人臍血間充質(zhì)干細胞在大鼠急性肝損傷修復(fù)中的作用

李培杰, 王 佳,李偉之,馬富權(quán),郭雯瑩,齊 麗,薛 揮

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(西安 710061)

△通訊作者

人臍血間充質(zhì)干細胞在大鼠急性肝損傷修復(fù)中的作用

李培杰, 王 佳,李偉之,馬富權(quán),郭雯瑩,齊 麗,薛 揮△

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(西安 710061)

目的：探討經(jīng)外周靜脈途徑移植人臍血間充質(zhì)干細胞(hUCBMSCs)對急性肝損傷大鼠肝臟功能及組織的修復(fù)作用。方法：使用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法體外培養(yǎng)人臍血間充質(zhì)干細胞。44只雌性SD大鼠隨機地分為四組,每組11只：正常組(N組)、單純移植組(NT組)、損傷組(I組)、移植治療組(IT組)。I組和IT組在移植前24 h腹腔注射50% CCl4溶液(3 ml/kg)，N組、NT組腹腔注射等量的生理鹽水。造模后24 h，使用DAPI標記第3代hUCBMSCs,NT組、IT組大鼠經(jīng)外周靜脈途徑移植入(5～6)×106個hUCBMSCs,N組、I組大鼠注入1 ml生理鹽水。在造模前、造模后24 h，移植后第3天、第7天、第14天，收集血清檢測ALT和AST；移植后第3天、第7天，各組分別處死3只大鼠，第14天處死剩余大鼠，取肝臟組織行病理染色及冰凍切片，觀察大鼠肝臟組織的病理學(xué)變化以及hUCBMSCs 在肝臟內(nèi)的遷移定植情況。移植后第14天，取IT組和NT組的肝臟組織進行免疫組織化學(xué)染色，檢測大鼠肝臟中人源性肝細胞特異性抗原(HSA)的表達。結(jié)果：造模后24 h，I組和IT組血清ALT和AST水平明顯升高，與N組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。與損傷組(I)相比，移植治療組(IT)的肝臟病理學(xué)損傷恢復(fù)速度明顯加快，移植后第14天接近于正常。無論在移植后的第3天、第7天還是第14天，IT組藍色熒光標記的細胞數(shù)均多于NT組(P均<0.05)。在移植后的第3天，hUCBMSCs主要位于匯管區(qū)的周圍，第7天和第14天主要定植于肝實質(zhì)中。移植后第14天，IT組、NT組大鼠的肝組織中均可見紅色熒光標記的人源性肝細胞特異性抗原(HSA)，IT組的陽性細胞數(shù)(35±7.3)個明顯多于NT組(7±3.4)個(t=1.377，P<0.05)。結(jié)論：肝臟受損后形成的微環(huán)境能夠促使hUCBMSCs向受損肝組織中遷移、定植，并誘導(dǎo)其橫向分化為肝樣細胞來修復(fù)肝臟功能及組織。

目前肝移植仍然是治療急慢性肝臟功能衰竭最為有效的方法，但其廣泛應(yīng)用受到供體肝缺乏、免疫排斥反應(yīng)以及長期服用免疫抑制劑等方面的限制。近年來,隨著再生醫(yī)學(xué)以及干細胞技術(shù)的發(fā)展,以干細胞為基礎(chǔ)的細胞移植治療為廣大急慢性肝功能衰竭患者帶來了新曙光。間充質(zhì)干細胞因其來源廣泛，增值分化能力強,能夠參與免疫調(diào)節(jié),且較少涉及倫理問題,在特定條件下,可以分化為脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞以及心肌細胞、神經(jīng)細胞、肝細胞等,故大量用于實驗及臨床研究[1]。本實驗采用人臍血間充質(zhì)干細胞(hUCBMSCs)經(jīng)尾靜脈移植入CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠體內(nèi),觀察移植后大鼠的肝臟功能及病理學(xué)變化。

材料和方法

1 材 料 DMEM/F12、DMEM/H 培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone公司)，人成纖維細胞生長因子(FGF)(美國PeproTech公司)，CD34-PE、CD105-FITC單抗(美國eBioscience公司)，鼠抗人HSA單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)，流式細胞儀(美國BD公司)。健康SPF 級雌性SD大鼠44只,6～7周齡,體重190～220 g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。臍血標本取自我院健康產(chǎn)婦足月妊娠剖宮產(chǎn)新生兒臍帶血,均取得產(chǎn)婦及家屬知情同意。

2 實驗方法 ①hUCBMSCs的分離和體外培養(yǎng)：無菌操作采集臍血,密度梯度離心法(人淋巴細胞分離液 1.077 g/L)分離得到臍血單個核細胞,以5×106/cm2接種于T25培養(yǎng)瓶中,每瓶加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基10 ml,置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中,5 d后首次換液,以后每3 d換液1次,當細胞融合達到80%以上時,用0.05%胰酶消化傳代(1∶3)。②hUCBMSCs的鑒定：取第3代細胞(P3),采用熒光標記小鼠抗人單克隆抗體CD34-PE、CD105-FITC,流式細胞儀檢測；取第2代細胞(P2),0.05%胰酶消化后離心,重懸后種植于6孔板中,陽性組用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,陰性組繼續(xù)用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基,每4 d換液1次,21 d后行茜素紅染色。③大鼠急性肝損傷模型的制備：將44只SPF級的健康雌性SD大鼠隨機地分為四組(每組11只)：正常組(N組)、單純移植組(NT組)、損傷組(I組)、移植治療組(IT組)。I組和IT組在移植前24 h給予腹腔注射50% 的CCl4-橄欖油(3 ml/kg)誘導(dǎo)急性肝損傷，N組和NT組給予腹腔注射等量的生理鹽水。④hUCBMSCs移植：移植前24 h,將DAPI標記第3代hUCBMSCs共培養(yǎng),并計算標記陽性率。造模后24 h,NT組和IT組經(jīng)外周靜脈途徑(尾正中靜脈)移植入(5～6)×106個hUCBMSCs，N組和I組大鼠注入1 ml生理鹽水。

3 觀察指標及檢測方法 ①在造模前以及造模后24 h,移植后的第3天、第7天、第14天,從大鼠的內(nèi)眥靜脈叢采血并分離血清,檢測肝功指標ALT和AST；②移植后的第3 天和第7 天，各組分別處死3只大鼠，第14天處死剩余大鼠，取肝臟組織行病理染色觀察肝臟組織的病理學(xué)變化；③NT組和IT組大鼠在移植后的第3天、第7天、第14天，取肝臟組織制作冰凍切片,觀察hUCBMSCs 在肝臟內(nèi)的遷移、定植情況；NT組和IT組大鼠在移植后第14天,取肝臟組織進行鼠抗人HSA單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色,檢測大鼠肝臟中人源性HSA的表達。

結(jié) 果

1 hUCBMSCs的分離培養(yǎng)鑒定 通過密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法從人類臍血中分離純化出一組形態(tài)均一的呈長梭形渦旋樣生長的細胞，該組細胞高表達間充質(zhì)干細胞的表面標志CD105(97.5%)，低表達造血干細胞的表面標志CD34(4.3%)；且經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，出現(xiàn)鈣鹽沉積，并能夠被茜素紅染成紅色(見圖1、2)。

圖1 P3 hUCBMSCs 的表面標記

圖2 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d(×200)

2 肝功指標ALT和AST結(jié)果 見表1。在造模后24 h，I組和IT組血清中ALT和AST水平明顯升高，與N組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；造模后第4天，無論是否進行細胞移植，I組和IT組均基本恢復(fù)正常，與N組相比均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠不同時段血清ALT、AST水平(U/L)

注：與N組同時段比較，*P<0.05

3 肝組織HE染色結(jié)果 N組和NT組在移植后的第3天、第7天、第14天無明顯變化，肝小葉的結(jié)構(gòu)完整，細胞排列規(guī)整，以中心靜脈為中心呈放射狀向周邊分布，無肝細胞壞死以及纖維組織的增生；I組在造模后的第4天，肝臟細胞明顯腫脹，肝小葉的結(jié)構(gòu)受到破壞，細胞的排列紊亂,出現(xiàn)大片的氣球樣變,在造模后的第8天、第15天受損組織恢復(fù)不明顯(圖3)；IT組在移植后的第3天可見在中央靜脈周圍的肝細胞腫脹,排列紊亂,存在較大片的氣球樣變；在移植后第7天，肝組織的病理損傷較前有所好轉(zhuǎn)，氣球樣變的范圍較前縮小，肝細胞的損傷主要位于中央靜脈的周圍，肝小葉的遠端細胞的排列接近于正常；在移植后的第14天，中央靜脈周圍的肝細胞的損傷基本消失，肝小葉的整體結(jié)構(gòu)接近于正常，細胞排列較規(guī)整，僅可見散在的氣球樣變(圖4)。

A:損傷后第4天；B:損傷后第8天；C:損傷后第15天

A：移植后第3天；B:移植后第7天；C:移植后第14天

4 肝組織冰凍切片結(jié)果 見圖5。

A: IT組移植后第3天；B:IT組移植后第7天；C:IT組移植后第14天;D:NT組移植后第3天；E:NT組移植后第7天；F:NT組移植后第14天

移植后的第3天、第7天、第14天，在400倍鏡下隨機地選擇5個無相互重疊的視野記錄兩組大鼠肝組織中的陽性細胞數(shù)，IT組藍色熒光標記的細胞數(shù)(55±8.7、38±5.8、5±1.3)均多于NT組(10±3.7、5±2.1、1±0.4)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在移植后的第3天，hUCBMSCs主要位于匯管區(qū)的周圍，部分細胞穿過血管壁間隙向肝臟實質(zhì)遷移，第7天和第14天主要定植于肝實質(zhì)中。

5 肝組織免疫熒光染色結(jié)果 移植后第14天，使用鼠抗人的HSA單克隆抗體對IT組和NT組的大鼠肝臟組織切片進行免疫熒光染色，兩組大鼠的肝組織中均可見呈紅色熒光標記的人源性肝細胞特異性抗原(HSA)，在200倍鏡下隨機地選擇5個無相互重疊的視野記錄兩組大鼠肝組織中的陽性細胞數(shù)，IT組的陽性細胞數(shù)(35±7.3)個，明顯多于NT組(7±3.4)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.377，P<0.05)(圖6)。

A：IT組；B：NT組

討 論

利用臍血中各個細胞成分的密度不同，使用密度梯度離心法將臍血中的單個核細胞分離出來；再根據(jù)間充質(zhì)干細胞在體外培養(yǎng)時具有粘附于塑料生長的特性，使用貼壁培養(yǎng)法將hUCBMSCs從單個核細胞中篩選出來；通過觀察細胞的形態(tài)、檢測表面分子標志以及多向分化能力對體外培養(yǎng)的第3代細胞進行鑒定，發(fā)現(xiàn)細胞在形態(tài)呈長梭形渦旋樣排列，高表達間充質(zhì)干細胞的表面標志CD105，低表達造血干細胞的表面標志CD34，并能夠被誘導(dǎo)分化為成骨細胞，符合國際細胞治療協(xié)會關(guān)于MSCs的認定標準[2]。

間充質(zhì)干細胞具有低免疫原性，不表達MHC-Ⅱ、CD40、CD80、CD86 等表面致免疫分子，不會激活T淋巴細胞的免疫反應(yīng)；還能夠分泌某些細胞因子以及胞間接觸，干擾抗原提呈細胞的功能，進而阻止B細胞的活化，并抑制T細胞和NK細胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)[3]。有多個研究者發(fā)現(xiàn)在體外實驗過程中，臍血來源的間充質(zhì)干細胞不僅具有低免疫原性，而且具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠抑制異種來源的免疫細胞的活性[4-5]。梁璐等[6]將DiI標記的hUCBMSCs移植到腸炎模型小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后hUCBMSCs逐漸遷移至腸道，而且移植組T細胞的百分數(shù)明顯低于模型組和對照組。這些研究為hUCBMSCs的異種移植的應(yīng)用提供了理論以及實驗上的依據(jù)。

造模后24 h，肝功指標ALT、AST明顯升高(P<0.05)，造模后第4 d基本恢復(fù)正常，但肝臟大體標本可見表面布滿出血點，質(zhì)地變韌，HE染色可見大片的氣球樣變，與其他研究者的結(jié)果相似[7]。ALT、AST為肝細胞損傷的急性標志物，而造模時僅給予肝臟一次打擊，沒有慢性的持續(xù)性損傷，因此在急性期過后轉(zhuǎn)氨酶會恢復(fù)正常，但組織學(xué)的修復(fù)是個慢性過程，需要較長的時間。

IT組在移植后第3天時， DAPI標記[8]的藍色熒光hUCBMSCs主要集中在匯管區(qū)周圍，第7天和14天時則分布在肝實質(zhì)中，考慮在移植的早期，hUCBMSCs主要完成遷移、定植的過程，于1周左右定植于肝實質(zhì)中開始發(fā)揮修復(fù)組織的作用。NT組定植的hUCBMSCs數(shù)各個觀察點均少于移IT組，考慮肝臟損傷后形成的微環(huán)境有促進hUCBMSCs歸巢的作用[9]。Liu等[10]的研究指出SDF-1既是調(diào)節(jié)組織、器官修復(fù)的重要細胞因子，又是調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)的重要趨化因子，祖細胞、干細胞、淋巴細胞、基質(zhì)細胞以及內(nèi)皮細胞等多種細胞表面均表達有SDF-1的特異性受體CXCR4，認為在肝損傷時，大量分泌的SDF-1能夠促進間充質(zhì)干細胞向肝損傷部位遷移、歸巢。在移植后第14d，NT組和IT組均能檢測到紅色熒光標記的人源性肝細胞特異性抗原(HSA)，證實hUCBMSCs在肝臟的微環(huán)境中能夠分化為人源性的肝樣細胞來修復(fù)受損的肝組織，但不能排除還有其他修復(fù)機制的存在，如旁分泌機制[11]，細胞融合機制[12]等。

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(收稿：2016-08-01)

肝細胞 藥物性肝損傷 臍血干細胞移植 大鼠

R575.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.06.007