玉米粉中吡蟲啉、三唑酮、乙草胺與異丙甲草胺的QuEChERS/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測

李菊穎，郭欣妍，何 健，吳文鑄，孔德洋，單正軍，陳全博

(環(huán)境保護部南京環(huán)境科學(xué)研究所 國家環(huán)境保護農(nóng)藥環(huán)境評價與污染控制重點實驗室，江蘇 南京 210042)

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玉米粉中吡蟲啉、三唑酮、乙草胺與異丙甲草胺的QuEChERS/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測

李菊穎，郭欣妍，何 健，吳文鑄*，孔德洋，單正軍，陳全博

(環(huán)境保護部南京環(huán)境科學(xué)研究所 國家環(huán)境保護農(nóng)藥環(huán)境評價與污染控制重點實驗室，江蘇 南京 210042)

建立了玉米粉中吡蟲啉、三唑酮、乙草胺和異丙甲草胺4種常用農(nóng)藥的QuEChERS/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜殘留分析方法。前處理采用QuEChERS方法，以乙腈為提取劑，N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化碳黑(GCB)為分散凈化劑，并利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)下進行檢測，基底匹配工作曲線法定量。結(jié)果表明：4種農(nóng)藥在0.005～1.000 mg/L濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系(r2≥0.998)；在0.05～1.00 mg/kg加標(biāo)水平下的平均回收率為74.9%～98.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)為1.6%～5.3%；方法檢出限(LOD)為0.001～0.26 μg/kg；定量下限(LOQ)為0.004～0.867 μg/kg。該方法分析速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于玉米粉中吡蟲啉、三唑酮、乙草胺和異丙甲草胺4種農(nóng)藥殘留的快速檢測和確證。

QuEChERS；吡蟲啉；三唑酮；乙草胺；異丙甲草胺；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

吡蟲啉(Imidacloprid)、三唑酮(Triadimefon)、乙草胺(Acetochlor)和異丙甲草胺(Metolachlor)是玉米田常用的4種農(nóng)藥。吡蟲啉是煙堿類超高效殺蟲劑，主要用于防治刺吸式口器害蟲；三唑酮是一種高效低毒的三唑類殺菌劑，多用于防治黑穗病、銹病和白粉病等；乙草胺、異丙甲草胺分別是選擇性芽前處理除草劑和廣譜性播后苗前除草劑，主要用于防除禾本科雜草和部分闊葉雜草。國標(biāo)GB 2763-2016中規(guī)定[1]，玉米中吡蟲啉的最大殘留限量(MRL)為0.05 mg/kg，乙草胺為 0.05 mg/kg，異丙甲草胺為 0.1 mg/kg，三唑酮為 0.5 mg/kg。

目前，國內(nèi)這4種農(nóng)藥的相關(guān)檢測方法主要有氣相色譜法[2-3]、高效液相色譜法[4-5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-11]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-17]。國內(nèi)也建立了糧谷中486種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量測定的液相色譜-質(zhì)譜法[18]和475種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量測定的氣相色譜-質(zhì)譜法[19]，但這些方法樣品處理過程較復(fù)雜，且提取過程使用了毒性較大的甲苯及二氯甲烷，檢出限偏高，不能很好地滿足痕量多殘留的快速檢測需求。本研究在前人基礎(chǔ)上，建立了這4種農(nóng)藥在玉米粉中的分散固相萃取(QuEChERS)/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)殘留分析方法。本方法前處理簡單、成本較低、抗干擾能力強、定性定量分析靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于玉米粉中吡蟲啉、三唑酮、乙草胺和異丙甲草胺的快速檢測和確證。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTM超高效液相色譜儀-Quattro Premier XE 質(zhì)譜儀(美國Waters 公司)，MS105DU電子天平(瑞士MettlerToledo公司)，高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，KQ-500DB型數(shù)控超聲儀(昆山超聲儀器有限公司)。吡蟲啉、三唑酮、乙草胺、異丙甲草胺(純度均為99.0%)均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；乙腈、甲酸(色譜純，德國Merck公司)，無水硫酸鎂(分析純，西隴化工股份有限公司)，PAS(美國Agilent Technologies)，GCB(美國Waters公司)。有機玉米粉購自當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

1.2 樣品的提取與凈化

1.3 UPLC-MS/MS檢測條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱為UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：30 ℃；進樣體積：2 μL；運行時間：5 min；流動相：A為0.01%甲酸溶液，B為乙腈；流速為300 μL/min；梯度洗脫程序：0～0.5 min，95%A；0.5～2 min，95%～5%A；2～3 min，5%A；3～4 min，5%～95%A；4～5 min，95%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，離子源溫度為120 ℃，脫溶劑溫度為380 ℃，脫溶劑氣和錐孔氣為氮氣，脫溶劑氣流速為500 L/h，錐孔氣流速為50 L/h，碰撞氣為高純氬氣，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測。ESI-MS/MS 選擇性反應(yīng)正離子檢測，檢測離子和各子離子的碰撞能量見表1。

表1 待測農(nóng)藥的質(zhì)譜檢測條件

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取吡蟲啉、三唑酮、乙草胺和異丙甲草胺，分別配制1 000 mg/L的儲備液，并用乙腈進行稀釋配制成100 mg/L的吡蟲啉、三唑酮、乙草胺和異丙甲草胺混合標(biāo)準(zhǔn)液，備用。將空白有機玉米粉按“1.2 ” 方法處理得到空白基質(zhì)，分別配制成 0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0 mg/L的混合基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。在上述分析條件下進樣，測定各組分的定量離子對強度。以各農(nóng)藥的定量離子峰面積(y)為縱坐標(biāo)，其質(zhì)量濃度(x，mg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到4種農(nóng)藥的線性方程及相關(guān)系數(shù)(r2)。

1.5 加標(biāo)回收試驗

稱取5.0 g空白玉米粉樣品，設(shè)置0.05，0.5，1.0 mg/kg 3個加標(biāo)水平，分別加入對應(yīng)量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，每個濃度水平平行處理5份(n=5)，進行回收試驗，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測條件的優(yōu)化

(1)智能發(fā)育：采用GDS評分評價患兒智能發(fā)育情況，分別從語言、適應(yīng)性、精細(xì)動作、個人社交、大運動5個方面進行評分，評分越高表明智能發(fā)育越好。(2)社會適應(yīng)能力：采用兒童適應(yīng)行為能力量表(America Association of Mental Deficit-Adaptive Behavior Scale，AAMD-ABS)對患兒干預(yù)前及干預(yù)6個月后的社會適應(yīng)能力進行評價，分別從認(rèn)知功能因子、獨立功能因子、社會/自制因子3個方面進行評價，評分越高表明社會適應(yīng)能力越好。

在電噴霧質(zhì)譜、正負(fù)離子監(jiān)測模式下，分別對毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量和選擇離子等進行優(yōu)化，選取經(jīng)碰撞后所得豐度較高的兩個子離子作為定量和定性離子，并確定最佳碰撞能量的電壓值。最終所選擇的母離子、子離子和碰撞能量等參數(shù)見表1。4種農(nóng)藥玉米粉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測模式定量離子色譜圖見圖 1。

2.2 提取溶劑的選擇

采用乙腈和甲酸酸化乙腈作為萃取溶劑，研究兩種溶劑的提取效果。對比發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲酸-乙腈的體積比為1∶100時，干擾物質(zhì)少，4種農(nóng)藥的回收率高，因而實驗選擇1%甲酸酸化乙腈溶液作為提取溶劑。

2.3 提取時間的選擇

實驗對提取時間進行了優(yōu)化，對玉米粉加標(biāo)樣品分別超聲提取10，20，30，40 min，考察其提取效率的變化。結(jié)果顯示，4種提取時間下，農(nóng)藥在玉米粉中的回收率分別為65.2%～84.7%，74.1%～96.1%，75.4%～96.8%和76.3%～97.5%，除提取時間10 min時的回收率略低外，其余提取時間無明顯差異。為保證提取效率、縮短提取時間、減弱基質(zhì)干擾，實驗選取提取時間為20 min。

2.4 凈化條件的選擇

QuEChERS前處理過程中固相吸附劑對待測農(nóng)藥的吸附會導(dǎo)致回收率降低，進而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文研究了吸附劑PSA和GCB對4種殺蟲劑的吸附效果。PSA作為凈化材料，其表面鍵合的氨基作為有效成分，對樣品中的金屬離子、糖類、脂肪酸、親脂性色素等極性物質(zhì)具有良好的凈化作用，但對色素的凈化能力不理想。GCB對色素有較強的吸附凈化能力，但由于其表面的六元環(huán)結(jié)構(gòu)會吸附一些平面及對稱結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥，導(dǎo)致回收率降低。因而，本文對凈化過程中GCB的用量進行了優(yōu)化，在加標(biāo)水平為0.5 mg/kg時，分別選擇0.15 g無水硫酸鎂和0.05 g PSA，考察了GCB用量分別為0.01，0.02，0.03，0.04 g時的凈化能力。結(jié)果表明，在上述4種用量下，提取液均澄清透明，但隨著GCB用量的增多，4種農(nóng)藥的回收率不同程度下降，其中異丙甲草胺在GCB用量為0.04 g 時的回收率低于60%。為獲得最佳凈化效果，本實驗選擇GCB用量為0.01 g。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)的計算方法一般為：基質(zhì)效應(yīng)=(1-基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)×100%。結(jié)果表明：玉米粉作為基質(zhì)時，吡蟲啉、三唑酮、乙草胺和異丙甲草胺的基質(zhì)效應(yīng)分別為12%，22%，18%和26%，其中三唑酮和異丙甲草胺的基質(zhì)效應(yīng)>20%，對定量檢測具有顯著影響，不可忽略[17]。故本文選擇基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量分析，以抵消基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.6 線性范圍與靈敏度

根據(jù)“1.4”所述方法配制0.005～1.000 mg/L系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。結(jié)果表明吡蟲啉、三唑酮、乙草胺、異丙甲草胺在0.005～1.000 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r2≥0.998)。根據(jù)信噪比S/N≥3和S/N≥10分別確定方法檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，計算得吡蟲啉、三唑酮、乙草胺和異丙甲草胺的LOD分別為0.04，0.02，0.26，0.001 μg/kg；LOQ分別為0.13，0.077，0.867，0.004 μg/kg。而國標(biāo)GB 20770-2008[1]中吡蟲啉、三唑酮、乙草胺和異丙甲草胺的LOD分別為11.0，3.94，23.70，0.2 μg/kg，均高于本方法。

表2 4種農(nóng)藥的線性關(guān)系、平均加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

2.7 回收率與精密度

按“1.5”所述方法進行加標(biāo)回收試驗，結(jié)果見表2。在 0.05～1.00 mg/kg 3 個加標(biāo)水平下，4種待測物的平均回收率為74.9%～98.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.6%～5.3%。方法的準(zhǔn)確度均滿足農(nóng)藥定量分析要求，可應(yīng)用于玉米粉中4種農(nóng)藥的測定。

圖2 陽性樣品中三唑酮的MRM定量離子色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of triadimefon in a positive sample

2.8 實際樣品的測定

為研究市場在售玉米粉的農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀，收集10余份玉米粉樣品進行實際樣品檢測，結(jié)果在其中1批玉米粉樣品中檢出三唑酮，含量為78.7 μg/kg。依照國標(biāo)GB 2763-2016中規(guī)定，玉米中三唑酮的最大殘留限量(MRL)為0.5 mg/kg，該陽性樣品未超過限量要求。陽性樣品的MRM 圖如圖2所示。

3 結(jié) 論

本文采用QuEChERS/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法，建立了玉米粉中吡蟲啉、三唑酮、乙草胺和異丙甲草胺4種常用農(nóng)藥的快速檢測方法。該方法平均回收率為74.9%～98.4%，RSD為1.6%～5.3%；方法LOD為0.001～0.26 μg/kg，LOQ為0.004～0.867 μg/kg。該方法具有簡便快捷、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高等特點，適用于玉米粉中農(nóng)藥的快速檢測和確證。

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[19] GB/T 19649-2006.Determianation of 486 Pesticides and Related Chemicals Residues in Grains-GC-MS Method.National Standards of the People's Republic of China(糧谷中475種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜法.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)).

Rapid Determination of Imidacloprid,Triadimefon,Acetochlor and Metolachlor in Corn Flour by QuEChERS/Ultra-performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LI Ju-ying,GUO Xin-yan,HE Jian,WU Wen-zhu*,KONG De-yang,SHAN Zheng-jun,CHEN Quan-bo

(Nanjing Institute of Environmental Science,Key Laboratory of Pesticide Environmental Assessment and Pollution Control,Ministry of Environmental Protection of the People’s Republic of China,Nanjing 210042,China)

A QuEChERS/HPLC-MS/MS method was developed for the simultaneous determination of imidacloprid,triadimefon,acetochlor and metolachlor residue in corn flour.The residues were extracted from samples with acetonitrile and cleaned up by dispersive method using PSA and GCB，then detected by high liquid chromatography-mass spectrometry(HPLC-MS/MS) under multiple reaction monitoring mode,and quantified by the matrix-matched standard solution.The results showed the method had a good linearity(r2≥0.998) in the range of 0.005-1.000 mg/L.Average recoveries at three spiked levels of 0.05-1.00 mg/kg were in the range of 74.9%-98.4%with relative standard deviations(n=5) of 1.6%-5.3%.The limits of detection(LOD) for 4 pesticides were in the range of 0.001-0.26 μg/kg，and limits of quantitation(LOQ) were in the range of 0.004-0.867 μg/kg.With the advantages of rapidness，simplicity，high sensitivity and good reproducibility,the method is suitable for the determination of target pesticides in corn flour.

QuEChERS;imidacloprid;triadimefon;acetochlor;metolachlor;HPLC-MS/MS

2017-01-11；

2017-02-26

國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0200200,2016YFD0200201)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.014

O656.63；F767.2

A

1004-4957(2017)06-0783-05

*通訊作者：吳文鑄，副研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，Tel：025-87657202，E-mail：wwz@nies.org