趙鈺玲,董 婭,范亞莉,楊拴盈,魚 軍,王娟紅,王琦俠,王一理,李建英,△
1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬西安市中心醫(yī)院(西安710003),2.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院(延安716000),3.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科(西安710003),4.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院癌癥研究所(西安710061)
·基礎(chǔ)研究·
吉西他濱對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549、H1299細(xì)胞增殖及凋亡的影響
趙鈺玲1,2,董 婭1,2,范亞莉1,2,楊拴盈3,魚 軍1,王娟紅1,王琦俠1,王一理4,李建英1,4△
1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬西安市中心醫(yī)院(西安710003),2.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院(延安716000),3.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科(西安710003),4.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院癌癥研究所(西安710061)
目的:研究吉西他濱對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549及H1299細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法:應(yīng)用MTT法及流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定不同濃度的吉西他濱對(duì)A549及H1299細(xì)胞體外增殖的抑制作用。結(jié)果:①M(fèi)TT法檢測(cè)不同濃度(1.25、2.5、5、10、20、40、60 μg/ml)吉西他濱分別作用于A549及H1299細(xì)胞24、48、72 h后,其對(duì)A549和H1299細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng),且具有一定的劑量和時(shí)間依賴性,但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng),吉西他濱對(duì)A549具有藥物耐受性,而對(duì)H1299具有藥物敏感性;②A549及H1299細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸進(jìn)入對(duì)數(shù)期,后進(jìn)入平臺(tái)期;③倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),A549及H1299對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),生長(zhǎng)狀態(tài)良好,形態(tài)大多數(shù)為多角形、或梭形,貼壁牢固,細(xì)胞間連接緊密。隨著藥物作用時(shí)間的增加,細(xì)胞逐漸皺縮、壞死、碎裂;④流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的吉西他濱(0、2.5、5、10、20、40 μg/ml)對(duì)A549及H1299細(xì)胞凋亡具有明顯的劑量依賴關(guān)系。結(jié)論:吉西他濱對(duì)A549及H1299細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用;呈現(xiàn)一定的濃度抑制作用和時(shí)間抑制作用。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞耐藥,而對(duì)H1299細(xì)胞敏感。
目前臨床上治療非小細(xì)胞肺癌的手段包括化療、放療、手術(shù)及靶向治療等,其中最為重要也最常用的手段是化療,以鉑類為基礎(chǔ)的化療藥到目前為止仍然是晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的主流一線用藥[1]。然而20世紀(jì)90年代起市場(chǎng)上出現(xiàn)了第三代細(xì)胞毒化療藥,并逐漸成為臨床治療NSCLC的一線用藥。吉西他濱(Gemcitabine)是一種以破壞細(xì)胞復(fù)制的二氟核苷類抗代謝類抗癌藥,是去氧胞苷的水溶性類似物,是核糖核苷酸還原酶的一種抑制性酶的替代物,這種酶在DNA合成和修復(fù)過(guò)程中,對(duì)脫氧核苷酸的生成是至關(guān)重要的。其在多種實(shí)體瘤具有良好的抗腫瘤活性,但是體外研究仍有欠缺,尤其是對(duì)不同種類的NSCLC抗腫瘤活性的對(duì)比研究尚且不多。本文就吉西他濱對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549和H1299細(xì)胞增殖抑制及凋亡作用進(jìn)行探討。
1 材 料 吉西他濱(Gemcitabine hydrochloride,健澤)國(guó)藥準(zhǔn)字H20030105,生產(chǎn)廠家:江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司。臺(tái)盼藍(lán)(TRYPAN BLUE):MP Biomedical. LLC公司,批號(hào)MR29186。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT 貨號(hào):M2128)。RPMI-1640培養(yǎng)基,Hyclone公司,批號(hào)ABA211779。胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司,批號(hào)150130)。0.25% 胰蛋白酶消化液,Solabio公司,批號(hào)20160421。二甲基亞砜(DMSO)貨號(hào)D5879。Annexin V-FITV 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,Miltenyi Biotec GmbH,貨號(hào)5160412036。Multiskan Mk3酶標(biāo)儀(Thermo公司)。流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)。
2 實(shí)驗(yàn)方法 ①細(xì)胞培養(yǎng):A549及H1299細(xì)胞復(fù)蘇后,貼壁生長(zhǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640完全培養(yǎng)液中,并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②吉西他濱對(duì)A549及H1299細(xì)胞增殖的影響:采用MTT法,將A549按照4×103個(gè)/ml、H1299細(xì)胞按照5×103個(gè)/ml的密度分別接種到96孔培養(yǎng)板中,試驗(yàn)按不同濃度分為以下幾組(1.25、2.5、5、10、20、40、60 μg/ml)、陰性對(duì)照組(加相同劑量的純RPMI1640培養(yǎng)液,終體積為200 μl/孔)。分別培養(yǎng)24 、48、72 h后加入10 μl的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清液,加入DMSO 150 μl,置于酶標(biāo)儀上避光震蕩10 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度A值,測(cè)定波長(zhǎng)490 nm,計(jì)算細(xì)胞增殖的抑制率:抑制率(%)=(陰性對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/陰性對(duì)照組A值×100%。③細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定:取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549及H1299細(xì)胞,加入0.25%胰蛋白酶消化后用完全培養(yǎng)基稀釋至適宜濃度,接種于7塊96孔板中,每孔100 μl,設(shè)有6個(gè)復(fù)孔,細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)/孔,接種完成后置于37 ℃,5%CO2的恒溫孵箱中培養(yǎng)。24 h后取出一塊96孔板,每孔加入20 μl MTT溶液,再置于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出,小心吸棄上清,每孔加入二甲基亞砜200 μl,置于酶標(biāo)儀上避光震蕩10 min,讀取并記錄每孔在波長(zhǎng)為490 nm處的光密度值,并于48、72、96、120、144、168 h各取出一塊96孔板,獨(dú)立重復(fù)以上操作3次,取平均值。以時(shí)間為橫軸,吸光值為縱值,繪制生長(zhǎng)曲線。④細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549及H1299細(xì)胞接種于48 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng),吉西他濱組加入20 μg/ml的吉西他濱100 μl/孔,陰性對(duì)照組加入純RPMI1640,培養(yǎng)24、48h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。⑤流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:以每孔2 ml接種濃度A549為4×104個(gè)/ml、H1299為5×104個(gè)/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于6孔板中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后去上清液,加入含藥物的培養(yǎng)液(2.5、5、10、20、40 μg/ml),陰性對(duì)照組(加相同劑量的純RPMI1640培養(yǎng)液),將6孔板移入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,PBS沖洗細(xì)胞兩次,胰酶消化細(xì)胞1500 r/min離心5 min,收集細(xì)胞,加1 ml 1× buffer(配置1×buffer:20倍稀釋 250 μl(20×)buffer+4.75 ml蒸餾)洗滌細(xì)胞2000 r/min離心10 min,棄上清。重復(fù)上述洗滌步驟。用100 μl 1× buffer重懸細(xì)胞。加入10 μl Annexin-V FITC 抗體。避光孵育15 min。用1ml 1×buffer洗滌細(xì)胞,2000 r/min離心10 min,棄上清。重復(fù)上述洗滌步驟。用500 μl 1×buffer重懸細(xì)胞。加入5 μl 碘化丙啶(PI),上機(jī)分析。1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞晚期凋亡的情況。
1 吉西他濱對(duì) A549及H1299 細(xì)胞增殖的抑制作用 見(jiàn)圖1~3。吉西他濱不同濃度(1.25、2.5、5、10、20、40、60 μg/ml)分別作用A549及H1299細(xì)胞24、48、72 h后,不同濃度吉西他濱在24、48、72 h對(duì)A549細(xì)胞增殖均有抑制作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著藥物濃度的提高和刺激時(shí)間的延長(zhǎng),吉西他濱對(duì) A549和H1299細(xì)胞的抑制作用也逐漸增強(qiáng),即具有劑量和時(shí)間依賴性。但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng),吉西他濱對(duì)A549的抑制出現(xiàn)平臺(tái)期,表明:A549為吉西他濱耐藥型細(xì)胞,而H1299為吉西他濱敏感型細(xì)胞。
2 非小細(xì)胞肺癌A549及H1299細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 見(jiàn)圖4。A549細(xì)胞所得曲線大致為直線而H1299細(xì)胞所得曲線大致為“S”型,兩者在1~3 d均處于緩慢生長(zhǎng)期,從第4天起進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,A549細(xì)胞在第7天進(jìn)入平臺(tái)期,H1299細(xì)胞第6天進(jìn)入平臺(tái)期。
3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),A549及H1299對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),生長(zhǎng)狀態(tài)良好,形態(tài)大多數(shù)為多角形、或梭形,貼壁牢固,細(xì)胞間連接緊密。藥物作用24 h后細(xì)胞體積變小,生長(zhǎng)緩慢,貼壁細(xì)胞減少,細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、折光性差,細(xì)胞間連接疏松。藥物作用48 h后,細(xì)胞明顯變圓,可見(jiàn)大量壞死碎裂的細(xì)胞。
4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 見(jiàn)圖5~6。吉西他濱作用24 h后,A549細(xì)胞凋亡率分別為:1.16%、3.77%、7.22%、8.75%、11.85%、15.27%;H1299細(xì)胞凋亡率分別為:0.88%、1.79%、4.40%、5.26%、8.89%、10.48%,顯示出明顯的劑量依賴關(guān)系(P<0.05)。
圖1 吉西他濱對(duì)A549及H1299細(xì)胞作用24 h后抑制率
圖2 吉西他濱對(duì)A549及H1299細(xì)胞作用48 h后抑制率
圖3 吉西他濱對(duì)A549及H1299細(xì)胞作用72 h后抑制率
圖4 非小細(xì)胞肺癌A549及H1299細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度吉西他濱處理A549細(xì)胞后凋亡率的變化
圖6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度吉西他濱處理H1299細(xì)胞后凋亡率的變化
吉西他濱是臨床上人工合成的抗代謝類抗腫瘤藥物, 屬于細(xì)胞周期特異性藥物,抗瘤譜廣,對(duì)多種腫瘤均有顯著臨床療效,具有破壞腫瘤細(xì)胞的DNA合成、阻止腫瘤細(xì)胞從G1期向S期發(fā)展、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的DNA斷裂及死亡等作用[2-4]。據(jù)報(bào)道[5]吉西他濱治療非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌及鼻咽癌的近期總有效率分別為42.86%,18.18%,60.00%;臨床受益反應(yīng)有效率分別達(dá)46.86%、45.45%、80%。本研究中我們證明了吉西他濱能抑制A549及H1299細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但是吉西他濱對(duì)H1299細(xì)胞的抑制比A549細(xì)胞高,可能是因?yàn)榧魉麨I隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)A549細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性,而對(duì)H1299細(xì)胞相對(duì)來(lái)說(shuō)越來(lái)越敏感(即A549為吉西他濱耐藥型細(xì)胞,而H1299為吉西他濱敏感型細(xì)胞[6])。近年來(lái)的報(bào)道顯示吉西他濱的耐藥機(jī)制可能由以下幾種途徑引起:①缺乏dCK(脫氧胞苷激酶),這是目前研究最多,最為學(xué)者們所接受的耐藥途徑;②胞苷脫氨酶活性增加導(dǎo)致對(duì)吉西他濱的滅活增加;③聚合酶活性的變化;④細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力的下降引起藥物進(jìn)入細(xì)胞減少;⑤核苷酸還原酶增加;⑥胞漿5’核苷酶I也與吉西他濱的耐藥有關(guān);但是具體吉西他濱是通過(guò)何種途徑而造成細(xì)胞耐藥的仍存在很多爭(zhēng)議。而本次研究?jī)H為臨床應(yīng)用吉西他濱作為一線的化療藥物治療非小細(xì)胞肺癌進(jìn)一步提供了理論依據(jù)。最終其是通過(guò)何種凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,目前機(jī)制尚未明確,仍需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。
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(收稿:2016-10-17)
The effects of Gemcitabine in human non-small cell lung cancer A549 and H1299 cells proliferation and apoptosis
Zhao Yuling,Dong Ya,Fan Yali,et al.
Xi’an Central Hospital Affiliated of Medical College of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710003)
Objective:Study of the effects of Gemcitabine in human non-small cell lung cancer A549 and H1299 cells proliferation and apoptosis.Methods:Determined by MTT method and flow cytometry technology detect that various concentrations of Gemcitabine in A549 and H1299 cells proliferation in vitro.Results:①Determined by MTT method which detect different concentrations(1.25,2.5,5,10,20,40,60 μg/ml)of Gemcitabine in A549 and H1299 cells after 24、48、72hours.The result shows that the inhibition of A549 and H1299 cells gradually strengthened,and which has a certain dose and time dependent characteristic,but when the incubation time was prolonged,which indicates that Gemcitabine was resistant to the A549,which was sensitive to H1299 cells. ②When the incubation time was prolonged,A549 and H1299 cells gradually into the logarithmic growth period,after go in plateau. ③Observed under inverted microscope,the control group of A549 and H1299 which grow against the wall in good state.The mostly form which were diamond or spindle,those cells tightly attached and tight junctions between cells with the increase of drug effect time,cells gradually shrinking、necrosis and rupture.④How cytometry instrument detect that various concentrations of gemcitabine(0,2.5,5,10,20,40 μg/ml)in A549 and H1299 cells apoptosis has obvious dose response relationship.Conclusion:Gemcitabine has quite strong inhibitory effect on cells proliferation,which presents certain concentration dose and time dependent.With the time goes by,gemcitabine is resistant to the A549 and sensitive to H1299 cells.
Carcinoma, non-small-cell Lung Antimetabolites, antineoplastic Cell proliferation Apoptosis
*陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2012JC2-06)
癌,非小細(xì)胞肺 抗代謝藥,抗腫瘤 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡
R734.2
A
10.3969/j.issn.1000-7377.2017.06.001
陜西省科技學(xué)術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014K11-01-02-15)
△通訊作者