神經(jīng)保護劑3β，5α，6β-雄甾三醇原料藥中3種非對映異構體的分離與含量測定

謝敏玉，王亞龍，李心花，熊 麗，文 慧，胡海燕，張靜夏*

(1.中山大學 藥學院，廣東 廣州 510006； 2.廣州市賽普特醫(yī)藥科技股份有限公司，廣東 廣州 510663)

?

神經(jīng)保護劑3β，5α，6β-雄甾三醇原料藥中3種非對映異構體的分離與含量測定

謝敏玉1，2，王亞龍1，李心花1，熊 麗2，文 慧2，胡海燕1，張靜夏1*

(1.中山大學 藥學院，廣東 廣州 510006； 2.廣州市賽普特醫(yī)藥科技股份有限公司，廣東 廣州 510663)

建立了分離與測定3β，5α，6β-雄甾三醇(YC-6)原料藥中3種非對映異構體的氣相色譜方法。進行了分離條件的優(yōu)化及方法學驗證。研究結果表明：該方法可對YC-6與各非對映異構體進行分離，專屬性良好(分離度≥1.5)，精密度高(RSD≤2.0%)；YC-6在6.0～30.0 mg/L質量濃度范圍內線性關系良好。測定了非對映異構體的響應因子(1.59，1.32 和1.41)，并采用加校正因子的主成分自身對照內標法以峰面積計算各非對映異構體的含量。該方法操作簡便，結果準確，可用于YC-6原料中各非對映異構體的分離及含量測定。

3β，5α，6β-雄甾三醇；非對映異構體；含量測定；氣相色譜(GC)

腦卒中是嚴重威脅人類生命健康的重大疾病，神經(jīng)保護劑是腦卒中防治的重要研究領域，神經(jīng)甾體類活性化合物有望成為一類新的神經(jīng)元保護劑[1-5]。3β，5α，6β-雄甾三醇(YC-6)及類似物在多種動物和細胞水平的神經(jīng)損傷模型上表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)元保護效果[6-7]，是非常有應用前景的神經(jīng)元保護劑，目前正在進行臨床Ⅰ期試驗。YC-6是以去氫表雄酮為原料，通過17-位羰基的黃鳴龍反應、甲酸/H2O2體系氧化和堿解反應獲得[7]；該合成過程中，5，6位的2個手性碳由潛手性的5，6位雙鍵轉化所得，理論上會得到4個手性光學異構體；由于目標產(chǎn)物含有8個手性碳，其中6個手性碳和起始原料去氫表雄酮的構型一致，理論上，YC-6和3個光學異構體之間的關系為非對映異構體，其結構如圖1所示。

圖1 YC-6及3個非對映異構體的結構

YC-6作為國內自主研發(fā)的1.1類抗腦卒中新藥，尚無文獻報道該化合物中非對映異構體的檢測方法。在新藥研發(fā)過程的質量控制研究中，光學異構體的分離檢測是藥物研發(fā)的關鍵技術問題，雖然已有許多文獻報道一些藥物的光學異構體的檢測方法[8-15]，但由于每類化合物的結構特殊性，導致獲得簡便而高效的光學異構體的分析方法仍是藥物研發(fā)過程中亟需解決的瓶頸問題。本研究擬采用氣相色譜法實現(xiàn)YC-6與非對映異構體的分離與含量測定，以期為YC-6原料藥中非對映異構體的雜質檢查提供一個簡便而有效的實驗方法，相關研究對其進一步臨床試驗及生產(chǎn)中非對應異構體含量的控制具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890A GC System氣相色譜儀(美國Agilent公司)，含F(xiàn)ID 檢測器；色譜柱：Agilent DB-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)，XS205 型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，SK5200H 超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司) 。

3β，5α，6β-雄甾三醇原料藥(簡稱YC-6，批號：101030，110214，110225，110228，110620，110622，110629)，3β，5α，6β-雄甾三醇對照品(批號：100913，純度為99.60%，1H NMR(DMSO)，δ：4.40，4，16，3.80，3.65，3.30，1.86-1.03，0.88，0.67)。

非對映異構體-Ⅰ對照品 (簡稱異構體-Ⅰ，化學名為3β，5β，6β-雄甾三醇，1H NMR(DMSO)，δ：5.03，4.79，4.04，3.96-3.89，3.34，1.89-0.99，0.98-0.88，0.67)。

非對映異構體-Ⅱ對照品(簡稱異構體-Ⅱ，化學名為3β，5β，6α-雄甾三醇，1H NMR(DMSO)，δ：5.16，4.65，4.04，4.00，3.55-3.46，1.79-0.86，0.81，0.65)。

非對映異構體-Ⅲ對照品(簡稱異構體-Ⅲ，3β，5α，6α-雄甾三醇，1H NMR(DMSO)，δ：5.33，5.08，4.39，4.06，2.16-2.17，1.75-1.20，1.10，0.69)。

以上樣品均由本實驗室自制，內標物黃體酮購自中國藥品生物制品檢定所，批號：027-8004。

1.2 溶液的配制

1.2.1 對照品溶液 分別取適量YC-6、異構體-Ⅰ、異構體-Ⅱ及異構體-Ⅲ，用乙腈溶解并稀釋成每1 mL中約含10 μg樣品的對照溶液。

1.2.2 校正因子測定溶液 分別取適量異構體-Ⅰ、異構體-Ⅱ及異構體-Ⅲ，各加入適量YC-6，用乙腈溶解并稀釋成每1 mL中約含10 μg異構體及YC-6的對照溶液。

1.2.3 系統(tǒng)適用性溶液 適量YC-6對照品、異構體-Ⅰ、異構體-Ⅱ、異構體-Ⅲ及黃體酮(內標)，用乙腈溶解并稀釋成每 1 mL含YC-6對照品 2 mg，異構體-Ⅰ、異構體-Ⅱ、異構體-Ⅲ及黃體酮各約10 μg的混合溶液。

1.2.4 供試品溶液與0.5%對照溶液 取YC-6原料藥的粉末適量，精密加入內標溶液(100 mg/L)，加入乙腈使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成每1 mL含YC-6約2 mg和黃體酮約10 μg的供試品溶液；取對照品溶液適量，精密加入內標溶液(100 mg/L)，用乙腈稀釋成每1 mL中約含10 μg YC-6和10 μg 黃體酮的溶液作為0.5%對照溶液。

1.3 分析方法

以5%苯基-95%聚二甲基硅氧烷為固定液的毛細管柱為色譜柱(DB-5MS：30 m×250 μm×0.25 μm毛細管柱適用)；程序升溫：起始溫度為220 ℃，以10 ℃/min升至270 ℃保持24 min；檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID)，檢測器溫度為280 ℃；進樣口溫度為280 ℃，分流進樣，分流比為10∶1；載氣為氮氣，流速為0.5 mL/min。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的優(yōu)化 分別考察了HP-5,DB-1701,DB-5MS 3種型號毛細管柱對主峰與各非對映異構體分離度的影響，起始溫度220 ℃，以10 ℃/min升至270 ℃保持10 min，氮氣流速均為1 mL/min。

研究結果顯示，HP-5，DB-1701與DB-5MS柱上，主成分與相鄰的非對映異構體之間的分離度分別為1.51，1.25和1.95。HP-5與DB-5MS兩種色譜柱上，YC-6與各非對映異構體的分離度均符合要求。但DB-5MS的色譜分離中，主峰與其之前的峰具有更好的分離度，因此選擇DB-5MS色譜柱考察條件下各峰的分離度為12.43，2.93和1.47。

2.1.2 進樣口溫度的優(yōu)化 GC法能否作為YC-6中各異構體的檢查方法的首要條件是，進樣時YC-6及其異構體能否氣化、氣化是否完全以及各物質是否發(fā)生分解。取“1.2.3”配制的系統(tǒng)適用性溶液，采用“1.3”方法，考察其在不同進樣口溫度(220，260，280 ℃)下樣品的檢出情況(面積歸一化法計算各峰的百分含量)。

研究結果顯示，不同進樣口溫度對YC-6的峰面積及百分峰面積的檢出基本一致，其相對標準偏差(RSD)分別為1.9%和0.3%，均小于2.0%；但對于3個非對映異構體，其峰面積及百分峰面積的檢出，RSD值均大于5.0%；初步判斷當進樣口溫度為220 ℃時，樣品未完全氣化。從YC-6及各異構體的峰面積、百分峰面積、峰形、分離度方面進行分析，發(fā)現(xiàn)在進樣口溫度280 ℃下，YC-6及各異構體的氣化完全且穩(wěn)定，故選擇進樣口溫度為280 ℃。

2.1.3 柱溫的優(yōu)化 在氣相色譜法中，不同的柱溫影響待測物質的分離。取“1.2.3”配制的系統(tǒng)適用性溶液，采用“1.3”分析方法，考察了不同柱溫條件下YC-6與各異構體的分離效果，實驗結果見表1。研究顯示，3種程序升溫方式中，YC-6與異構體-Ⅲ之間的分離度均符合要求。綜合考慮，選擇條件1的色譜條件進行考察，即起始溫度為220 ℃，以10 ℃/min升至270 ℃，保持24 min。

表1 不同柱溫下樣品中各色譜峰之間的分離度(R)

2.1.4 供試品濃度的篩選 非對映異構體能否被檢出，除了色譜條件外，供試品溶液的濃度能否達到其檢測靈敏度也很重要。考察了供試品溶液質量濃度(0.5，1.0，2.0 mg/mL)的影響，結果顯示，進樣2 mg/mL的供試品溶液，能檢出0.05%以下的雜質，故選擇供試品溶液的質量濃度為2 mg/mL。

2.2 方法學驗證

2.2.1 專屬性 分別取4個對照品溶液和系統(tǒng)適用性溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，按照“1.3”方法測定，記錄色譜圖。結果表明，YC-6與異構體-Ⅰ、異構體-Ⅱ、異構體-Ⅲ及黃體酮(內標)均能有效分離，YC-6與峰前異構體-Ⅲ的分離度大于1.5，符合分離要求。表明本方法專屬性良好，適用于YC-6及其非對映異構體的測定，色譜分離結果見圖2。

圖2 專屬性色譜圖Fig.2 Chromatogram of method specificity 1.3β，5β，6β-androstriol，2.3β，5α，6α-androstriol，3.3β，5α，6α-androstriol，4.YC-6，5.progesterone

2.2.2 檢出限 取 YC-6 對照品溶液及異構體-Ⅰ、異構體-Ⅱ、異構體-Ⅲ對照品溶液用乙腈分別逐步稀釋，取稀釋溶液按照“1.3”方法測定。以 3倍信噪比(S/N=3)計算，得YC-6、異構體-Ⅰ、異構體-Ⅱ和異構體-Ⅲ的檢出限分別為1.0，2.5，2.0，2.0 mg/L。

2.2.3 定量下限 取 YC-6 對照品溶液及異構體-Ⅰ、異構體-Ⅱ和異構體-Ⅲ對照品溶液，用乙腈分別逐步稀釋，取稀釋溶液進樣分析。以10倍信噪比(S/N=10)計算，得到YC-6、異構體-Ⅰ、異構體-Ⅱ及異構體-Ⅲ的定量下限分別為5.07,6.96,6.44,6.00 mg/L。

2.2.4 相對校正因子 取“1.2.2”的校正因子測定溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，按照“1.3”方法測定，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。經(jīng)計算，異構體-Ⅰ、異構體-Ⅱ、異構體-Ⅲ對YC-6的相對校正因子分別為1.59，1.32，1.41。結果表明，各異構體對主成分的相對校正因子均在0.9～1.1范圍之外，不適宜直接采用主成分的自身對照法計算異構體含量，本文采用加校正因子的主成分自身對照內標法以峰面積計算異構體的含量。

2.2.5 線性關系 取YC-6對照品適量，精密稱定，用乙腈溶解并稀釋成6.0，10.0，16.0，20.0，30.0 mg/L 的 YC-6 梯度對照品溶液(含10 mg/L的內標)。精密量取上述溶液各1 μL，分別注入氣相色譜儀，按照“1.3”方法測定，記錄色譜圖。以YC-6的濃度(ρ，mg/L)對YC-6與內標的峰面積比(A/A0)進行線性回歸，得回歸方程為A/A0=0.093 8ρ-0.033 8(r2=0.999 6)。結果表明，YC-6在6.0 ～30.0 mg/L質量濃度范圍內與峰面積比呈良好的線性關系。

2.2.6 進樣精密度試驗 取“1.2.3”的0.5%對照溶液，精密量取1 μL注入氣相色譜儀，按照“1.3”方法測定，重復進樣6次，記錄色譜圖。以YC-6與黃體酮的濃度和峰面積計算校正因子，6次測定結果平均校正因子的RSD(n=6) 為0.7%，表明對照品溶液的進樣精密度良好，符合測定要求。

2.2.7 重復性試驗 稱取YC-6樣品6份，精密稱定，分別精密加入內標溶液(100 mg/L)，加乙腈使之溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含YC-6約2 mg和含黃體酮約10 μg的供試品溶液。精密量取該供試品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，按照“1.3”方法測定，記錄色譜圖。采用主成分自身對照內標法計算含量，主峰YC-6的含量為99.16%，RSD為0.01%；各異構體含量的RSD均小于2.0%。表明本法的重復性良好，各異構體測定的精密度良好，符合測定要求。

2.2.8 溶液穩(wěn)定性試驗 取“1.2.4”的供試品溶液，分別于0，2，4，8，9，12 h 精密量取1 μL，注入氣相色譜儀，按“1.3”方法測定，記錄色譜圖，采用主成分自身對照內標法計算含量。結果顯示，主峰YC-6的RSD (n=6 )為0.2%，各異構體峰的RSD (n=6 )均不大于2.0%，表明供試品溶液在12 h 內穩(wěn)定。

2.3 樣品中異構體的含量測定

精密量取0.5%對照溶液1 μL，注入氣相色譜儀；取供試品溶液1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時間的2倍。供試品溶液的色譜圖中如檢測出異構體峰，按加校正因子的主成分自身對照內標法以峰面積計算異構體的含量。利用該分析方法，對合成的6批YC-6樣品進行測定，結果顯示，6批樣品中均未檢出異構體-Ⅰ和異構體-Ⅱ，而異構體-Ⅲ的含量均低于0.10%。

3 結 論

本文建立了氣相色譜法分離和測定YC-6原料藥中非對映異構體的方法。該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、簡單方便、檢測成本低，能夠滿足臨床試驗及工業(yè)化生產(chǎn)中YC-6原料藥中非對映異構體的分離及含量檢測要求。

[1] Karsy M，Brock A，Guan J，Taussky P，Kalani M Y，Park M S.Neurosurg.Focus，2017,42(4)：E3.

[2] Zhang F，Wang S，Signore A P，Chen J.Stroke， 2007，38：2329- 2336.

[3] Ishihara Y，Kawami T，Ishida A.SteroidBiochem.Mol.Biol.， 2013,135：1-6.

[4] Tsutsui K.J.Mol.Neurobiol.，2008,37(2)：116.

[5] Hubert V,Jean-Luc D R,Delphine B,Van L T,Georges P,David V,Kazuyoshi T.J.Front.Endocrinol.，2011,2：79.

[6] Chen J，Leng T，Chen W，Yan M，Yin W，Huang Y，Lin S，Duan D，Lin J，Wu G，Zhang J，Yan G.Steroids，2013,78：996-1002.

[7] Yan M，Liu A L，Zhou S J，Tang L P，Ou Y Q，Yin W，Chen X Y，Su X W，Qiu P X，Huang Y J，Zhang J X，Yan G M，Leng T D.CNSNeurosci.Ther.，2015,21(6)：486-495.

[8] Leng T D，Liu A M，Wang Y Q，Chen X Y，Zhou S J，Li Q，Zhu W B，Zhou Y，Su X W，Huang Y J，Yin W，Qiu P X，Hu H Y，Xiong Z G，Zhang J X，Yan G M.Steroids,2016,105：96-105.

[9] Zhang F，Yang Z Q，Wang X L.Chin.J.Pharm.Anal.(張芳，楊志強，王杏林.藥物分析雜志)，2013,33(2)：189-192.

[10] Cui P，Ji A C，Zhang A H，Ding Y M.Chin.J.Pharm.( 崔萍，紀安成，張愛華，丁逸梅.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志)，2015,46(11)：1220-1222.

[11] Wang D W，Wang X N，F(xiàn)eng M J，Song Y X.J.Instrum.Anal.(王東武，王西寧，豐梅君，宋瑩雪.分析測試學報)，2014, 33 (10)：1123-1128.

[12] Wang N，Zhang L T，Gu J M，Liu M，Zhu H.Chin.J.Pharm.(王娜，張?zhí)m桐，谷建敏，劉曼，朱紅.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志 )，2010,41(7)：528-530.

[13] Ye X X，Song Y X，Chen X T，Ji Y Z，Sun L L，Wu X Q，Du C Y.J.Instrum.Anal.(葉祥喜，宋燕西，陳旭濤，季有知，孫璐璐，吳小倩，杜春燕.分析測試學報)，2014,33(4)：471-474.

[14] Cao Z G，Li L S，Cheng B P，Zhang H F，Zeng C，Qiao T.J.Instrum.Anal.(曹志剛，李來生，程彪平，張宏福，曾春，譙婷.分析測試學報)，2016,35(1)：16-22.

[15] Yang L P，Wang L X，Xu Y L，Qian B Y，Gao R Y.J.Instrum.Anal.(楊麗萍，王立新，徐艷麗，錢寶英，高如瑜.分析測試學報)，2004,23(5)：25-28.

Separation and Determination of Three Diasteromers in Neuroprotectant 3β，5α，6β-Androstriol Bulk Drug

XIE Min-yu1，2，WANG Ya-long1，LI Xin-hua1，XIONG Li2，WEN Hui2，HU Hai-yan1，ZHANG Jing-xia1*

(1.School of Pharmaceutical Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China；2.Guangzhou Cellprotek Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangzhou 510663，China)

A GC method for the separation and determination of three diasteromers in neuroprotectant 3β，5α，6β-androstriol(YC-6) bulk drug was developed.The separation conditions such as column type，injection port temperature，column temperature and sample concentrate were optimized，and method validation was developed.The results showed that the method had a good specificity(resolution(R) ≥1.5) and a good precision(RSD≤2.0%，n=6).The calibration curve showed a good linearity over the concentration range of 6.0-30.0 μg/mL for YC-6.The response factors of three diasteromers were 1.59，1.32 and 1.41，respectively，and their contents were detected by principal component self-comparison with calibration factor and internal standard method.The method was simple，sensitive and valid，and was successfully applied in the analysis of diasteromers in neuroprotectant 3β，5α，6β-androstriol bulk drug.

3β，5α，6β-androstriol; diasteromers; content determination; gas chromatography(GC)

2017-02-04；

2017-03-28

廣東省重大科技專項(2012A080201008)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.020

O657.71;TQ460.72

A

1004-4957(2017)06-0812-05

*通訊作者：張靜夏，博士，副教授，研究方向：新藥研究與開發(fā)，Tel：020-39943063，E-mail：jingxiaz@163.com