經(jīng)圓窗膜導(dǎo)入ADNF-9基因防治卡那霉素耳毒性的實(shí)驗(yàn)研究

景 陽,鄭國璽,祝 康,張璐瑤,劉 暉,張 文

1.陜西省人民醫(yī)院耳鼻咽喉科(西安710068),2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科(西安710004)

經(jīng)圓窗膜導(dǎo)入ADNF-9基因防治卡那霉素耳毒性的實(shí)驗(yàn)研究

景 陽1,鄭國璽2△,祝 康2,張璐瑤2,劉 暉1,張 文1

1.陜西省人民醫(yī)院耳鼻咽喉科(西安710068),2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科(西安710004)

目的：探討腺伴隨病毒(AAV)介導(dǎo)活性依賴性神經(jīng)營養(yǎng)因子-9(ADNF-9)基因轉(zhuǎn)染對卡那霉素致豚鼠耳毒性的拮抗作用。方法：選用80只白色紅目豚鼠，聽功能正常，隨機(jī)分為四組,每組20只，A組(ADNF-9保護(hù)組)：左耳經(jīng)圓窗注入ADNF-9后肌注卡那霉素；B組(空載體組)：左耳經(jīng)圓窗注入AAV,后肌注卡那霉素；C組(人工淋巴液組)：左耳經(jīng)圓窗注入人工淋巴液后肌注卡那霉素；D組(空白對照組)：僅肌注卡那霉素?？敲顾鼐?jīng)大腿內(nèi)側(cè)注射400 mg/(kg·d)，共給藥6 d；停藥后6、14 d各組均行聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測,停藥14 d后各組處死動物，行耳蝸石蠟病理切片及耳蝸基底膜鋪片觀察各組豚鼠耳蝸基底膜毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)前所有豚鼠的聽功能均正常；停藥后6、14 d的ABR閾值A(chǔ)組為(32.54±5.28)dB和(33.52±2.26)dB；B組為(77.56±4.18)dB和(78.00±5.48)dB；C組為(75.24±6.72)dB和(77.25±4.65)dB；D組為(78.00±3.32)dB和(78.25±3.26)dB。A組停藥后6、14 d與B組、C組及D組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05 )。耳蝸病理切片及基底膜鋪片均提示：A組耳蝸螺旋器細(xì)胞損害較輕，基底膜板基本完整；其余三組，耳蝸螺旋器毛細(xì)胞損害嚴(yán)重，基底膜有不同程度的損害。結(jié)論：ADNF-9基因轉(zhuǎn)染可以有效拮抗氨基糖苷類所致豚鼠耳毒性。

氨基糖苷類抗生素廣泛應(yīng)用于臨床,但也因嚴(yán)重的不可逆的耳毒性限制了其應(yīng)用。倪月秋等[1]發(fā)現(xiàn)，慶大霉素致聾豚鼠的部分耳蝸毛細(xì)胞具有一定的再生能力。沈嘯洪等[2]發(fā)現(xiàn)用中藥補(bǔ)腎聰耳片治療卡那霉素致聾豚鼠后，極少數(shù)耳蝸基底膜有所恢復(fù),聽毛排列整齊,甚至可見絨纖毛,證實(shí)了聽毛細(xì)胞有恢復(fù)的跡象。本研究試圖從電生理學(xué)及行態(tài)學(xué)方面證實(shí)活性依賴性神經(jīng)營養(yǎng)因子-9(ADNF-9)基因轉(zhuǎn)染可以有效拮抗氨基糖苷類所致豚鼠耳毒性。

材料與方法

1 材 料 耳廓反射正常的白色紅目豚鼠80只,體重250～350 g,雌雄不限,經(jīng)測ABR反應(yīng)閾值正常(西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)；卡那霉素(天津藥業(yè)焦作有限公司提供)；ADNF-9、AAV和人工淋巴液(由西安華廣生物工程有限公司提供)。

2 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理 80只豚鼠隨機(jī)分為四組,每組20只。A組(ADNF-9保護(hù)組)：左耳經(jīng)圓窗導(dǎo)入ADNF-9后肌注卡那霉素,共注射6 d；B組(空載體組)：左耳經(jīng)圓窗注入載體腺伴隨病毒(AAV)后肌注卡那霉素,共注射6 d；C組(人工淋巴液組)：左耳經(jīng)圓窗注入人工淋巴液后肌注卡那霉素,共注射6 d；D組(空白對照組)：僅肌注卡那霉素?？敲顾鼐?00 mg/(kg·d)大腿內(nèi)側(cè)注射,停藥6、14 d進(jìn)行聽力學(xué)檢測,每天根據(jù)動物實(shí)際重量調(diào)整卡那霉素用量。

3 經(jīng)圓窗給藥方式 按30 mg/kg的戊巴比妥鈉(北京普博斯生物科技有限公司)腹腔注射麻醉A、B、C組豚鼠,麻醉滿意后,常規(guī)消毒鋪巾,選取左側(cè)耳背進(jìn)路,充分暴露聽泡,在解剖顯微鏡下打開聽泡及暴露圓窗。A組用微量注射器將10 μl攜帶ADNF-9(包含1011個(gè)病毒顆粒)的溶液緩慢注入圓窗,縫合耳后切口,B組、C組以同樣的方法注入空載體及人工淋巴液10 μl,D組不做任何處理。

4 ABR測定 在用藥前、停藥后6 d及停藥后14 d進(jìn)行ABR檢測。測試儀器為美國TDT公司的電生理測試儀。豚鼠按30 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔麻醉后,電極插入顱頂皮下作為記錄點(diǎn)擊,同側(cè)乳突皮下置入?yún)⒖茧姌O,對側(cè)乳突皮下置入接地電極,刺激率為21.1次/ms，帶通濾波100～3000 Hz,掃描時(shí)間12 ms，疊加512次,以波Ⅲ的最小刺激強(qiáng)度為反應(yīng)閾值。

5 耳蝸病理切片制備與觀察 將每組取8只豚鼠斷頭,從枕骨大孔進(jìn)剪,沿顱骨矢狀縫向前(鼻尖部)剪開顱骨,在小腦部位向左右外壓力,使顳骨和周圍組織分離,取出顳骨,打開聽泡迅速放入10%的中性福爾馬林中,解剖顯微鏡下挑開圓窗膜,挑除鐙骨,敞開前庭窗。在蝸尖部垂直于蝸軸進(jìn)針,掀掉一小片骨殼。用玻璃吸管吸取固定液從蝸尖部將固定液擠壓注入耳蝸內(nèi),灌注5管即可。這樣,前庭階及鼓階就充滿了固定液,然后再固定24 h。將固定的顳骨周圍組織盡量修剪掉充分暴露耳蝸組織,將顳骨修成一塊與蝸軸方向一致的長方形,用10%的甲酸脫鈣48 h,流水沖洗4 h。脫水、浸臘,將標(biāo)本蝸軸擺水平位進(jìn)行包埋。沿蝸軸平行切面,連續(xù)切片,每片17 μm。采用HE游離切片染色的方法。切片經(jīng)石炭酸,二甲苯透明后,攤平在載玻片上,加1滴加拿大樹膠封固,標(biāo)號后放室溫下晾干,光學(xué)顯微鏡下鏡檢。

6 耳蝸毛細(xì)胞鋪片制備與觀察 取每組剩余豚鼠斷頭，解剖并完整取出聽泡,暴露耳蝸，挑開蝸尖、前庭窗，先后分別用5%的硝酸銀溶液、10%中性福爾馬林溶液從蝸尖至蝸底反復(fù)灌洗數(shù)次,日光暴曬，福爾馬林溶液固定，在解剖顯微鏡下行耳蝸基底膜鋪片,觀察耳蝸基底膜毛細(xì)胞的變化。

結(jié) 果

1 各組動物生長情況 實(shí)驗(yàn)過程中,各組實(shí)驗(yàn)動物都有不同程度的死亡,空白對照組死亡2只,ADNF-9保護(hù)組死亡3只,空載體組死亡3只,人工淋巴液組死亡1只。各組實(shí)驗(yàn)動物體重都有不同程度的減輕,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2 ABR閾值測定 各組動物給藥前后ABR具體反應(yīng)閾值見表1。四組給藥前ABR閾值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。停藥后6、14 d ,B組、C組及D組ABR閾值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；停藥后6、14 d,A組的ABR閾值與B組、C組及D組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05 )。

表1 不同組各時(shí)間點(diǎn)的ABR閾值比較(dB)

注：與B組、C組、D組比較，*P<0.05

3 取材時(shí)中耳腔情況 取出聽泡后在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)鼓室黏膜無增厚及充血，鼓室內(nèi)無肉芽組織增生，無滲出液，圓窗膜無增厚等現(xiàn)象。

4 耳蝸HE染色情況 A組耳蝸螺旋器毛細(xì)胞損害較輕,基底膜板基本完整(圖1)。其余三組耳蝸螺旋器毛細(xì)胞損害嚴(yán)重,以外毛細(xì)胞為甚,內(nèi)毛細(xì)胞損害較輕,基底膜板亦有不同程度損壞(圖2)。

5 耳蝸毛細(xì)胞鋪片情況 A組可見耳蝸基底膜基本完整，內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞整齊排列，可見點(diǎn)狀缺失(圖3A)。其余三組耳蝸基底膜可見不同程度的破壞，外毛細(xì)胞較內(nèi)毛細(xì)胞損害重，可見片狀缺失(圖3B,圖3C,圖3D)。

圖1 A組石蠟病理切片(HE染色×100)

圖2 B組石蠟病理切片(HE染色×100)

圖3 耳蝸毛細(xì)胞鋪片(硝酸銀染色×100)

討 論

氨基糖苷類抗生素具有抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定、殺菌力強(qiáng)及價(jià)格便宜等特點(diǎn),一直作為抗革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的有效藥物應(yīng)用于臨床。氨基糖苷類藥物中毒性聾成為耳聾的重要原因之一，尤其對兒童危害更大,更易造成兒童的永久性聽力喪失[3]。對氨基糖苷類抗生素耳毒性發(fā)病機(jī)制大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為主要是由于外毛細(xì)胞K+/Ca2+通道受氨基糖苷類抗生素的影響,引起神經(jīng)系統(tǒng)的阻滯，進(jìn)而使耳蝸毛細(xì)胞和聽神經(jīng)得功能受到影響[4]。Schacht等[5]研究發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類抗生素的急性中毒反應(yīng)可能是阻斷了外毛細(xì)胞膜Ca2+通道和鈣電流抑制耳蝸微音器電位。氨基糖苷類抗生素慢性中毒所涉及的機(jī)制比較復(fù)雜,觀點(diǎn)主要集中在線粒體基因突變,自由基氧化損傷,經(jīng)興奮性毒性和聽覺傳出神經(jīng)系統(tǒng)等[6]。

神經(jīng)營養(yǎng)因子是由靶組織分泌的一類特殊的蛋白質(zhì)分子，在神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化及存活的過程中必不可少,一方面可以為神經(jīng)元提供營養(yǎng),促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長和發(fā)育，另一方面保護(hù)神經(jīng)元，促進(jìn)修復(fù)周圍神經(jīng)[7]。而神經(jīng)營養(yǎng)因子中有一類活性依賴性神經(jīng)營養(yǎng)因子(ADNF)。研究者發(fā)現(xiàn)了ADNF-14上有一段9肽ADNF，比ADNF-14具有更強(qiáng)的營養(yǎng)和保護(hù)神經(jīng)的功能，而且發(fā)揮作用的濃度更加多樣化[8]。有研究者發(fā)現(xiàn)用ADNF-9保護(hù)用河豚毒素(TTX)作用后的大腦皮層細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ADNF-9增減一個(gè)氨基酸引起ADNF-9作用水平的下降。Gordon等[9]研究發(fā)現(xiàn)用很低的一個(gè)濃度ADNF-9取拮抗在FeSO4作用的海馬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)海馬細(xì)胞死亡數(shù)減少，而且細(xì)胞內(nèi)的線粒體功能得到提高，同時(shí)活性氧的聚集減少，從而減輕了海馬細(xì)胞損傷。有研究發(fā)現(xiàn)ADNF-9為神經(jīng)元提供營養(yǎng)，促進(jìn)神經(jīng)元突觸早期的形成[10]。ADNF-9分子量較小,可以通過血腦屏障,從而發(fā)揮功能。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)ADNF-9可以通過血迷路屏障,成功轉(zhuǎn)染新生大鼠耳蝸,使其在內(nèi)耳表達(dá)和發(fā)揮作用[11-12]。

基因治療是通過某種手段外源基因?qū)肷矬w的靶細(xì)胞內(nèi),使其在靶細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá),來達(dá)到彌補(bǔ)生物體所缺失的功能或抑制某些基因的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)Atoh1基因可以成功轉(zhuǎn)染到哺乳動物耳蝸，促進(jìn)Corti器功能恢復(fù)。也有研究者發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類中毒所致豚鼠耳蝸也可以被Atoh1基因所轉(zhuǎn)染,而且使耳蝸毛細(xì)胞再生[13]。所以內(nèi)耳的基因治療是可行的。如何選擇一種方便、合適的載體成為了重中之重。應(yīng)用于內(nèi)耳基因治療的載體大致可分為兩大類：非病毒載體和病毒載體。各種不同的載體有其不同的特點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)NGB基因可以在耳蝸表達(dá),有效拮抗氨基糖苷類抗生素的耳毒性[14]。本研究所使用的AAV 載體較其他載體有其獨(dú)特的特點(diǎn),如轉(zhuǎn)染率較高,轉(zhuǎn)染的細(xì)胞范圍較廣,不攜帶病原性等[15]。本研究將腺伴隨病毒介導(dǎo)ADNF-9基因?qū)氚被擒疹愃幬镏卸镜碾嗍蠖亙?nèi),結(jié)果表明,ADNF-9保護(hù)組的實(shí)驗(yàn)動物的聽功能和耳蝸毛細(xì)胞受損程度較人工淋巴液組、空載體組及空白對照組明顯小。從而證實(shí)了ADNF-9對耳蝸組織的形態(tài)和功能的恢復(fù)起到了一定的作用。但對于ADNF-9基因轉(zhuǎn)染拮抗氨基糖苷類耳毒性的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

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(收稿：2016-07-14)

*高等學(xué)校博士學(xué)科專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(20120201110060)

卡那霉素 毛細(xì)胞,耳 圓窗,耳 基因 轉(zhuǎn)染 @活性依賴性神經(jīng)營養(yǎng)因子-9

R764.4

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.06.002

△通訊作者