CRISPR-Cas系統(tǒng)在食品微生物中的應用研究進展

張玉潔，宋育陽,2，秦 義,2,*，劉延琳,2,*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100）

CRISPR-Cas系統(tǒng)在食品微生物中的應用研究進展

張玉潔1，宋育陽1,2，秦 義1,2,*，劉延琳1,2,*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100）

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其關聯(lián)蛋白（CRISPR-associated proteins，Cas）構成CRISPR-Cas系統(tǒng)，該系統(tǒng)作為高效、靈活、易于操作的基因編輯技術，開始廣泛應用于微生物基因組位點的靶向編輯中。本文針對CRISPR-Cas9系統(tǒng)在食品微生物領域，特別是在食品釀造微生物和食品病原微生物中的應用進行綜述，并進一步討論影響該系統(tǒng)基因編輯效率的主要因素及發(fā)展方向，為CRISPR-Cas9系統(tǒng)在食品微生物中的應用提供參考和依據(jù)。

CRISPR-Cas系統(tǒng)；食品微生物；基因編輯

張玉潔, 宋育陽, 秦義, 等. CRISPR-Cas系統(tǒng)在食品微生物中的應用研究進展[J]. 食品科學, 2017, 38(11): 269-275. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711043. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Yujie, SONG Yuyang, QIN Yi, et al. Progress in CRISPR-Cas system application in food microbiology[J]. Food Science, 2017, 38(11): 269-275. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711043. http://www.spkx.net.cn

來源于細菌和古細菌的獲得性免疫系統(tǒng)——成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其關聯(lián)蛋白（CRISPR-associated proteins，CAS）能夠降解入侵病毒或噬菌體DNA，是生物體進化過程中形成的免疫系統(tǒng)。其中，根據(jù)CRISPR數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，45%的細菌基因組及83%的古細菌中存在CRISPR基因座[1]。而位于CRISPR基因座附近的成簇Cas基因，能夠編碼核酸酶、解旋酶、聚合酶等一系列蛋白，主要參與特異性靶向及剪切病毒或質粒核苷酸片段等過程[2]。

CRISPR-Cas系統(tǒng)主要包括兩部分：一系列高度保守的正向重復序列（repeats）與長度相似基因組的間隔序列（spacers）間隔排列組成的CRISPR陣列，及CRISPR陣列附近存在的成簇的Cas基因[3]。

根據(jù)CRISPR-Cas系統(tǒng)中Cas基因及編碼蛋白功能的差異，可以將其分為3 種類型（Ⅰ～Ⅲ型）以及10 個亞類型（Ⅰ-A、Ⅰ-B、Ⅰ-C、Ⅰ-D、Ⅰ-E、Ⅰ-F、Ⅱ-A、Ⅱ-B、Ⅲ-A和Ⅲ-B）[4-6]。但是目前來源于化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的CRISPR-CasⅡ型系統(tǒng)是研究較為透徹及應用最廣泛的系統(tǒng)[7]。在這個系統(tǒng)中主要依賴Cas9作為DNA內切酶靶向基因組原間隔序列側翼的一段保守短序列，即間隔序列前體旁基序（protospacer adjacent motif，PAM）位點（5-NGG或NAG結構），其中介導Cas9蛋白與DNA的結合主要依賴于CRISPR轉錄而來的反式激活RNA（tracrRNA）及成熟CRISPR RNA（crRNA）產生DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSBs），以實現(xiàn)基因組的定點編輯。

為了將其應用于人工基因編輯中，Jinek等[8]首次將crRNA-tracrRNA融合為單鏈向導RNA（single guide RNA，sgRNA），其中包括與靶DNA互補的20 nt crRNA，以及與Cas9蛋白結合所需的RNA二級結構序列tracrRNA，這種簡化結構同樣能夠引導Cas9蛋白發(fā)生特異位點切割，如圖1所示[9]。同時，簡化的系統(tǒng)也為CRISPR-Cas9系統(tǒng)的廣泛應用奠定了基礎[10-15]。

圖1 原始及改造后的CRISPR-Cas9系統(tǒng)[9]Fig. 1 Naturally occurring and engineered CRISPR-Cas9 systems[9]

目前，CRISPR-Cas9系統(tǒng)在微生物領域的應用多集中于合成生物學方面，而在食品微生物領域的應用研究也逐步增多。食品微生物是與食品有關的微生物的總稱，包括酵母菌、醋酸菌、霉菌等食品釀造微生物，和大腸桿菌、肉毒桿菌等食品病原微生物。本文綜述了CRISPR-Cas9系統(tǒng)在食品釀造微生物和食品病原微生物領域中的應用研究進展，分析了影響CRISPR-Cas9編輯效率的因素。

1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)在食品釀造微生物中的應用

最常用的食品釀造微生物包括酵母菌、曲霉以及細菌中的乳酸菌、枯草芽孢桿菌等。其中常用的酵母菌有釀酒酵母、橢圓酵母、卡爾酵母和異常漢遜酵母等；常用的霉菌有毛霉屬、根霉屬、曲霉屬和地霉屬等。目前，CRISPR-Cas9系統(tǒng)在食品釀造微生物中的應用，更多地集中在生產食品原輔料的微生物細胞工廠改造方面。

1.1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)在釀酒酵母中的應用

1.1.1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)用于釀酒酵母的基因敲除

DiCarlo等[11]首次在釀酒酵母中采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)，他們在CAN1位點（編碼精氨酸透過酶）重組90 bp寡肽DNA（包含上下游同源臂及終止密碼子）及1.4 kb包含同源臂的KanMX敲除盒，從而實現(xiàn)高效率的定點基因敲除（約100%）。其次，研究發(fā)現(xiàn)相比較傳統(tǒng)同源重組，以ADE2位點為靶向敲除基因，由CRISPR-Cas9介導，以雙鏈寡肽DNA作為供體的同源重組效率提高了130 倍，且顯著高于以單鏈寡肽DNA作為供體的同源重組效率（5 倍）。DiCarlo等[11]在釀酒酵母中的研究開啟了CRISPR-Cas9系統(tǒng)在酵母領域的新時代。隨后，Zhang Guochang等[16]在多倍體工業(yè)酵母ATCC 4124中采用相同的策略逐步敲除LEU2、TRP1、URA3和HIS3，且效率達到15%～60%，最終成功構建4重缺陷菌株（Δura3 Δtrp1 Δleu2 Δhis3）。此外，Ryan等[17]將RNA聚合酶Ⅲ啟動子SNR52替換為tRNATyr作為引導RNA（gRNA）的啟動子，隨后將改造后的系統(tǒng)應用于二倍體釀酒酵母S288C的11 個非連鎖基因（URA3、QCR9、QCR6、COX10、HIS2、ARG80、TRP1、CAN1、MET6、LEU2、LYP1）的敲除上。研究結果發(fā)現(xiàn)以120 nt包含標簽（barcoded）的DNA為供體，采用gRNA分別敲除基因時，單個基因的敲除效率接近100%。

前期的研究為CRISPR-Cas9系統(tǒng)在釀酒酵母中的應用奠定了基礎。但是，CRISPR-Cas9系統(tǒng)在進行獨立的單個基因編輯時，并未突顯其優(yōu)勢。由此，越來越多的研究開始利用該系統(tǒng)提高釀酒酵母多位點的同源重組效率，同時，針對多個位點進行基因敲除的CRISPR-Cas9系統(tǒng)改造也應運而生。

Bao Zehua等[18]在釀酒酵母中借助原始CRISPR陣列結構并整合供體DNA序列，構建了一步實現(xiàn)多基因敲除的CRISPR-Cas系統(tǒng)——HI-CRISPR（homology-integrated CRISPR-Cas），并成功在4 d內同時敲除CAN1、ADE2及LYP1基因，敲除效率達到27%～87%，由此驗證了此系統(tǒng)的有效性。在此基礎上，在靶向人工皮質醇合成途徑中ATF2、GCY1、YPR1基因的敲除實驗中發(fā)現(xiàn)，一步敲除效率高達到100%。因此進一步說明HI-CRISPR是進行多基因操作的有力工具。同時，Jako?iūnas等[19]采用USER克隆法，對類異戊二烯代謝途徑中關鍵物質——甲羥戊酸合成途徑中的5 個關鍵位點（yjl064w、ypl062w、bts1、rox1、erg9），分別構建了含1～5 個靶基因的短發(fā)夾RNA（sgRNA）載體，隨后通過篩選所有敲除組合的高產甲羥戊酸菌株，最終獲得甲羥戊酸增產41 倍的菌株。以上針對多位點敲除的gRNA設計，均采用DNA克隆方法合成sgRNA質粒，從而實現(xiàn)一步轉化即可完成多基因敲除。而Ryan等[17]在二倍體釀酒酵母S288C中，同時轉入針對URA3、LYP1位點及URA3、LYP1、COX10位點的sgRNA，此外，為通過穩(wěn)定sgRNA來提高基因編輯效率，分別設計5′端帶有δ型肝炎病毒核糖（hepatitis delta virus，HDV）酶結構的sgRNA，最終基因敲除效率分別達到43%與19%，并將這個能夠進行多位點基因編輯的系統(tǒng)稱為CRISPRm（multiplexed CRISPR-Cas9）。

與上述采用環(huán)形gRNA載體不同的是，Horwitz等[20]將線性化含選擇標記質粒及與其兩翼同源的gRNA片段共轉化，在體內缺口修復機制下重構環(huán)形質粒，最終實現(xiàn)RHR2、ADH5、HO 3 個位點的敲除，且敲除效率達到64%。Mans等[21]采用相似方法進行基因敲除，但是針對MCH1、MCH2及MCH5 3 個基因的敲除效率僅為4%。造成敲除效率顯著差異的原因可能是3 個sgRNA片段與線性質粒的環(huán)化難以完成。除此之外，Stovicek等[22]將CRISPR-Cas9系統(tǒng)應用于來源背景不同的工業(yè)酵母的同源基因編輯中，從而為CRISPR-Cas9系統(tǒng)在工業(yè)酵母的細胞工廠中應用提供依據(jù)。

1.1.2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)用于釀酒酵母的基因整合

利用合成生物學方法和技術構建細胞工廠，是生產人類所需目標物的有效途徑[23-24]。盡管基于染色體的同源重組技術及質粒外源表達系統(tǒng)具有較高效率，但是由于工業(yè)微生物缺少篩選標記及游離表達質粒的不穩(wěn)定[25]，導致傳統(tǒng)的基因整合技術在工業(yè)微生物上的應用存在一定困難，而基于CRISPR-Cas的基因整合技術可以有效地避免傳統(tǒng)基因整合技術應用上的不足。

Jako?iūnas等[26]利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構建gRNA載體及重組元件（靶基因上下游同源區(qū)、啟動子、終止子及待整合基因），在釀酒酵母的ADE2、HIS3、URA3位點分別整合了crtYB、crtI、crtE，成功構建類胡蘿卜素合成途徑，且重組效率達30.6%。這種被稱為CasEMBLR的同源重組方法隨后被應用于通過解除ARO10、PDC5的負反饋抑制作用來增加芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸）中，即在ARO10、PDC5位點處整合酪氨酸不敏感型ARO4、ARO7重組元件，結果發(fā)現(xiàn)即使在兩個不含篩選標記位點處發(fā)生基因整合，一步整合效率也達到58%。而Ronda等[27]也將基因整合系統(tǒng)EasyClone與改造的CRISPR-Cas9結合（稱之為CrEdit），針對類胡蘿卜素合成途徑代謝通路的3 個位點（約17.5 kb）同時進行基因整合（crtI、crtYB、BTS1），整合效率與存在選擇壓力下的傳統(tǒng)同源重組效率相比提升至84%。Shi Shuobo等[28]利用染色體上Delta位點，重組與木糖利用及（R,R）-2,3-丁二醇（2,3-butanediol，BDO）合成途徑有關的基因片段（約24 kb），并最終利用Di-CRISPR（delta integration CRISPR）-Cas9系統(tǒng)成功構建能夠直接利用木糖合成丁二醇的菌株，這種進行多拷貝染色體整合的CRISPR-Cas被稱為Di-CRISPR。而Horwitz等[20]采用模塊化gRNA策略，將CRISPR-Cas9系統(tǒng)應用于酵母己二烯二酸合成途徑中，構建靶向GAL80、HO、ARO1位點的gRNA并與線性化含選擇標記質粒轉化，在缺口修復的機制下實現(xiàn)以上3 個位點一步整合己二烯二酸代謝途徑基因（11 個基因，基因片段約24 kb），但是重組效率較低，僅約4.2%。

1.2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)在非釀酒酵母中的應用

CRISPR-Cas9系統(tǒng)經改造后也被用于裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）及其他霉菌的基因編輯中。在釀酒酵母中，采用tRNA啟動子作為sgRNA啟動子并不影響sgRNA的完整表達[11]，而裂殖酵母由于缺少相關RNA聚合酶Ⅲ啟動子的研究，從而限制了CRISPR-Cas9系統(tǒng)在裂殖酵母及其他非釀酒酵母中的應用。但是，Jacobs等[29]通過在sgRNA 5’端添加一段可剪切的前導RNA（rrk1編碼的K RNA）及在3’末端添加錘頭狀核酶（hammerhead ribozyme）保證了sgRNA的完整表達，隨后采用此系統(tǒng)對ADE6位點進行突變驗證，突變效率在85%～98%之間。而在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中，Schwartz等[30]在比較不同sgRNA啟動子對CRISPR-Cas9系統(tǒng)的編輯效率的影響后，發(fā)現(xiàn)合成啟動子（RPR1′-tRNAGly、SCR1′-tRNAGly、SNR52′-tRNAGly）相對于自身RNA聚合酶Ⅱ及RNA聚合酶Ⅲ啟動子來說，能夠有效提高基因敲除及基因整合效率，其中，SCR1′-tRNAGly作為sgRNA啟動子時編輯效率最高。

1.3 CRISPR-Cas9系統(tǒng)在霉菌中的應用

L i u R u i等[31]也首次針對絲狀真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）改造了CRISPR-Cas9系統(tǒng)，即采用Cas9密碼子優(yōu)化、體外轉錄gRNA及改造Cas9的組成型啟動子為誘導性啟動子，實現(xiàn)CRISPR-Cas9系統(tǒng)在絲狀真菌中的可調控基因編輯。同時，采用優(yōu)化后的CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠實現(xiàn)雙基因及3 個基因位點的基因敲除，效率分別達到45%和4.2%。盡管針對3 個位點的編輯效率較低，但是CRISPR-Cas9在真菌中一步實現(xiàn)多位點基因編輯仍具有發(fā)展前景及應用價值[31]。隨后，在絲狀真菌鏈孢霉（Neurospora crassa）中CRISPR-Cas9被用于啟動子替換及基因插入[32]。與Jacob等[29]對裂殖酵母sgRNA啟動子的改造方式類似，N?dvig等[33]在進行野生棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）的基因編輯中，分別將兩段核酶序列融合在sgRNA的5’端（hammerhead，HH）及3’端HDV以確保sgRNA的精確表達，隨后在曲霉屬（Aspergillus）的6 個曲霉種（A. nidulans、A. aculeatus、A. niger、A.carbonarius、A. luchuensis、A. brasiliensis）中進一步驗證了CRISPR-Cas9系統(tǒng)的高效性。

盡管多數(shù)情況下在Cas9酶切產生雙鏈基因斷裂后，通常采用HR修復機制來實現(xiàn)基因的高效編輯。但是在煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）中，F(xiàn)uller等[34]通過NHEJ介導的修復機制完成了單基因的敲除（敲除效率25%～53%），經測序后卻發(fā)現(xiàn)造成基因敲除的主要原因是大片段的插入及終止子的提前引入。

2 CRISPR-Cas系統(tǒng)在食品病原微生物領域中的應用

食品微生物安全是食品安全的重要組成部分。這其中，在食品儲運和加工過程中污染的病原菌越來受到關注。近年來，由于食品病原微生物帶來的食物中毒事件偶有發(fā)生。因此，對食品病原微生物的預防、檢測和控制是保障食品安全的重要方面。

2.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)應用于食品病原微生物的基因分型與檢測

根據(jù)前期對CRISPR-Cas系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，細菌間的CRISPR位點具有高度變異性，從而為基因分型提供理想位點。CRISPR位點的差異主要體現(xiàn)在以下3 個方面：首先，特定位點的間隔區(qū)的數(shù)目差異很大，其主要來源于外源病毒及質粒的入侵，據(jù)此可以估計菌株的來源進化途徑等[35]；其次，不同位點的CRISPR差異較大，而重復序列的長度在同一物種中保守型較高[1]；第三，由Cas酶的多態(tài)性造成的差異[6]；盡管針對Cas酶序列的生物信息學分析（包括對Cas操縱子的結構及組成分析）及與Cas1的親緣關系能夠實現(xiàn)部分CRISPR-Cas系統(tǒng)的分類，但是不同物種的基因組測序結果揭示了CRISPR-Cas的多樣性；隨后，Makarova等[36]通過系統(tǒng)發(fā)育結合比較基因組學的方法實現(xiàn)了對現(xiàn)有CRISPR-Cas的分類及命名。

鑒于以上差異，CRISPR位點已被廣泛應用于食品病原微生物的分子分型及檢測方面等。其中，分枝桿菌屬下的結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis）是最早開始采用CRISPR位點分類的食品病原微生物。這種被稱為“間隔區(qū)寡核苷酸分型”（spoligotyping）的分類方法能夠有效且快速檢測菌株[37-38]。同樣，采用基于CRISPR位點的“間隔區(qū)寡核苷酸分型”能夠有效進行棒狀桿菌屬（Corynebacterium）Corynebacterium diphteriae的流行病監(jiān)測及菌株系統(tǒng)發(fā)育分析[39]。隨后，針對不同屬菌株的分型工作逐漸展開，如耶爾森氏菌屬（Yersinia）[40]、鏈球菌屬（Streptococci）[41]、埃希氏桿菌屬（Escherichia）[42]、沙門氏菌屬（S a l m o n e l l a）[43]、乳桿菌屬（Lactobacillus）[44]、雙歧桿菌屬（Bif i dobacterium）[45]等。

盡管依據(jù)CRISPR基因簇能夠有效區(qū)分屬、種及不同株系的菌株，但該方法也存在局限性。比如，某些細菌中的CRISPR位點出現(xiàn)頻率低或間隔區(qū)種類過于豐富，從而導致單純依賴CRISPR位點的分辨效果降低；而結合擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP），多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）等傳統(tǒng)分型方法與單獨使用CRISPR位點相比，能夠顯著提高分辨能力，因而受到更多關注[43,46]。除此以外，新獲得的CRISPR間隔區(qū)是否能夠區(qū)分出近緣菌株也是基于CRISPR的基因分型面臨的問題之一。通常，根據(jù)CRISPR序列尾部末端保守的祖先間隔區(qū)能夠實現(xiàn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析，而實現(xiàn)時間及空間分類菌株則通過對前導序列末端、來源于新噬菌體的間隔區(qū)的分析來完成[47]。因此，深入解析CRISPR位點的保守性及特異性是將其作為有效分型方法的前提。

2.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)應用于食品病原微生物的控制

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）通常作為乳制品的發(fā)酵微生物被廣泛應用于工業(yè)生產中，而噬菌體的侵染會導致乳制品污染及腐敗[43]。早期報道乳酸菌能夠通過自然進化形成具有抵御病原噬菌體的防御機制[48]。近年來，隨著對乳酸菌CRISPR位點的深入探索，不同菌株中的特異CRISPR位點為乳酸菌的防御機制進化提供證據(jù)，同時也為解決乳酸菌在食品生產過程的腐敗問題提供新的視角[49-50]。作為同型發(fā)酵乳酸菌——嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），其分化于致病性Streptococcus種，但出現(xiàn)退化及缺失與病毒有關的特性。研究者通過將S. thermophilus反復暴露于潛在噬菌體的威脅下，而后在自然條件下篩選獲得噬菌體間隔區(qū)的抗性的菌株，最終得到S. thermophilus噬菌體抗性突變菌株（bacteriophage-insensitive mutants，BIMs）[51]。這種非人工轉基因的自然進化方式所獲得菌株能夠廣泛應用于乳制品及其他食品生產中。而通常被廣泛用于工業(yè)生產酶、維生素及抗生素等的革蘭氏陽性細菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）能夠通過構建來源于嗜熱鏈球菌的Cas9及噬菌體SPP1的間隔區(qū)來獲得具有活性的外源CRISPR-Cas系統(tǒng)，從而具備抵御噬菌體侵染的能力，為解決工業(yè)生產中噬菌體污染問題提供思路[52]。

3 影響CRISPR-Cas9系統(tǒng)基因編輯效率的因素

CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因編輯效率在應用中受到多個因素的影響。首先，進行靶基因gRNA設計時需要考慮脫靶效應[53-54]。盡管目前關于gRNA的設計可以借助CRISPy（http://staff.biosustain.dtu.dk/laeb/crispy_yeast）、E-CRISP（http://www.e-crisp.org）、CRISPRdirect（http://crispr.dbcls.jp）等網(wǎng)站、軟件[55]，在一定程度上幫助降低脫靶效應，但是其他因素，如目標序列的長度、序列的互補性、發(fā)生錯配的堿基個數(shù)、目標序列“種子序列（seed region）”的長度、PAM（protospacer adjacent motifs）序列的種類及由DNA和RNA造成的“凸起效應”等均會影響其編輯效率[56-58]。而在以同源重組為主要DNA修復機制的微生物中，通過對全基因組測序后，推測基因組中單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）并非來源于Cas9酶切造成的gRNA脫靶，可能與參考基因組注釋有關[17,19]。目前，降低脫靶效應的有效方法之一是采用突變型Cas9切口酶。野生型Cas存在RuvC、HNH兩個內切酶活性結構域，分別負責切割單鏈DNA。其中，任何一個活性結構域的突變都會造成Cas只能切割DNA單鏈而成為切口酶（Cas9n）。而在此系統(tǒng)中，采用成對的gRNA與Cas切口酶結合的雙切口法能夠有效增加編輯位點的特異性，從而降低脫靶效應[59]。同時，來源于化膿鏈球菌Cas9的不同突變體的篩選也能夠顯著降低細胞內脫靶效應[60]；除此之外，遵循一定標準，設計gRNA也能夠在一定程度上降低脫靶的發(fā)生[61-62]。

其次，采用不同啟動子構建gRNA載體時也會影響其編輯效率。如在多倍體工業(yè)酵母ATCC 4124中，采用非tRNA啟動子PSNR52不能有效靶向目標基因，而采用tRNAPro能夠有效實現(xiàn)目的基因編輯[17]。通常情況下，gRNA在RNA聚合酶Ⅲ型啟動子下轉錄而成。RNA聚合酶Ⅱ型啟動子由于負責mRNA的合成，會造成gRNA的修飾加工，最終因改變gRNA結構不能實現(xiàn)CRISPR-Cas系統(tǒng)的功能。因此，RNA聚合酶Ⅱ啟動子不能直接參與gRNA的轉錄，而采用RNA聚合酶Ⅲ與RNA聚合酶Ⅱ結合啟動子能夠實現(xiàn)高編輯效率，或在核酶的幫助下自催化剪切為成熟gRNA[30]。

第三，有研究者發(fā)現(xiàn)Cas9的表達水平也會造成CRISPR-Cas9系統(tǒng)基因編輯效率的差異[30]。如采用超表達質粒提高Cas酶的表達水平能夠顯著提高敲除效率[18]，但是部分研究也指出過量表達Cas9會造成不必要的DSBs，從而造成致死效應。此外，CRISPR-Cas9系統(tǒng)組分的表達方式也會影響基因編輯效率。盡管組成型表達質粒能夠增加靶向基因的編輯效率，但是同時也會增加脫靶水平，導致基因編輯效率降低。

4 結 語

由于具備低成本、高效率且操作簡便等顯著優(yōu)勢，CRISPR-Cas9系統(tǒng)目前已獲得研究者的廣泛關注及應用。但是，也存在很多問題需要闡釋及許多未知方面需要探索。

首先，目前來源于S. pyogenes中的CRISPR-Cas9系統(tǒng)研究較為透徹，但是自然界中其他類型CRISPR-Cas系統(tǒng)及其亞型的信息尚未被深刻認識。就PAM區(qū)為例，目前采用NGG形式的序列較為廣泛，但是其他細菌提供的PAM序列可能幫助擴大基因組靶向位點，如，嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）為5’-NNAGAAW，腦膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）為5’-NNNNGATT[63-64]。因此，針對不同CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究應當不斷深入。除此之外，不同Cas9突變體的發(fā)現(xiàn)也為CRISPR-Cas系統(tǒng)的深入研究提供依據(jù)[18]。

其次，采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)編輯基因時，突變體的篩選方法需要優(yōu)化。當前篩選突變體的方法主要包括兩方面，當靶基因的突變造成表型的顯著差異時，通過表型（如營養(yǎng)缺陷或菌落顏色）等能夠有效篩選得到突變體，但是大部分基因的篩選只能通過PCR擴增及測序完成，從而造成篩選工作量的增加。因此，建立一套簡便及高效的篩選方法將為CRISPR-Cas9系統(tǒng)在高通量基因篩選的應用中提供廣闊平臺。

第三，隨著不同微生物全基因組測序的完成，如何高效快速進行基因功能解析成為研究者亟欲解決的問題之一。目前，針對小鼠及人類的sgRNA敲除文庫分別構建87 897、64 751 個gRNA，從而實現(xiàn)了高通量功能基因的篩選[64-65]。因此，結合微生物領域研究方向，可以通過構建基于代謝途徑的gRNA文庫，篩選新型蛋白或了解生物體代謝途徑及基因的作用機制。此外，在微生物育種中，CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠幫助開展定向育種工作，培育抗逆、高產某代謝物的菌種，在一定程度上加快菌種育種速度。

綜上，CRISPR-Cas9系統(tǒng)基因編輯技術，憑借其快速、高效、簡便等優(yōu)勢迅速成為21世紀后期基因功能研究的熱點工具。因此，隨著越來越多的深入研究，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在微生物合成代謝途徑中的關鍵作用，將為推動食品生物技術及代謝工程領域的快速發(fā)展提供新機會。

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Progress in CRISPR-Cas System Application in Food Microbiology

ZHANG Yujie1, SONG Yuyang1,2, QIN Yi1,2,*, LIU Yanlin1,2,*
(1. College of Enology, Northwest A & F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Engineering Research Center for Wine and Viticulture, Yangling 712100, China)

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-associated protein 9 nuclease (Cas9) system has been widely applied in genome editing in microbiology due to its high efficacy, versatility and easy programmability. Herein, we review its applications in the field of food microbiology, especially in food fermentation and pathogenic microbiology. Also, the major factors affecting the genome editing efficacy and future perspectives for the development of this system are discussed. Finally, this review is expected to provide references for research in food microbiology by using CRISPR-Cas9 system.

CRISPR-Cas system; food microbiology; genome editing

10.7506/spkx1002-6630-201711043

TS201.3

A

1002-6630（2017）11-0269-07引文格式：

2016-05-16

國家自然科學基金面上項目（31571812）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31301541）；國家現(xiàn)代農業(yè)（葡萄）產業(yè)技術體系建設專項（CARS-30-jg-3）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目（QN2013021）

張玉潔（1991—），女，碩士研究生，研究方向為葡萄酒微生物。E-mail：zhangdreamer333@163.com

*通信作者：秦義（1982—），男，副教授，博士，研究方向為釀酒微生物。E-mail：qinyi@nwsuaf.edu.cn劉延琳（1966—），女，教授，博士，研究方向為葡萄酒及釀酒微生物。E-mail：yanlinliu@nwsuaf.edu.cn