅰ，包含 3 個(gè)株系， 16 個(gè)分離物分成3組，無明顯地域選擇性。

筆者對(duì)湖南長沙地區(qū)疑似感染病毒病的南瓜進(jìn)行ZYMV檢測，病毒檢出率高，可能已成為長沙地區(qū)南瓜的主要病毒病之一，克隆了其中1個(gè)ZYMV 長沙分離物CP基因，與其他分離物CP基因進(jìn)行比對(duì)和進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)ZYMV長沙分離物與韓國分離物(登錄號(hào)AB369279)親緣關(guān)系最近；ZYMV CP基因區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn)明顯重組，比較保守；突變和負(fù)選擇作用是其進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力，歐亞種群間基因交流較頻繁?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料

2016年9月，在長沙地區(qū)隨機(jī)采集具有葉片花葉、畸形、皺縮、扭曲、斑駁的典型病毒病癥狀的南瓜樣品160份，保存于–80 ℃冰箱。

1.2方法

1.2.1樣品總RNA提取及cDNA合成

稱量0.5 g南瓜樣品置于預(yù)冷好的研缽，加入適量液氮充分研磨至粉末，采用easyPure Plant RNA Kit試劑盒提取南瓜總RNA，再使用TransScriptTM One–Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supe試劑盒合成cDNA，–20 ℃保存。

1.2.2南瓜樣品ZYMV的鑒定

參考GenBank上登錄的ZYMV CP基因序列，使用Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性檢測引物(上游引物5–TCAGGCACTCAGCCAACTGCG–3；下游引物：5–TTACTGCATTGTTGTTCACACCTAAC–3)，對(duì)南瓜樣品進(jìn)行ZYMV檢測，陽性PCR產(chǎn)物送湖南擎科生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)鑒定。

1.2.3南瓜ZYMV 長沙分離物CP基因的克隆

參考KT598222基因全序列，使用Premier 5.0設(shè)計(jì)2對(duì)引物(表1)，由湖南擎科生物技術(shù)有限公司合成引物。對(duì)PCR產(chǎn)物作純化處理后，與T1載體連接，轉(zhuǎn)入Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，于50 μg/mL Amp+的平板過夜培養(yǎng)，篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒DNA送湖南擎科生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)鑒定。最后使用DNAstar軟件對(duì)上述2段序列作序列拼接。

表1　克隆ZYMV CP基因所用的引物序列

1.2.4ZYMV CP基因DNA序列數(shù)據(jù)處理

從GenBank下載所有已報(bào)道的ZYMV CP的全基因核酸序列(截至2017年2月18日，共46條CP基因，表2)，并且將測序所得ZYMV的CP基因組序列進(jìn)行BLAST檢索，選取與其具有最近的親緣關(guān)系物種分離物作為外群。利用BioEdit[19]對(duì)下載序列和克隆的CP基因序列進(jìn)行處理，將全部序列翻譯之后存在的瑕疵修正并刪除終止密碼子。將整理后的數(shù)據(jù)用ClustralX2[20]比對(duì)，為了保證經(jīng)過序列比對(duì)后得到的核苷酸序列能夠正確地編譯出氨基酸序列，使用Trans Align[21]軟件對(duì)ClustralX2比對(duì)后的核苷酸序列數(shù)據(jù)進(jìn)行再處理。

表2　涉及的ZYMV分離物的寄主和來源

1.2.5ZYMV CP基因的分子進(jìn)化分析

利用RDP 4.0[22]軟件包中的RDP、Geneconv、Bootscan、Maxchi、Chimaera、Siscan和3Seq對(duì)上述比對(duì)所得的序列進(jìn)行重組分析，檢測可能存在的重組位點(diǎn)。當(dāng)某分離物有3個(gè)或3個(gè)以上軟件的檢測結(jié)果<1.0×10–6時(shí)，則該分離物存在可能的重組位點(diǎn)，否則不存在重組位點(diǎn)[23]。

采用MEGA 5.0中的Clustral W[24]軟件進(jìn)行序列比對(duì)，利用最大似然法(maximum likelihood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)1 000次。在 ML 法分析中，用jModeltest[25]軟件確定數(shù)據(jù)最適合的核苷酸代替模型，結(jié)果顯示TRN+G為最適的核苷酸替代模型；在 ML分析中采用自舉法，進(jìn)行1 000倍模擬復(fù)制計(jì)算支長。

運(yùn)用DnaSP 5.0[26]軟件，通過計(jì)算其、和[27–28]，衡量種群之間的遺傳差異，如果和統(tǒng)計(jì)值很小，<0.05，則認(rèn)為種群間存在遺傳差異。值接近1，則支持種群的出現(xiàn)頻率。通過計(jì)算和值來衡量基因交流的程度，的絕對(duì)值小于0.33時(shí)，說明2個(gè)種群之間存在基因交流，反之，交流不頻繁[29–30]。若<1，則說明在種群間很容易發(fā)生基因漂變，是群體發(fā)生遺傳差異的主要原因；若>1，則說明種群間存在可以發(fā)生基因交流的渠道或者地緣關(guān)系較近。

應(yīng)用MEGA5.2，將ZYMV分離物按照地理來源分組，采用Pamilo–Bianchi–Li method法計(jì)算密碼子的選擇壓力(非同義突變和同義突變的比值/)[31]。若/=1，說明該組分離物存在中性選擇；若/<1，說明該組分離物存在負(fù)選擇或凈化；若/>1，說明該組分離物存在正向選擇或多樣化選擇。

利用DnaSP 5.0 軟件，對(duì)ZYMVCP序列837個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行突變位點(diǎn)和保守區(qū)域分析。

DnaSP 5.0軟件能計(jì)算不同種群分離物的核苷酸多樣性與單體型多樣性，基于Tajima’s值、Fu & Li’s值和Fu & Li’s值進(jìn)行中性檢驗(yàn)分析。Tajima’s值和Fu & Li’s值和Fu & Li’s均為負(fù)值，說明該種群多樣性較低，種群呈擴(kuò)張趨勢；相反，種群穩(wěn)定選擇，種群數(shù)量正在減少[32–33]。

2　結(jié)果與分析

2.1南瓜樣品中ZYMV的檢測結(jié)果

對(duì)采自長沙地區(qū)的160份南瓜病毒病疑似樣品進(jìn)行RT–PCR檢測，發(fā)現(xiàn)ZYMV的檢出率為40.0%~54.1%(表1)，平均檢出率達(dá)46.9%。

表2　長沙地區(qū)南瓜樣品ZYMV的檢出率

2.2ZYMV CP基因分子進(jìn)化分析

對(duì)數(shù)據(jù)處理后的ZYMV CP基因序列進(jìn)行重組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離物的值都大于1.0×10–6，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的重組位點(diǎn)。為了進(jìn)一步確認(rèn)這一結(jié)果，運(yùn)用SimPlot再次檢測，仍未發(fā)現(xiàn)明顯的重組位點(diǎn)，因而確認(rèn)在ZYMV分離物不存在重組體或者不明顯。

對(duì)數(shù)據(jù)處理后的ZYMV CP 基因序列進(jìn)行分子發(fā)育分析，ZYMV不同分離物形成3個(gè)種群，分別為美洲、歐洲和亞洲種群，不同組間的分離物地理特征明顯，如圖1所示。

水平分支的長度參照0.1的標(biāo)尺按比例繪制; 以西瓜花葉病毒分離物(登錄號(hào)KT992083)作為外群。

利用、和對(duì) ZYMV CP序列的美洲、歐洲和亞洲種群間的遺傳變異進(jìn)行分析，結(jié)果表明，和統(tǒng)計(jì)值都比較小，<0.001(表3)，美洲和歐洲、美洲和亞洲種群間的遺傳變異十分明顯。歐洲和亞洲ZYMV種群間的＜0.33，表明ZYMV在近距離種群間基因交流的頻率較高。美洲和歐洲、美洲和亞洲ZYMV種群間的＜1，表明種群可能受到遺傳漂變影響，歐洲和亞洲ZYMV種群間的＞1，表明種群間存在可以發(fā)生基因交流的渠道。

表3　ZYMV的基因流動(dòng)和遺傳差異

*，0.01<<0.05；**，0.001<<0.01；***，<0.001。

選擇壓力分析結(jié)果顯示，ZYMV所有分離物的/均遠(yuǎn)小于1(表4)，突變?yōu)榉峭x突變，表明ZVMY不同種群都處于較強(qiáng)的負(fù)選擇壓力下。

表4　ZYMV的選擇壓力

種群結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，不同的ZYMV分離物種群的核苷酸序列多樣性和單體型多樣性存在差異，其中亞洲種群的核苷酸序列多樣性值差異最大，歐洲種群單體型多樣性差異最大(表5)。

表5　ZYMV的核苷酸和單體型多樣性

突變位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，有可變位點(diǎn)245個(gè)，單突變位點(diǎn)102個(gè)，其中2個(gè)變異型位點(diǎn)93個(gè)，3個(gè)變異型位點(diǎn)9個(gè)；簡約信息位點(diǎn)143個(gè)，其中2個(gè)變異型位點(diǎn)119個(gè)，3個(gè)變異型位點(diǎn)22個(gè)，4個(gè)變異型位點(diǎn)2個(gè)。

保守區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，ZYMV編碼區(qū)的保守性(sequence conservation)達(dá)到0.61，僅有歐洲種群基因編碼的氨基酸保守值(conservation threshold)高于0.85(表6)，由此可見，ZYMV基因編碼區(qū)突變率較低，比較保守。

表6ZYMV基因編碼區(qū)的保守區(qū)域

Fig.6Conservation regions of the coding regions of ZYMV

種群起始位點(diǎn)保守性一致性P值 美洲327~8370.6240.9980.000 0 歐洲327~8370.8690.9660.000 0 亞洲327~8370.6240.9410.000 0 全部327~8370.6240.9550.000 0

中性檢測分析發(fā)現(xiàn)，ZYMV不同種群的中性檢測統(tǒng)計(jì)值均為負(fù)值(表7)，說明ZYMV處于擴(kuò)張趨勢，種群多態(tài)性較低?？傮w而言，在獨(dú)特的地理分組中進(jìn)行3個(gè)中性平衡模型偏差分析，連同其高單體型多樣性及低核苷酸多樣性，提示ZYMV種群在擴(kuò)張。

表7　ZYMV的中性檢測

3　結(jié)論與討論

對(duì)長沙地區(qū)病毒病南瓜樣品進(jìn)行ZYMV檢測，克隆其中1個(gè)分離物的CP基因全序列，對(duì)CP序列進(jìn)行了重組、系統(tǒng)發(fā)育、遺傳變異、基因交流和種群結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明，長沙地區(qū)ZYMV分離物沒有明顯的重組體，所有的分離物大致可以分為3個(gè)種群：美洲、歐洲和亞洲種群，種群之間有明顯的地理相關(guān)性。美洲與歐洲和亞洲種群地理距離遠(yuǎn)，種群可能受到遺傳漂變的影響，遺傳變異十分顯著，但基因交流不頻繁。而歐洲與亞洲種群相鄰，種群之間遺傳變異不顯著，但基因交流頻繁。亞洲ZYMV種群的核苷酸序列多樣性相比其他種群差異大，歐洲種群相對(duì)其他種群的單體型多樣性差異較大。3個(gè)種群都處于較強(qiáng)的負(fù)選擇壓力下，并且處于擴(kuò)張趨勢中，負(fù)選擇作用是驅(qū)使ZYMV進(jìn)化的主要作用之一。

在植物 RNA 病毒病中，導(dǎo)致遺傳多樣性的主要因素是基因重組[34]，如馬鈴薯 Y 病毒科Potyviridae中重組發(fā)生特別頻繁，對(duì)塑造PVY種群遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響[35]。本研究針對(duì)ZYMV CP全序列進(jìn)行重組分析，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的重組現(xiàn)象，可能是因?yàn)樾蛄械膮^(qū)域(長度)有限，導(dǎo)致了重組體的遺漏。

系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，ZYMV CP序列形成3個(gè)相對(duì)獨(dú)立的種群，種群間具有一定的地理特異性。美洲種群來源于美國和阿根廷，歐洲種群來源于西班牙和中東地區(qū)，但也有個(gè)別的亞洲分離物，表明ZYMV種群在歐洲與亞洲之間交流可能比較頻繁。

病毒在寄主體內(nèi)是以“突變云”或者“準(zhǔn)種”形式存在的，突變是驅(qū)動(dòng)ZYMV進(jìn)化的主要作用力之一。選擇壓力分析表明，ZYMV不同群組的/值都遠(yuǎn)小于1，大部分植物病毒處于強(qiáng)的負(fù)選擇壓力下，說明ZYMV進(jìn)化受到強(qiáng)的負(fù)選擇壓力的驅(qū)動(dòng)，自然選擇是其進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力。變異分析發(fā)現(xiàn)ZYMV 的種群遺傳結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，基因組序列變異較小，比較保守。

綜上，突變、負(fù)選擇作用以及遺傳漂變是驅(qū)動(dòng)ZYMV進(jìn)化的主要作用力，而基因重組在ZYMV的進(jìn)化中驅(qū)動(dòng)作用不明顯；ZYMV不同分離物形成3個(gè)種群，但尚不能明確其起源；中性檢測以及核苷酸和單體型多樣性分析，共同表明ZYMV處于種群擴(kuò)張的趨勢中。

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責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維

Detection ofof pumpkin in Changsha and molecular evolution

LIU Jiayu1a, 2, DAI Liangying1a, 2, LIU Yong3, ZHANG Deyong3, TAN Xinqiu3, LI Xun1a,4, TANG Qianjun1a, 1b,2*

(1.a.College of Plant Protection; b.Virus Research Institute, Changsha 410128; 2.Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests, Hunan Agricultural University, Changsha 410128;3.Institute of Plant Protection, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China; 4.Department of Plant Pathology & Microbiology, Iowa State University, Ames, Iowa 50010, The United States of America)

(ZYMV) was detected in 160 suspected pumpkin virus samples in Changsha area, and the detection rate was 46.9%. To further clarify the classification and molecular evolution of ZYMV Changsha isolates, the coat protein gene was cloned and compared with the ZYMV coat protein gene reported in GenBank. And these sequences were analyzed for genetic recombination, phylogenetic, genetic differences, selection pressure, population structure and gene drift analysis. The results showed that no significant recombination of ZYMV coat protein gene was found. Mutation and negative selection are the main driving forces of its evolution, the population structure is relatively stable but is in the trend of expansion. The different isolates of ZYMV coat protein gene form 3 geographically relevant populations: America population, Europe population and Asia population. There is no frequent gene exchange between America and Europe and Asia, and each group may be affected by genetic drift, and gene exchange between Europe and Asia is more frequent.

; coat protein; phylogenetic; molecular evolution; Changsha area

10.13331/j.cnki.jhau.2017.03.010

S436.429

A

1007-1032(2017)03-0274-08

2017–03–15

2017–04–25

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303028)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101413)；湖南省煙草公司項(xiàng)目(13–14ZDAa04，14– 16ZDAa02)；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)神農(nóng)學(xué)者資助基金；湖南省教育廳項(xiàng)目(16K039)

劉嘉裕(1991—)，男，廣東廣州人，碩士研究生，主要從事植物病毒學(xué)研究，346647742@qq.com；

，唐前君，博士，副教授，主要從事植物病毒學(xué)研究，tangqianjun78@163.com

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