神農(nóng)架自然保護(hù)區(qū)核桃居群遺傳多樣性研究

付光晟，譚學(xué)春，王滑*

?

神農(nóng)架自然保護(hù)區(qū)核桃居群遺傳多樣性研究

付光晟1，譚學(xué)春2，王滑1*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)a.園藝林學(xué)學(xué)院，b.園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430070；2.湖北巴東縣林業(yè)局，湖北恩施444300)

為有效挖掘湖北神農(nóng)架核桃 () 的種質(zhì)資源，采用12對(duì)多態(tài)性高的SSR分子標(biāo)記引物對(duì)3個(gè)神農(nóng)架核桃居群90個(gè)單株的遺傳多樣性及其種群內(nèi)、種群間的遺傳分化進(jìn)行研究。結(jié)果表明：用12 對(duì)針對(duì)核桃屬植物基因組設(shè)計(jì)的SSR引物共檢測(cè)到108條譜帶，其中多態(tài)帶占比為100%。遺傳多樣性分析結(jié)果顯示：居群總期望雜合度為0.604，其遺傳多樣性水平較高，很可能蘊(yùn)含了稀有基因資源。遺傳分化系數(shù)()顯示：有8.22%的變異存在于3個(gè)居群間，遺傳分化程度中等。這可能與3個(gè)居群的地理距離遠(yuǎn)有關(guān)。部分位點(diǎn)顯示出居群總體有雜合不足的現(xiàn)象。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示：居群之間的遺傳距離與地理距離具有較高的一致性。

核桃；神農(nóng)架自然保護(hù)區(qū)；遺傳多樣性；種質(zhì)資源

核桃()在湖北地區(qū)有著廣泛的分布和栽植，是鄂西南眾多地區(qū)老百姓的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源[1–2]。物種品種選育和資源保護(hù)都依賴(lài)于遺傳資源的多樣性。湖北核桃具有豐富的遺傳資源。近年來(lái)，由于產(chǎn)業(yè)升級(jí)和品種化栽培力度增強(qiáng)，一些多樣性變異豐富的實(shí)生農(nóng)家類(lèi)型核桃資源和野生核桃種質(zhì)資源被破壞，湖北核桃資源的遺傳背景有單一化趨勢(shì)。如果這種狀況不得以改善，那么核桃育種工作可能會(huì)面臨無(wú)遺傳材料可用的問(wèn)題[3–5]。

湖北神農(nóng)架自然保護(hù)區(qū)位于湖北省西部邊陲，是針對(duì)亞熱帶珍稀動(dòng)植物和森林生態(tài)系統(tǒng)設(shè)立的國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)。區(qū)域內(nèi)生物資源豐富，據(jù)此推測(cè)，該區(qū)域可能是第四紀(jì)冰川期的生物避難所[6–7]。該區(qū)域內(nèi)山谷縱橫交錯(cuò)，地形特征復(fù)雜，不適宜采用集約化栽培模式，也沒(méi)有大規(guī)?？撤ゼ案慕颖镜貙?shí)生大樹(shù)，因此，大量實(shí)生繁殖的農(nóng)家類(lèi)型核桃資源得以保存。如果這些資源的遺傳多樣性豐富[2]，那么這些資源可用作核桃育種的重要材料。

SSR分子標(biāo)記技術(shù)能夠較好地滿(mǎn)足植物種質(zhì)資源遺傳分析的需求[8]。SSR標(biāo)記已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于對(duì)核桃居群進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)、雜交子代鑒定和品種親緣關(guān)系分析[9–13]。筆者用12對(duì)多態(tài)性高的SSR引物分析神農(nóng)架自然保護(hù)區(qū)內(nèi)3個(gè)核桃自然居群的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性，旨在為本地核桃種質(zhì)資源利用及保護(hù)提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料的采集與處理

經(jīng)資源調(diào)查后，選取神農(nóng)架核桃主要分布區(qū)官門(mén)山、老君山和青天袍為核桃居群研究對(duì)象(表1)。采取隨機(jī)取樣方式，每個(gè)居群采集30個(gè)樣品。采樣單株間隔50 m以上。刮去一年生休眠枝條的表皮，取韌皮組織提取DNA，于－20 ℃條件下保存。

表1　神農(nóng)架核桃3個(gè)居群的地理位置

1.2總DNA的提取

采用CTAB法提取總DNA[14]。參照樹(shù)木韌皮部DNA 提取方法[15]，用Smart SpecTM3000核酸蛋白儀測(cè)定所提取DNA溶液的濃度。將擴(kuò)增反應(yīng)母液稀釋至10 ng/ μL。

1.3引物的篩選及PCR反應(yīng)

用GeneAmp 9700 Thermal cyclers PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在文獻(xiàn)[16]擴(kuò)增條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整，確保最終擴(kuò)增效果穩(wěn)定。調(diào)整后得到以下反應(yīng)體系：總反應(yīng)體積15 μL，其中，DNA模板30 ng，引物0.6 μmol/L，1.5 mmol/L MgCl2，酶(TaKaRa) 0.9 U，0.2 mmol/L dNTP(Promega USA)各。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，按表2退火溫度(不同引物的具體退火溫度見(jiàn)表2)退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；保持72 ℃延伸5 min。SSR引物篩選反應(yīng)重復(fù)2次。選取擴(kuò)增穩(wěn)定且條帶清晰的12對(duì)SSR引物[16–18](WGA–1，WGA–4，WGA–42，WGA–70，WGA–71，WGA–72，WGA–76，WGA–89，WGA–225，WGA–276，WGA–321，WGA–376)用于本研究。

1.4微衛(wèi)星螢光標(biāo)記序列分析

通過(guò)微衛(wèi)星熒光標(biāo)記全自動(dòng)基因分析儀 (3700 DNA Analyzer)，用FAM、NED及VIC 3種顏色的染料對(duì)微衛(wèi)星引物進(jìn)行標(biāo)記。將不同顏色的熒光標(biāo)記、長(zhǎng)度差異大的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)放在同一泳道中進(jìn)行毛細(xì)管電泳。用ABI377對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。用Genotyper 3.7 軟件進(jìn)行圖像收集和分析。計(jì)算等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)等指標(biāo)[19]。

1.5數(shù)據(jù)分析

用POPGENE Version 1.32 軟件[20]計(jì)算以下參數(shù)：有效等位基因數(shù)(e)、多態(tài)位點(diǎn)百分率()、期望雜合度(e)、觀察雜合度(o)、Nei遺傳距離()。采用UPGMA進(jìn)行聚類(lèi)分析[21]。單個(gè)居群及樣本總體在每個(gè)位點(diǎn)上的統(tǒng)計(jì)量，每個(gè)位點(diǎn)上偏離哈迪–溫伯格平衡的顯著性用–Text進(jìn)行檢驗(yàn)[22]。居群每代遷移數(shù)(m)用公式m=0.25(1?)/進(jìn)行計(jì)算。UPGMA 聚類(lèi)圖用NTSYSpc2.10進(jìn)行構(gòu)建[23]。

2　結(jié)果與分析

2.1居群擴(kuò)增位點(diǎn)的遺傳特性

一共有108個(gè)等位基因被擴(kuò)增，每個(gè)位點(diǎn)觀察到的平均等位基因數(shù)為9，平均有效等位基因數(shù)為3.55，多態(tài)位點(diǎn)占比達(dá)100.0%。引物WGA–42檢測(cè)到的等位基因數(shù)最多，為15，引物WGA–225檢測(cè)到的最少，為4(圖1)。各位點(diǎn)期望雜合度為0.202~ 0.892，平均為0.604。3個(gè)居群間的遺傳多樣性水平差別不大。神農(nóng)架青天袍居群的遺傳多樣性最豐富，而官門(mén)山的居群遺傳多樣性較單一(表2)。

圖1　引物WGA–89 在青天袍居群擴(kuò)增的電泳結(jié)果

表2　3個(gè)核桃居群的遺傳多樣性

2.2居群的遺傳分化及哈迪–溫伯格平衡狀況

12個(gè)SSR位點(diǎn)的遺傳分化結(jié)果見(jiàn)表3。3個(gè)居群的遺傳分化系數(shù)()為0.021 8~0.208 0，平均為0.082 2，說(shuō)明有8.22%的變異存在于3個(gè)居群間，3個(gè)居群間的基因流為2.793。代表單個(gè)居群偏離哈迪–溫伯格平衡的程度。整個(gè)居群的平均值為0.072 8，該值說(shuō)明居群內(nèi)的個(gè)體總體表現(xiàn)為雜合子輕微不足，但其間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在3個(gè)居群中，利用相似性比例(檢驗(yàn))檢測(cè)到位點(diǎn)WGA01、WGA04、WGA42、WGA72、WGA76、WGA89 表現(xiàn)出顯著偏離哈溫平衡(<0.05，表3，位點(diǎn)偏離哈溫平衡的程度采用相關(guān)相似性比例，即檢驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè))。

表3　3個(gè)居群核桃的F–統(tǒng)計(jì)量和基因流

“*”和 “**”為根據(jù)數(shù)據(jù)等位基因的頻率及雜合度算出的雜合過(guò)度或雜合不足的程度，“*”示<0.05，“**”示<0.01；值用于衡量采用相關(guān)相似性比例 (檢驗(yàn))檢測(cè)位點(diǎn)偏離哈溫平衡的程度，<0.05時(shí)顯著偏離，<0.01時(shí)極顯著偏離。

2.3各居群間的遺傳關(guān)系

根據(jù)Nei方法[24]計(jì)算出遺傳距離和遺傳一致性結(jié)果列于表4。居群間的遺傳距離為0.147~0.194，其中青天袍居群與老君山居群之間的遺傳距離最小，為0.147，老君山居群與官門(mén)山居群之間的遺傳距離最大，為0.194，居群之間的遺傳分化程度不大。

表4　3個(gè)居群間的遺傳距離和遺傳相似度

對(duì)角線(xiàn)以上為遺傳相似度；對(duì)角線(xiàn)以下為遺傳距離。

根據(jù)3個(gè)居群的遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析，結(jié)果(圖2)表明，老君山居群和青天袍居群優(yōu)先聚為一組，官門(mén)山居群和其他2個(gè)居群的遺傳距離相對(duì)較大。

遺傳距離

3　結(jié)論與討論

近年來(lái)，大量微衛(wèi)星引物被用于對(duì)核桃屬植物進(jìn)行遺傳分析[9–13]。從神農(nóng)架3個(gè)核桃居群遺傳多樣性分析結(jié)果來(lái)看，篩選出的12對(duì)SSR引物在90個(gè)個(gè)體中一共檢測(cè)到了108個(gè)等位基因，多態(tài)位點(diǎn)占比為100%。居群總體期望雜合度為0.604，與中國(guó)西南山區(qū)和云南的核桃居群[12,21]相比，本研究結(jié)果處于中上水平。居群平均等位基因數(shù)較多，平均每個(gè)位點(diǎn)有9個(gè)等位基因，但有效等位基因平均每個(gè)位點(diǎn)只有3.55個(gè)，這說(shuō)明在神農(nóng)架核桃居群中，檢測(cè)到的等位基因中，大多數(shù)的頻率較低，是稀有等位基因。該結(jié)果與對(duì)西藏核桃居群遺傳多樣性的研究結(jié)果[4]相似，說(shuō)明神農(nóng)架核桃居群蘊(yùn)含了豐富的稀有遺傳資源，不僅具有豐富的遺傳多樣性，而且保留了部分稀有基因資源，值得進(jìn)一步挖掘利用。

由神農(nóng)架核桃居群間遺傳分化系數(shù)可知，神農(nóng)架核桃資源中有8.22%的變異存在于居群間。該結(jié)果表明神農(nóng)架核桃居群的遺傳變異主要存在于群體內(nèi)，群體間遺傳變異水平較低。這與大多數(shù)以異交為主的木本植物的遺傳變異模式[25]類(lèi)似。神農(nóng)架核桃居群的遺傳分化系數(shù)值(遺傳結(jié)構(gòu)分化程度)與云南、西藏核桃居群[4,26]的相近。這3個(gè)核桃分布區(qū)的地形都以高山峽谷為主，說(shuō)明地理距離對(duì)核桃居群造成的遺傳分化作用是相似的。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，青天袍居群與老君山居群的親緣關(guān)系相對(duì)較近，官門(mén)山居群與其他2個(gè)居群的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。該聚類(lèi)結(jié)果與3個(gè)居群的地理距離具有較好的一致性，推測(cè)地理距離可能是形成神農(nóng)架核桃當(dāng)前遺傳結(jié)構(gòu)的重要因素。

[1] 高煥章，張義，李秋杰，等．世界核桃產(chǎn)銷(xiāo)概況與湖北名優(yōu)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)對(duì)策[J]．湖北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，20(2)：141–143．

[2] 徠哺輯，肖格林．湖北省核桃品種資源調(diào)查研究報(bào)告[J]．湖北林業(yè)科技，1996(1)：6–9．

[3] 裴東，魯新政．中國(guó)核桃種質(zhì)資源[M]．北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2011．

[4] 王滑．西藏核桃種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[D]．北京：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，2010．

[5] 蒲光蘭，肖千文，吳開(kāi)志，等．四川核桃種質(zhì)資源表型多樣性研究[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014，40(2)：162–167．

[6] 朱兆泉，宋朝樞．神農(nóng)架自然保護(hù)區(qū)科學(xué)考察集[M]．北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1999．

[7] 葛繼穩(wěn)，吳金清，朱兆泉，等．神農(nóng)架生物圈保護(hù)區(qū)植物多樣性及其保護(hù)現(xiàn)狀的研究(英文)[J]．植物科學(xué)學(xué)報(bào)，1997，15(4)：341–352．

[8] 鄒喻蘋(píng)．系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)中的分子標(biāo)記：生命科學(xué)專(zhuān)論[M]．北京：科學(xué)出版社，2001．

[9] Dangl G S，Woeste K，Aradhya M K，et al. Characterization of 14 microsatellite markers for genetic analysis and cultivar identification of walnut[J]．Journal of the American Society for Horticultural Science，2005，130(3)：348–354．

[10] DANGL G S，WOESTE K，ARADHYA M K，et al. Characterization of 14 microsatellite markers for genetic analysis and cultivar identification of walnut[J]．Journal of the American Society for Horticultural Science，2005，130：348–354．

[11] EBRAHIMI A，F(xiàn)ATAHI R，ZAMANI Z．Analysis of genetic diversity among some Persian walnut genotypes (L.) using morphological traits and SSRs markers[J]．Scientia Horticulturae，2011，130(1)：146–151．DOI:10.1016/j.scienta.2011.06.028．

[12] KARIMI R，ERSHADI A，VAHDATI K，et al．Molecular characterization of Persian walnut populations in Iran with microsatellite markers[J]．HortScience，2010(9)：1403–1406．

[13] POLLEGIONI P，WOESTE K，OLIMPIERI I，et al. Long–term human impacts on genetic structure of Italian walnut inferred by SSR markers[J]．Tree Genetics & Genomes，2011，7(4)：707–723．DOI:10.1007/s11295– 011–0368–4．

[14] WANG H，PEI D，GU R S，et al．Genetic diversity and structure of walnut populations in central and southwestern china revealed by microsatellite markers[J]．Journal of the American Society for Horticultural Science，2008，133(2)：9．

[15] 楊英軍，李學(xué)強(qiáng)，張軍科．落葉果樹(shù)韌皮部提取DNA的方法研究[J]．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，35(1)：97–98．DOI:10.3969/j.issn.1000–2340.2001.01.027．

[16] WOESTE K，BURNS R，RHODES O，et al．Thirty polymorphic nuclear microsatellite loci from black walnut[J]．J Hered，2002，93(1)：58–60．DOI:10.1093/ jhered/93.1.58．

[17] 王滑，郝俊民，王寶慶，等．中國(guó)核桃8個(gè)天然居群遺傳多樣性分析[J]．林業(yè)科學(xué)，2007，43(7)：120–124．DOI:10.3321/j.issn：1001–7488.2007.07.020．

[18] DANGL G S，WOESTE K，ARADHYA M K，et al. Characterization of 14 microsatellite markers for genetic analysis and cultivar identification of walnut[J]．Journal of the American Society for Horticultural Science，2005，130(3)：348–354．

[19] 張赤紅，張京．應(yīng)用SSR標(biāo)記對(duì)61個(gè)國(guó)家大麥遺傳多樣性的研究[J]．植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2008，9(1)：15–19．

[20] YEH F C，YANG R C，BOYLE T．Software microsoft window–based freeware for population genetic analysis [M]．Edmonton：University of Alberta，1997．

[21] NEI M．Estimation of Iaverage heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals [J]．Genetics，1978，89：583–590．

[22] CURNOW R N，WRIGHT S．Evolution and the genetics of populations，Volume 4：variability within and among natural populations[J]．Biometrics，1979，35(1)：359．DOI:10.2307/2529965．

[23] ROHLF F J．NTSYS–PC Version 2.10[M]．New York：Applied Biostatistics Inc.，1994．

[24] GUNN B F，ARADHYA M，SALICK J M，et al．Genetic variation in walnuts (and，Juglandaceae)：species distinctions，human impacts，and the conservation of agrobiodiversity in Yunnan，China[J]．American Journal of Botany，2010，97(4)：660–671．DOI:10.3732/ajb.0900114．

[25] WANG H，PAN G，MA Q，et al．The genetic diversity and introgression ofandin Tibet as revealed by SSR markers[J]．Tree Genetics & Genomes，2014，11(1)．DOI:10.1007/s11295–014–0804–3．

[26] PENG Y，CHEN K．Phylogeographic pattern ofin the southeast of Qinghai–Tibetan Plateau of China revealed by cpSSR markers[J]．Silva Fennica，2011，45(4)．DOI:10.14214/sf.94．

責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王庫(kù)

Genetic diversity analysis on genetic diversity ofpopulation in Shennongjia Nature Reserve

FU Guangsheng1, TAN Xuechun2, WANG Hua1*

(1.a.College of Horticulture and Forestry Sciences; b.Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2.Badong County Forestry Bureau, Enshi, Hubei 444300, China)

To exploit the walnut () germplasm in Shennongjia Nature Reserve, the genetic diversity and genetic structure of walnut populations were studied based on 12 SSR markers. 108 alleles from 90 walnut trees of three walnut populations were amplified, and the proportion of polymorphism was 100%. The fact that level of total expectation heterozygosity (e) was 0.604, showed a moderate genetic diversity, and suggested a high probability of rare germplasm in the populations. Analysis from molecular variance revealed a significant genetic variation (=0.082 2) among populations of walnut, which indicated a moderate differentiation of populations, this might cause by geographic isolation on the three populations, and some locus also suggested a heterozygous deficiency among all the samples. The cluster results showed that the genetic distances among the three populations were consistent with their geographic distance.

walnut();Shennongjia Nature Reserve; genetic diversity; germplasm

10.13331/j.cnki.jhau.2017.03.007

S664.1

A

1007-1032(2017)03-0262-04

2016–09–01

2016–09–23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31400558)

付光晟(1994—)，男，湖北武漢人，碩士研究生，主要從事種質(zhì)資源收集與評(píng)價(jià)研究，331940561@qq.com；

，王滑，博士，主要從事核桃種質(zhì)資源收集與評(píng)價(jià)研究，near1981@mail.hzau.edu.cn

投稿網(wǎng)址：http://xb.hunau.edu.cn