miR-145對(duì)人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)的作用機(jī)制研究

安改麗,侯 磊,李 旭,白 俊

1.陜西省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(西安710068)，2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(西安 710061)，3.陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科(西安 710061)

miR-145對(duì)人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)的作用機(jī)制研究

安改麗1,2,侯 磊1,李 旭3,白 俊1

1.陜西省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(西安710068)，2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(西安 710061)，3.陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科(西安 710061)

目的：探討miR-145對(duì)人乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR阿霉素耐藥的影響及可能的作用機(jī)制。方法：采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)miR-145在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7及MCF-7/ADR中的表達(dá)差異；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建好的miR-145 mimics，miR-145 inhibitor成功轉(zhuǎn)染進(jìn)MCF-7/ADR細(xì)胞中，MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)耐藥細(xì)胞對(duì)阿霉素誘導(dǎo)凋亡的影響，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后抗凋亡蛋白Bcl-2、多藥耐藥基因MDR1表達(dá)蛋白P-gp的表達(dá)差異。結(jié)果：miR-145在人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/ADR中表達(dá)下降；上調(diào)miR-145可以增強(qiáng)MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，顯著抑制MCF-7/ADR細(xì)胞增殖，并促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時(shí)顯著抑制了耐藥細(xì)胞中Bcl-2和P-gp的表達(dá)。結(jié)論：miR-145通過抑制Bcl-2和P-gp蛋白的表達(dá)來增加MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性和凋亡。

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅女性的生活質(zhì)量和身心健康。以阿霉素為代表的藥物聯(lián)合化療是乳腺癌輔助化療及姑息化療的標(biāo)準(zhǔn)治療方案,但是晚期乳腺癌患者的預(yù)后仍不容樂觀，其治療失敗的原因之一就是化療耐藥的出現(xiàn)[1-2]。miRNA是一組由18～25個(gè)核苷酸組成的微小非編碼RNA，在真核生物中具有高度保守性，它通過與靶基因的3’非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶基因降解或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，從而在生物體發(fā)育、細(xì)胞分化、凋亡及腫瘤形成等多種生理及病理過程中發(fā)揮著重要的作用[3-4]。新近的多個(gè)研究均顯示miRNA參與調(diào)解腫瘤化療藥物敏感性，同時(shí)有研究對(duì)乳腺癌組織和癌旁組織的基因芯片結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miRNA在乳腺癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁組織,表明miR145作為抑癌基因能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究miR-145對(duì)乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR耐藥的影響，并探索可能的作用機(jī)制。

材料與方法

1 材 料 人乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR(南京凱基生物科技公司)；阿霉素(江蘇豪森藥業(yè))；miR-145 mimics 和inhibitor(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；miR-145引物(Takara公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；噻唑蘭(MTT)(美國(guó)Sigma公司)；Annexin V-APC/7-AAD雙染凋亡試劑盒(深圳晶美生物公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Sigma公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(Takara公司)，Bcl-2抗體、P-gp抗體(美國(guó)Cell Signal公司),Trizo試劑、脂質(zhì)體(Lipfectamin2000)(美國(guó)Invitrogen公司)

2 實(shí)驗(yàn)方法 ①細(xì)胞培養(yǎng)：人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR分別用含10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)液,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在MCF-7/ADR細(xì)胞株的培養(yǎng)液中加入終濃度為1 μg/ml的阿霉素以保持其耐藥性。②實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)miR145的表達(dá)差異：分別收集MCF-7細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞總RNA,對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA合成過程中采用miR-145 RT特異性頸環(huán)引物構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄體系,反應(yīng)條件為：37 ℃，40 min，85 ℃，5 s。采用 SYBR Green 法，以cDNA為模板,利用miR-145 特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 PCR 反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s 共 40 個(gè)循環(huán)。miR145相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算，ΔΔCt=ΔCtMCF-7/ADR-ΔCtMCF-7，ΔCt=CtmiR-145-CtU6。③細(xì)胞轉(zhuǎn)染：MCF-7細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞分別接種于6孔板。依據(jù)脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000的說明書,將100 nmol/L miR-145 mimics、inhibitor及其各自的陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染到MCF-7及MCF-7/ADR細(xì)胞中。④MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感性：上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后分別接種于96 孔板(5×103/孔,100 μl/孔)。待細(xì)胞貼壁后,分別加入終濃度為：5、10、20、40、80 μg/ml的阿霉素,100 μl/孔,每組6個(gè)復(fù)孔,將與實(shí)驗(yàn)組中含有最大濃度DMSO的培養(yǎng)液為空白對(duì)照組,不含細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基為調(diào)零孔,培養(yǎng)48 h后每孔加入MTT溶液(濃度為5 mg/ml)10 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng),小心吸去上清,每孔加入150 μl DMSO溶液,振蕩 10 min以充分溶解結(jié)晶物,用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處各孔的OD值,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及阿霉素的IC50值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組吸光度-實(shí)驗(yàn)組吸光度)/對(duì)照組吸光度×100%，應(yīng)用SPSS 軟件計(jì)算阿霉素對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。⑤ Western blot檢測(cè)Bcl-2和P-gp的表達(dá)差異：MCF-7細(xì)胞及MCF-7/ADR細(xì)胞分別接種于6孔板內(nèi)(6×105/孔),將miR-145 mimics及其陰性對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染至MCF-7/ADR細(xì)胞中,培養(yǎng)72 h后提取MCF-7細(xì)胞、MCF-7/ADR細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后MCF-7/ADR細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì),通過轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，一抗(1∶1000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，應(yīng)用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色,凝膠成像系統(tǒng)成像,Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析,以GAPDH為內(nèi)參。⑥流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：MCF-7/ADR細(xì)胞接種于6孔板(6×105/孔),將miR-145 mimics及其陰性對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染至MCF-7/ADR細(xì)胞中,培養(yǎng)24 h后每孔加入阿霉素藥物終濃度為10 μg/ml,常規(guī)培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng),按照Annexin V-FIFC試劑盒操作方法,運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

結(jié) 果

1 miR-145在MCF-7和MCF-7/ADR中的表達(dá)差異 見圖1。qRT-PCR 結(jié)果顯示與母代細(xì)胞株MCF-7比較，miR-145 在阿霉素耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR中的表達(dá)量降低，平均下調(diào)倍數(shù)為 3.84(P<0.05)。

圖1 miR-145在乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR中呈低表達(dá)

2 miR-145調(diào)節(jié)MCF-7及MCF-7/ADR細(xì)胞株對(duì)阿霉素的耐藥性 MTT結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染前,MCF-7/ADR細(xì)胞株對(duì)阿霉素的耐藥性已得到驗(yàn)證(P<0.05)(圖2)。與陰性對(duì)照組對(duì)比，轉(zhuǎn)染miR-145 mimics明顯增加了MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素的藥物敏感性(P<0.05)(圖3)。相反，轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor較其陰性對(duì)照組而言，顯著增加了MCF-7細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性(P<0.05)(圖4)。

圖2 MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性明顯增加

3 miR-145對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞中Bcl-2和P-gp蛋白表達(dá)的影響 與母代細(xì)胞MCF-7比較，Bcl-2和P-gp蛋白表達(dá)量在耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR中顯著增加(P<0.05)(圖5)。在MCF-7/ADR細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-145 mimics及其陰性對(duì)照組72 h后，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組中Bcl-2及P-gp蛋白表達(dá)較對(duì)照組中顯著降低(P<0.05)(圖6)。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-145mimics顯著增加MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性

圖4 轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor顯著增加MCF-7細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性

圖5 Bcl-2和P-gp蛋白在MCF-7/ADR細(xì)胞中表達(dá)量較MCF-7細(xì)胞明顯升高

圖6 Bcl-2和P-gp蛋白在轉(zhuǎn)染miR-145 mimics 72 h后的MCF-7/ADR細(xì)胞中表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降

4 miR-145增強(qiáng)阿霉素誘導(dǎo)的MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，相對(duì)于陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染miR-145mimics的MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡明顯增多(P<0.05)(圖7)。提示miR-145明顯增加了MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素誘導(dǎo)凋亡的敏感性。

A：miR-145 mimics陰性對(duì)照組；B：miR-145 mimics組

圖7 miR-145增強(qiáng)阿霉素誘導(dǎo)的MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡

討 論

作為非編碼RNA的一種，miRNA因其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的重要作用而受到廣泛的關(guān)注和重視。多項(xiàng)相關(guān)研究均顯示出不同miRNA的表達(dá)異常與腫瘤化療藥物耐藥之間存在密切相關(guān)性[6-7]。阿霉素是臨床上使用廣泛的一種化療藥物，應(yīng)用在包括乳腺癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤及淋巴瘤患者治療的各個(gè)階段，但是由于原發(fā)性及繼發(fā)性耐藥的發(fā)生，常常導(dǎo)致化療失敗。目前研究認(rèn)為化療耐藥的產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜，與多種基因的表達(dá)和功能異常相關(guān)，其中包括細(xì)胞周期蛋白、凋亡調(diào)節(jié)蛋白、調(diào)節(jié)藥物代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)分子、某些基因突變以及各種藥物的靶蛋白等有關(guān)[8]。研究發(fā)現(xiàn)miR-145在多種腫瘤細(xì)胞中(乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌)均顯示出比癌旁組織較低的表達(dá)水平，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，充當(dāng)抑癌基因的功能[9]。Chen等[10]發(fā)現(xiàn)，miR-145在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與癌旁組織相比較，其表達(dá)明顯降低，在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中，miR-145表達(dá)也明顯下降，提示其作為腫瘤標(biāo)志物的可能性，尤其是在腫瘤發(fā)展的較早時(shí)期。生物信息學(xué)軟件分析及相關(guān)研究已經(jīng)驗(yàn)證miR-145可調(diào)控多個(gè)靶基因：ErbB、IRS-1、IGF-IR、EGFR、STAT1、MUC-1、BCL2、CDK6等,我們的研究正是在這樣的研究背景下對(duì)乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株中的miR-145進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-145后耐藥細(xì)胞的凋亡率明顯升高，Bcl-2顯著下降,提示miR-145是通過靶向Bcl-2來實(shí)現(xiàn)上述功能,這與生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。

P-gp是多藥耐藥基因MDR1的表達(dá)產(chǎn)物，它具有能量依賴性“藥泵”功能,通過與藥物及ATP相結(jié)合，將細(xì)胞內(nèi)藥物泵出細(xì)胞外，有效減少細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。本研究中，與MCF-7細(xì)胞相比較，P-gp在MCF-7/ADR細(xì)胞中表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此可見P-gp表達(dá)增加是阿霉素耐藥產(chǎn)生的可能機(jī)制，我們進(jìn)一步比較了MCF-7/ADR細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-145 mimics及其陰性對(duì)照組的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)P-gp在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)顯著降低，提示miR-145可能通過下調(diào)P-gp蛋白的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)阿霉素誘導(dǎo)的耐藥。

綜上所述，關(guān)于miR-145的研究目前大多數(shù)還停留在表達(dá)譜階段，miR-145與靶基因之間的作用機(jī)制以及在多種癌細(xì)胞中下調(diào)的具體機(jī)制尚不清楚，其在腫瘤耐藥中的作用還需更多深入的研究予以確認(rèn)。本研究證明了miR-145在乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株中呈低表達(dá)，在耐藥細(xì)胞株中上調(diào)其表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中BCL-2和P-gp的表達(dá)而產(chǎn)生。這與以往我們對(duì)腫瘤化療耐藥的機(jī)制認(rèn)識(shí)有差別，為逆轉(zhuǎn)乳腺癌阿霉素耐藥治療提供新的研究思路及潛在靶點(diǎn)。

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(收稿：2016-11-17)

Mechanism of miR-145 on regulating adriamycin resistance of human breast cancer cell line MCF-7/ADR

An Gaili,Hou Lei,Li Xu,et al.

Department of Oncology,Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Objective:To investigate whether miR-145 could modulate the adriamycin resistance of the human breast cancer cell line MCF-7/ADR, and to explore the probable mechanism．Methods:miR-145 expression was measured by quantitative real-time PCR．Transient transfection was used in MCF-7 and MCF-7/ADR cell lines．MTT was used to detect the cell viability．Flow cytometry was used to testify the adriamycin-induced cell apoptosis. Protein expressions of BCL-2 and P-gp were measured by western blot. Results:We found that miR-145 was down-regulated while Bcl-2 and P-gp were up-regulated in MCF-7/ADR cells compared with the parental MCF-7 cells. In vitro drug sensitivity assay demonstrated that the over-expression of miR-145 sensitized MCF-7/ADR cells to adriamycin. Enforced miR-145 expression reduced the protein level of Bcl-2 and P-gp and sensitized MCF-7/ADR cells to adriamycin-induced apoptosis.Conclusion:Our study demonstrated that hsa-miR-145 can modulate adriamycin resistance in breast cancer cell line and induce cell apoptosis partly via targeting Bcl-2 and P-gp．

Breast neoplasms P-Glycoprotein Gene expression regulation,neoplastic @miR-145 @Adriamycin resistance

乳腺腫瘤 P-糖蛋白 基因表達(dá)調(diào)控,腫瘤 @miR-145 @阿霉素耐藥

R737.9

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.06.005