系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關血栓性微血管病血管內(nèi)皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化的研究

周 穎 陳櫻花 張明超 梁少姍 楊 帆 涂義姚 鮑 浩 劉志紅 胡偉新

系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關血栓性微血管病血管內(nèi)皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化的研究

周 穎*陳櫻花*張明超 梁少姍 楊 帆 涂義姚 鮑 浩 劉志紅 胡偉新

目的：探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關血栓性微血管病(SLE-TMA)腎間質(zhì)血管內(nèi)皮細胞表型變化及其與血管病變和間質(zhì)纖維化之間的關系。 方法：30例經(jīng)腎活檢明確診斷的SLE-TMA患者，根據(jù)血管組織學改變分為急性TMA和慢性TMA，以正常腎組織血管為對照。內(nèi)皮細胞CD31、血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)采用間接免疫熒光雙重染色定位，免疫組織化學染色和Image-Pro-Plus 6.0測量上述分子的表達量，以平均光密度表示其表達強度。Aperio圖像分析系統(tǒng)測量腎間質(zhì)纖維化面積。 結(jié)果：間接免疫熒光雙重染色顯示正常血管內(nèi)膜無α-SMA表達，SLE-TMA血管內(nèi)皮細胞表達α-SMA。與正常對照組相比，急性TMA組血管內(nèi)皮CD31和VE-cadherin表達降低(P<0.05)，α-SMA表達則顯著增高(P<0.01)；慢性TMA組內(nèi)皮細胞CD31、VE-cadherin和TGF-β表達強度均顯著低于急性TMA組和正常血管組(P<0.01)，α-SMA表達更高(P<0.01)。腎間質(zhì)血管α-SMA平均光密度與腎間質(zhì)纖維化面積呈顯著正相關(r=0.439，P=0.015)，而CD31平均光密度與腎間質(zhì)纖維化呈顯著負相關(r=-0.458，P=0.011)。 結(jié)論：SLE-TMA血管內(nèi)皮細胞正常標記物表達減少而α-SMA表達增加，表明內(nèi)皮細胞向成纖維細胞表型轉(zhuǎn)變，且表達量的變化與血管病變進展相關；腎血管內(nèi)皮細胞CD31表達減少和α-SMA增加與腎間質(zhì)纖維化相關。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡 血栓性微血管病 內(nèi)皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化 血管病變 間質(zhì)纖維化

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)可并發(fā)血栓性微血管病(TMA)，且絕大多數(shù)與免疫復合物性狼瘡性腎炎(LN)并存[1]，造成嚴重腎功能損害，甚至需要腎臟替代治療(RRT)。由于國內(nèi)外對SLE-TMA的機制缺乏深入研究，迄今缺乏有效的治療手段。研究發(fā)現(xiàn)Ⅳ型伴TMA的LN的2年腎臟存活率僅39%，而無TMA的LN 10年腎臟存活率達85%[2]。TMA已成為LN患者進展為終末期腎病(ESRD)最主要的危險因素之一，是影響LN患者腎臟遠期預后的關鍵因素[3]。臨床迫切需要對SLE-TMA的發(fā)病機制進行深入研究，在此基礎上尋找到有效的治療方法。

SLE-TMA血管內(nèi)皮細胞腫脹剝脫、內(nèi)皮下黏液樣水腫，腔內(nèi)血栓，管腔堵塞；血管病變進展，則出現(xiàn)血管內(nèi)膜纖維性增生，管腔狹窄或閉鎖，導致腎小球缺血和間質(zhì)纖維化[4]。內(nèi)皮細胞損傷是血管TMA發(fā)生的關鍵。近年研究發(fā)現(xiàn)在心臟[5]、肺[6]和腎臟[7]等的血管內(nèi)皮損傷過程中存在內(nèi)皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化(EndMT)，后者參與以上組織的纖維化。我們推測SLE-TMA的血管內(nèi)皮細胞損傷也存在EndMT，且與血管內(nèi)膜纖維化相關。因此，本文觀察SLE-TMA患者腎間質(zhì)血管內(nèi)皮細胞CD31、血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)的表達變化及其與血管病理改變的關系，探討EndMT是否參與TMA病變的發(fā)生和發(fā)展，同時分析病變血管內(nèi)皮細胞標志物表達量變化及其與間質(zhì)纖維化相關性。

對象和方法

病例選擇 2010年1月至2014年9月在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腎臟科經(jīng)腎活檢確診的30例伴TMA的LN，均符合1997年美國風濕病學會SLE診斷標準[8]，腎活檢病理顯示為增殖型LN及間質(zhì)血管TMA。除外藥物(如環(huán)孢素、他克莫司)、硬皮病或惡性高血壓等引起的TMA。另取性別、年齡匹配的腎癌切除腎的癌旁正常腎組織為正常對照組。

腎組織病理 LN的病理分型參照2003年ISN/RPS分型標準[9]。腎血管急性TMA表現(xiàn)為腎間質(zhì)小動脈(包括入球動脈、小葉間動脈或葉間動脈)內(nèi)皮細胞腫脹，剝脫，內(nèi)皮下增寬呈黏液樣改變，腔內(nèi)可見血栓或紅細胞碎片，可見管壁壞死。慢性TMA表現(xiàn)為血管內(nèi)膜纖維性增生，內(nèi)膜增厚分層，呈“洋蔥皮”樣改變，管腔狹窄或閉塞[4]。 免疫熒光檢查病變血管壁無明顯免疫球蛋白沉積。腎組織活動性指數(shù)(AI)及慢性化指數(shù)(CI)參照文獻[10]評分。

腎組織免疫組織化學染色 腎組織石蠟切片脫蠟至水；高溫修復10 min；10%小牛血清室溫封閉10 min；分別滴加一抗CD31抗體、VE Cadherin抗體、α-SMA抗體、TGF-β抗體室溫孵育2h；滴加二抗室溫孵育30 min；DAB顯色，蘇木素染核后封片。

腎組織間接免疫熒光雙重染色 腎組織石蠟切片脫蠟至水；高溫修復10 min；10%小牛血清室溫封閉10 min；分別將CD31抗體或VE-cadherin抗體與α-SMA抗體混合、CD31抗體或VE-cadherin抗體與TGF-β抗體混合，分別滴加于腎組織上，室溫孵育2h；滴加FITC標記的二抗與TRITC標記的二抗混合后滴加于腎組織上，室溫孵育30 min，封片后激光共聚焦顯微鏡下觀察。

血管內(nèi)皮細胞分子表達定量分析 免疫組化染色切片于光鏡下觀察血管CD31、VE-cadherin、α-SMA和TGF-β的表達情況，數(shù)碼相機分別獲取20條急性TMA和慢性TMA血管及來自10例正常腎組織間質(zhì)的20條正常對照腎血管的4種分子標志物400倍鏡下的照片。Image-Pro-Plus 6.0軟件分別測量血管內(nèi)皮CD31、VE-cadherin、α-SMA和TGF-β積分光密度(IOD)，并計算平均光密度(MD)，即IOD/血管內(nèi)皮細胞層面積)，以MD表示其表達強度。

間質(zhì)纖維化面積 Masson三色染色切片，采用Aperio Image Scope定量分析系統(tǒng)測量腎間質(zhì)纖維化面積[11]。腎組織切片掃描及定量分析分別由一位病理醫(yī)師單獨完成(單盲)。

臨床指標及實驗室檢查 包括年齡、性別、受累臟器損害、血壓、24h尿蛋白定量、血清白蛋白、血清肌酐、血清乳酸脫氫酶、外周血紅細胞碎片、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)。免疫學指標包括補體C3、補體C4、ANA、抗ds-DNA抗體、抗C1q抗體和抗磷脂抗體。

圖1 CD31與α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)雙套色共聚焦顯微鏡(×400)A1～3為正常血管：內(nèi)皮層僅表達綠色的CD31(A1、A3)，呈連續(xù)線狀，無α-SMA表達;B1～3為SLE-TMA血管：內(nèi)皮層CD31表達減弱且不連續(xù)(A1)，見α-SMA強陽性，內(nèi)皮下區(qū)域也見少量CD31和α-SMA陽性細胞(B1，B2)；CD31與α-SMA雙套色(B3)見內(nèi)皮層細胞為大量CD31與α-SMA共表達細胞(黃色)，少量僅表達α-SMA(紅色)，內(nèi)皮下也見少量CD31與α-SMA共表達細胞和α-SMA陽性細胞；腎小球血管袢和管周毛細血管CD31陽性細胞為主，見極少細胞CD31與α-SMA共表達；↑：腎組織內(nèi)的小動脈

統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。以單樣本Kolmogorov-Smirnov Z檢驗對數(shù)據(jù)進行正態(tài)檢驗。所有計量資料，以均數(shù)±標準差或中位數(shù)(四分位間距)表示，組間比較應用方差分析或Kruskal-Wallis H檢驗；計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用卡方檢驗。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Pearson相關系數(shù)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Spearman相關系數(shù)評價變量間的相關性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為統(tǒng)計學差異顯著。

結(jié) 果

臨床和腎臟病理資料 30例SLE-TMA患者中27例存在高血壓，SLE-DAI為(16.4±5.0)分，尿蛋白定量(4.3±2.4) g/24h，26例急性腎損傷，平均SCr (282.9±194.5) μmol/L，其中14例需急診RRT治療。30例均有貧血(平均血紅蛋白71±13 g/L)，23例血小板減少(平均79±40×109/L)。28例C3降低，18例C4降低， 18例抗ds-DNA陽性，16例抗磷脂抗體陽性。24例外周血紅細胞碎片陽性，7例伴中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累。

LN病理類型Ⅳ型和Ⅳ+Ⅴ型分別有21例和9例， 8例有袢內(nèi)血栓，AI (7.9±2.9)分，CI (2.5±2.1)分。間質(zhì)血管急性、慢性和急性伴慢性TMA各10例。

血管內(nèi)皮標記的定性觀察 免疫熒光雙套染色顯示正常血管內(nèi)膜CD31和VE-cadherin呈強陽性類線性表達，TGF-β弱表達，α-SMA無表達。在TMA血管，α-SMA與CD31或VE-cadherin共表達于內(nèi)皮細胞(圖1)。免疫組化染色顯示急性TMA血管內(nèi)膜CD31和VE-cadherin表達減弱，α-SMA散在表達；慢性TMA內(nèi)膜CD31和VE-cadherin表達進一步減弱，α-SMA表達增強。急性和慢性TMA血管內(nèi)膜TGF-β表達均減弱(圖2)。

圖2 光鏡下正常血管、急性TMA和慢性TMA血管(A1、B1：Masson三色，×400；C1：PASM-Masson，×400)；免疫組化染色：急性TMA血管內(nèi)皮層CD31(B2)和VE-cadherin(B3)表達減弱且不連續(xù)，α-SMA(B4)表達增強；慢性TMA血管內(nèi)皮層CD31(C2)和VE-cadherin(C3)表達進一步減弱，α-SMA(C4)表達更強；TMA血管內(nèi)皮CD31、VE-cadherin和α-SMA表達不僅局限于內(nèi)皮層，內(nèi)皮下也見陽性表達，表明內(nèi)皮細胞增生、分層(IH，×400)TMA：血栓性微血管??；α-SMA:α平滑肌肌動蛋白；VE-cadherin：血管內(nèi)皮鈣黏蛋白；↑：腎組織內(nèi)的小動脈

血管內(nèi)膜分子表達量與血管病變的聯(lián)系 與正常血管相比，急性TMA血管內(nèi)皮CD31(P=0.013)、VE-cadherin(P=0.007)和TGF-β(P=0.01)表達水平顯著降低，α-SMA表達水平顯著增高(P<0.01)；慢性TMA血管內(nèi)皮細胞CD31、VE-cadherin和TGF-β表達水平降低(P<0.01)，α-SMA表達水平顯著增高(P<0.01)。慢性TMA血管內(nèi)膜CD31(P=0.02)和TGF-β(P<0.01)表達水平顯著低于急性TMA，α-SMA表達增高，水平高于急性TMA，但無統(tǒng)計學差異(P=0.09)(圖3)。

血管內(nèi)皮細胞分子表達與間質(zhì)纖維化的關系 30例SLE-TMA腎組織平均腎間質(zhì)纖維化為16.0%±7.8%。定量分析TMA血管內(nèi)皮CD31、VE-cadherin、α-SMA和TGF-β表達量與腎間質(zhì)纖維化的關系，發(fā)現(xiàn)腎間質(zhì)血管CD31平均表達量與腎間質(zhì)纖維化呈顯著負相關(r=-0.458，P=0.011)，α-SMA平均表達量與腎間質(zhì)纖維化面積呈顯著正相關(r=0.439，P=0.015)(圖4)。

圖3 狼瘡性腎炎伴TMA不同類型血管病變血管內(nèi)皮細胞分子表達VE-cadherin：血管內(nèi)皮鈣黏蛋白；α-SMA：α平滑肌肌動蛋白；TGF-β：轉(zhuǎn)化生長因子β

圖4 腎間質(zhì)血管CD31和α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達與間質(zhì)纖維化的關系

討 論

SLE-TMA發(fā)生的關鍵是內(nèi)皮細胞損傷，SLE-TMA絕大多數(shù)與免疫復合物沉積導致的腎小球腎炎并存，本文重點觀察免疫復合物性LN(Ⅳ型或Ⅳ+Ⅴ型)合并TMA患者腎間質(zhì)小動脈內(nèi)皮細胞損傷在TMA發(fā)生及發(fā)展中的病理作用，以血管內(nèi)皮細胞CD31和VE-cadherin及α-SMA、TGF-β的表達反映血管內(nèi)皮細胞功能表型的變化，發(fā)現(xiàn)SLE-TMA病變血管內(nèi)皮細胞的正常標記CD31和VE-cadherin分子表達減弱，并出現(xiàn)α-SMA的表達，且隨著血管病變慢性化的進展，內(nèi)皮細胞正常標記進一步減弱，α-SMA表達更強，表明SLE-TMA的發(fā)生及發(fā)展過程存在EndMT，同時發(fā)現(xiàn)腎間質(zhì)血管內(nèi)皮CD31和α-SMA表達水平與間質(zhì)纖維化相關。

EndMT是指在特定的生理和病理條件下，內(nèi)皮細胞特異性標志物丟失，而重新獲得間充質(zhì)細胞標志物，進而轉(zhuǎn)換成有活力的間充質(zhì)細胞的過程[12]。發(fā)生EndMT的內(nèi)皮細胞極性發(fā)生變化，粘附和緊密連接損傷，出現(xiàn)表型和功能的明顯改變，逐漸演變成間充質(zhì)細胞[13]，具有致纖維化作用。來源于纖維化疾病不同組織的人內(nèi)皮細胞的體外研究[14-15]，纖維化疾病動物模型研究[5-7]及對不同纖維化疾病患者[16-17]的組織分析均顯示EndMT在多個組織的纖維化過程發(fā)揮了重要作用。本研究首先采用免疫熒光雙套色證明了正常腎血管內(nèi)膜CD31和VE-cadherin呈強陽性表達，無α-SMA表達，在已發(fā)生TMA的血管內(nèi)膜，α-SMA表達顯著增強，正常表達CD31或VE-cadherin的內(nèi)皮細胞數(shù)量顯著減少，出現(xiàn)α-SMA與CD31或VE-cadherin共表達。免疫組化染色證明了在急性TMA血管內(nèi)皮細胞CD31和VE-cadherin表達減弱，α-SMA表達增強，表明內(nèi)皮細胞表型發(fā)生了改變，而TMA病變進展至內(nèi)膜纖維化時，CD31和VE-cadherin表達進一步減少，甚至消失，α-SMA表達更強，表明在SLE-TMA血管病變發(fā)生及進展過程中，存在內(nèi)皮細胞向成纖維細胞表型轉(zhuǎn)變，即EndMT參與了血管病變的發(fā)生和進展過程。發(fā)生EndMT時，血管內(nèi)皮細胞正常標記表達減少，細胞與細胞間的連接能力減弱或丟失，可能與SLE-TMA急性期所見的內(nèi)皮下疏松、內(nèi)皮細胞剝脫和內(nèi)膜黏液樣水腫等病變相關。當內(nèi)皮細胞獲得了成纖維細胞標記，便具有致纖維化作用，從而導致血管內(nèi)膜纖維性增生。肺動脈高壓患者血管病變的研究顯示內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的特異標志物共表達于肺小動脈內(nèi)皮細胞，內(nèi)皮來源的間充質(zhì)細胞導致受累血管內(nèi)皮下纖維組織的產(chǎn)生和聚集，EndMT參與了肺血管的纖維化[16]。因此，EndMT可能既損傷了血管內(nèi)皮，又誘導了血管內(nèi)膜的纖維化，是SLE-TMA發(fā)生和發(fā)展的關鍵過程。TGF-β是重要的致纖維化細胞因子，也是介導EndMT的重要介質(zhì)[18-19]。但本研究發(fā)現(xiàn)在明確TMA的血管內(nèi)膜TGF-β表達反而減弱，可能由于絕大部分SLE-TMA腎活檢時血管病變已非早期，隨著內(nèi)皮細胞損傷加重，逐漸發(fā)生纖維化，TGF-β表達減弱。除TGF-β外，多個信號通路如Wnt、Notch和Hedgehog都參與EndMT的發(fā)生，且受多種分子如Caveolin-1和Endothelin-1的調(diào)節(jié)[20]。因此，介導SLE-TMA血管EndMT的發(fā)生機制需要進一步研究。

本研究觀察到SLE-TMA腎間質(zhì)血管內(nèi)皮α-SMA表達水平與腎間質(zhì)纖維化呈正相關， CD31與間質(zhì)纖維化呈負相關，表明血管內(nèi)皮EndMT與SLE-TMA患者的腎間質(zhì)纖維化相關。分析可能與α-SMA表達增強，導致血管內(nèi)膜纖維化、管腔狹窄，進而導致小管損傷和間質(zhì)纖維化有關。在多個腎臟纖維化模型包括單側(cè)輸尿管梗阻、糖尿病腎病和Alport綜合征小鼠模型的研究顯示30%～50%的成纖維細胞來源于內(nèi)皮細胞[7]。對糖尿病腎病患者腎組織的分析也顯示CD31和α-SMA共表達于腎小球內(nèi)皮細胞[17]，表明EndMT參與了腎臟纖維化過程。由于本組病例TMA主要累及間質(zhì)小動脈，腎小球及管周毛細血管僅見極少量CD31或VE-cadherin與a-SMA共表達，表明腎小球及管周毛細血管內(nèi)皮也存在EndMT，它們與腎小球硬化和間質(zhì)纖維化間的相關性有待進一步研究。

小結(jié)：SLE-TMA腎血管病變發(fā)生及進展存在內(nèi)皮細胞正常標記表達減少，α-SMA表達增加，表明內(nèi)皮細胞向成纖維細胞表型轉(zhuǎn)變，而且內(nèi)皮細胞表型變化與腎間質(zhì)纖維化相關，但介導內(nèi)皮細胞向成纖維細胞表型轉(zhuǎn)變的機制還需進一步研究。

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(本文編輯 凡 心)

Renal vascular endothelial-mesenchymal transition in systemic lupus erythematosus associated thrombotic microangiopathy

ZHOUYing*,CHENYinghua*,ZHANGMingchao,LIANGShaoshan,YANGFan,TUYiyao,BAOHao,LIUZhihong,HUWeixin

NationalClinicalResearchCenterofKidneyDiseases,JinlingHospital,NanjingUniversitySchoolofMedicine,Nanjing210016,China

*ZHOUYingandCHENYinghuaareconsideredtobefirstauthors

HUWeixin(E-mail：huwx@vip.163.com)

Objective：To investigate the phenotypic changes of renal vascular endothelial cells and its relationship with the vascular injury and renal interstitial fibrosis in patients with systemic lupus erythematosus associated thrombotic microangiopathy (SLE-TMA). Methodology：Biopsies from thirty SLE patients with lupus nephritis and renal vascular TMA were included in this study. Renal vascular TMA lesions were divided into acute and chronic TMA according to histology by light microscopy. Normal renal tissue from nephrectomized kidney of renal cancer was used as normal control. The expression of renal vascular endothelial CD31, vascular endothelial cadherin (VE-cadherin), α-smooth muscle actin (α-SMA) and transforming growth factor-β (TGF-β) were stained with immunofluorescence and immunohistochemical assays, and computer-assisted image analysis Image-Pro-Plus 6.0 and ImageScope (Aperio) were used to quantitatively analyze the intensity of endothelial marker expression recorded as the mean density (integral optical density/area of vascular endothelial layer) and the extent of renal interstitial fibrosis respectively. Results：Confocal immunofluorescence microscopy showed increased expression of α-SMA in the vascular endothelial cells in SLE-TMA, while negative endothelial α-SMA expression in normal control．Compared with the normal group, the endothelial expressions of CD31 and VE-cadherin were both significantly reduced in acute TMA group (P<0.05), whereas the expression of α-SMA increased significantly (P<0.01). The endothelial CD31, VE-cadherin and TGF-β expressions were significantly lower, while α-SMA expression was significantly higher in chronic TMA group than that in other two groups (P<0.01). The mean density of endothelial α-SMA expression was positively correlated with (r=0.439，P=0.015), while the expression of endothelial CD31 was negatively correlated with the extent of renal interstitial fibrosis significantly (r=-0.458，P=0.011). Conclusion：Renal vascular endothelial to mesenchymal transition was found in SLE-TMA, which was associated with the renal interstitial fibrosis.

systemic lupus erythematosus thrombotic microangiopathy endothelial-mesenchymal transition vascular injury renal interstitial fibrosis

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2017.01.004

國家自然科學基金面上項目(81470042)；國家科技支撐計劃(2013BAI09B04，2015BAI12B05)

南京大學醫(yī)學院附屬金陵醫(yī)院(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院)腎臟科 碩士研究生(周 穎)，國家腎臟疾病臨床醫(yī)學研究中心 全軍腎臟病研究所(南京，210016)；*周 穎和陳櫻花為共同第一作者

胡偉新(E-mail：huwx@vip.163.com)

2016-10-19

? 2017年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有