蒙古扁桃編碼Ca2+結(jié)合蛋白基因的系統(tǒng)性鑒定和表達(dá)分析

劉 洋，鐵 英，楊 佳，祁 智，毛惠平，

(1.內(nèi)蒙古和盛生態(tài)科技研究院有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

蒙古扁桃編碼Ca2+結(jié)合蛋白基因的系統(tǒng)性鑒定和表達(dá)分析

劉 洋1，鐵 英1，楊 佳2，祁 智2，毛惠平1，2

(1.內(nèi)蒙古和盛生態(tài)科技研究院有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

為進(jìn)一步解析蒙古扁桃抗逆境的遺傳機理，采用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)和基因表達(dá)分析，在蒙古扁桃體內(nèi)鑒定到16個編碼Ca2+結(jié)合蛋白的全長轉(zhuǎn)錄本，包括4個Ca2+ATPase(ECA/ACA)，3個具有多個跨膜域的新型Ca2+通道蛋白(ERD)，5個Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白(CAX)，2個Ca2+依賴的蛋白激酶(CPK)和2個鈣調(diào)素蛋白(CAM)，它們的結(jié)構(gòu)域同擬南芥同源蛋白基本相同。ERD、CAX、CPK和CAM各有1個基因在蒙古扁桃根和葉中有明顯表達(dá)，其中的ERD、CPK和CAM類的基因表達(dá)在不同程度上受干旱和鹽脅迫調(diào)節(jié)，說明有可能調(diào)節(jié)蒙古扁桃的抗逆能力。

蒙古扁桃；轉(zhuǎn)錄組測序；鈣結(jié)合蛋白；鈣調(diào)素

通過分子育種手段培育抗逆境作物的核心是掌握有明確抗逆境功能的基因。鈣離子(Ca2+)和鈣結(jié)合蛋白在植物細(xì)胞感應(yīng)和抵抗逆境中發(fā)揮重要作用，因此，尋找具有抗逆境功能的編碼鈣結(jié)合蛋白基因一直是分子育種的一個方向。目前研究主要集中在以擬南芥為代表的模式植物中[1-2]。在細(xì)胞層面，滲透脅迫、干旱相關(guān)激素脫落酸(ABA)、鹽堿、低溫和高溫等非生物脅迫，以及細(xì)菌、真菌等生物脅迫都可以誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器內(nèi)的Ca2+瞬時升高，調(diào)節(jié)位于細(xì)胞內(nèi)不同部位對Ca2+具有不同親和性的蛋白活性，進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游逆境相關(guān)基因表達(dá)[3-4]。在模式植物擬南芥基因組內(nèi)存在多種Ca2+結(jié)合蛋白和Ca2+轉(zhuǎn)運蛋白，例如CDPK、CIPK、CBL、CML、CaM、CNGC、GLR等，其中一些蛋白在擬南芥逆境生理方面發(fā)揮核心功能[5]。

生長在不同自然環(huán)境的野生植物是天然的功能基因庫，尤其是天然抗逆境的荒漠植物體內(nèi)可能存在模式植物不具有的，具有抗逆境功能的編碼鈣結(jié)合蛋白基因。但是由于野生植物生長緩慢、基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對野生植物基因的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于模式植物。這些年隨著基因測序技術(shù)的快速發(fā)展[6]，測序需要的時間和成本都大幅度下降，這使得一個普通的實驗室也可以對感興趣的野生植物的遺傳信息進(jìn)行基本分析。最近幾年，一些長期適應(yīng)極端環(huán)境的野生植物完成了轉(zhuǎn)錄組或基因組測序，例如胡楊[7]、沙冬青[8]、雙花扁豆[9]、牛心樸子草[10]、西藏砂生槐[11]、籽蒿[12]。

本研究選取的蒙古扁桃屬于薔薇科，是第三紀(jì)孑遺、瀕危國家二級保護(hù)植物。主要分布在蒙古國戈壁省及東戈壁省，我國內(nèi)蒙古西部以及寧夏回族自治區(qū)北部，陜西省和甘肅省北部荒漠地區(qū)[13-16]。基于分子標(biāo)記的遺傳多樣性分析表明，內(nèi)蒙古西部包頭薩拉齊地區(qū)的蒙古扁桃種群多樣性最豐富[17]。蒙古扁桃具有天然抗干旱、鹽堿和低溫的能力[18]，可以用于荒漠地區(qū)生態(tài)林建設(shè)和植被恢復(fù)工程，目前蒙古扁桃的苗木繁殖和基于組織培養(yǎng)的快繁技術(shù)體系已經(jīng)建立[19-22]。蒙古扁桃的抗逆境能力，一方面同其栽培條件相關(guān)[23]，另一方面同其內(nèi)在解剖結(jié)構(gòu)以及其根部的共生叢枝菌根有關(guān)[24-25]。

2015年蒙古扁桃完成了干旱處理樣本的轉(zhuǎn)錄組測序工作[26]，為進(jìn)一步解析蒙古扁桃抗逆境的遺傳機理提供了基礎(chǔ)信息。到目前為止，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，針對蒙古扁桃基因的深入研究還是空白。本研究在轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，在蒙古扁桃體內(nèi)鑒定到多種Ca2+結(jié)合蛋白，并進(jìn)一步對其中的CML家族在干旱和鹽堿條件下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 蒙古扁桃葉轉(zhuǎn)錄組測序

選取健康飽滿的野生蒙古扁桃種子(采自內(nèi)蒙古阿拉善地區(qū))用自來水浸泡，放在4 ℃冰箱7 d以后，在封閉的光照培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行催芽，催芽條件：12 h光照，12 h黑暗，120 μmol/(m2·s)光強，溫度維持在23 ℃左右。發(fā)芽的種子播種在營養(yǎng)土 ∶蛭石為1∶1的花盆中，在內(nèi)蒙古大學(xué)南區(qū)玻璃日光溫室內(nèi)培養(yǎng)。每盆3～5株植物。每7 d給300 mL自來水，時間固定在9:00時。選取長勢一致高度在20 cm左右的蒙古扁桃幼苗，在統(tǒng)一給水7 d以后，剪下長勢良好的植物的部分葉子，利用RNAiso for Polysaccharide-Rich Plant Tissue(TaKaRa)試劑盒提取RNA。將儲存在異丙醇中的RNA通過干冰保存并委托北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司進(jìn)行數(shù)據(jù)量4 G左右的轉(zhuǎn)錄組測序。測序平臺是Illumina HiSeq2500。測序基本流程見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)錄組測序基本流程

1.2 蒙古扁桃編碼Ca2+結(jié)合蛋白基因序列的鑒定

對于公司提供的含有英文基因注釋信息的Excel表格，利用Calcium或Ca2+進(jìn)行搜索。在Notepad++環(huán)境下，打開根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列預(yù)測的蛋白氨基酸序列文件，利用基因序列代號匯總每一條注釋帶有Calcium或Ca2+的蛋白序列信息。利用在線蛋白數(shù)據(jù)庫www.uniprot.org預(yù)測蛋白的基本性質(zhì)。利用InterPro-Scan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan)對這些蛋白的氨基酸序列進(jìn)行保守域檢測。利用在線ClustalW進(jìn)行多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)。根據(jù)起始密碼子、終止密碼子和保守結(jié)構(gòu)域的完整性進(jìn)一步去除非全長片段，最終得到最有可能編碼Ca2+結(jié)合蛋白的全長序列。

1.3 蒙古扁桃基因表達(dá)分析

選取高度在20 cm左右的蒙古扁桃幼苗，在統(tǒng)一給水7 d以后，選擇長勢良好的植物，收集葉和根組織速凍，用于基因組織特異性表達(dá)研究。對于要進(jìn)行脅迫處理的植物，分成3組，每組3盆苗，在統(tǒng)一給水7 d以后，將時間設(shè)為0 d，然后分別給予每組植物(Ⅰ)300 mL自來水(對照)，(Ⅱ)300 mL含有200 mmol/L NaCl的溶液(鹽處理)和(Ⅲ)干旱不澆水處理，在第7天和第14天的時候收集長勢一致的葉子進(jìn)行速凍。3次生物學(xué)重復(fù)相隔7 d。試驗在2015年5-9月進(jìn)行。

速凍的葉子在7 d以內(nèi)，經(jīng)過液氮研磨以后，利用RNAiso for Polysaccharide-Rich Plant Tissue(Takara)試劑盒提取RNA，進(jìn)一步用DNA酶消耗RNA中殘留的基因組DNA污染。RNA準(zhǔn)確含量用QUBIT RNA BR ASSAY KIT(Invitrogen)試劑盒和QUBIT 2.0 FLUOROMETER(Invitrogen)確定。以3 g RNA為模板，利用TransScript-Uni One-Step gDNA Removal 和 cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄成cDNA(Transgene)。

實時定量PCR(Real time quantitative PCR)使用qTOWER 2.2 設(shè)備(Analytik Jena，Germany)和TransStart Tip Green qPCRSuperMix試劑(Transgene)。參比基因GAPDH的引物來自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)白老師實驗室[26]。基因表達(dá)水平分析分別在對照和鹽處理、對照和干旱處理間進(jìn)行。對于每一組分析，基因表達(dá)水平首先利用參比基因在對照和處理間的表達(dá)差異進(jìn)行校對，然后將同一種處理條件下，同一個基因3個生物學(xué)重復(fù)中最低表達(dá)量設(shè)定為1，對同一基因在不同生物學(xué)重復(fù)和不同時間點處理的表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理。顯著性差異利用Excel中的T-TEST、等方差、成對(Pair)方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙古扁桃葉RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測序的基本情況

蒙古扁桃葉子相對較厚，肉質(zhì)。利用TRIplant Reagent多糖多酚植物總RNA抽提試劑(BioTeke)和RNAiso for Polysaccharide-Rich Plant Tissue(Takara)，得到清晰高質(zhì)量RNA。利用Illumina HiSeq2500測序平臺，對蒙古扁桃葉RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，得到原始測序片段(Raw reads)42 681 238，去除低質(zhì)量測序數(shù)據(jù)，最終得到有效片段40 890 134(Clean reads)，占整個測序片段的94%，總共堿基數(shù)量5 G，說明測序質(zhì)量可靠。對測到的有效片段進(jìn)行進(jìn)一步的組裝，得到88 435條可能編碼功能基因的序列(Unigene)，其中65%的長度在1 kb以下，35%的長度大于1 kb，其中12.8%的序列長度大于2 kb(表1)。

表1 轉(zhuǎn)錄本組裝結(jié)果

利用COG數(shù)據(jù)庫(Clusters of orthologous groups)對Unigene進(jìn)行基本的功能預(yù)測(圖2)，500多個Unigene注釋為未知功能(Function unknown)，其他Unigene都與已知功能基因有一定的同源性，其中300個基因參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction)，200個基因參與生物脅迫反應(yīng)(Defense mechanisms)，它們有可能是蒙古扁桃耐受逆境的分子基礎(chǔ)。

圖2 蒙古扁桃轉(zhuǎn)錄本COG注釋歸類

2.2 蒙古扁桃編碼Ca2+結(jié)合蛋白基因的系統(tǒng)性鑒定和序列分析

通過對基因注釋信息進(jìn)行關(guān)鍵字搜索，對基因序列以及對應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)分析，最終確定16條編碼Ca2+結(jié)合蛋白的全長轉(zhuǎn)錄本，包括4個Ca2+ATPase(ECA/ACA)(表2)，3個具有多個跨膜域的新型Ca2+通道蛋白(表3)，5個Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白(CAX)(表4)，2個Ca2+依賴的蛋白激酶(CPK)和2個鈣調(diào)素蛋白(CAM)(表5)。這些轉(zhuǎn)錄本對應(yīng)的氨基酸序列同擬南芥同源序列長度基本相當(dāng)，同時有50%～89%的相同性，說明蒙古扁桃的Ca2+結(jié)合蛋白序列同模式植物擬南芥有較高的同源性。

表2 蒙古扁桃編碼Ca2+-ATPase基因全長轉(zhuǎn)錄本同擬南芥同源序列的比對

表3 蒙古扁桃編碼多個跨膜域新型Ca2+通道蛋白基因全長轉(zhuǎn)錄本同擬南芥同源序列的比對

表4 蒙古扁桃編碼Ca2+/H+轉(zhuǎn)運蛋白基因全長轉(zhuǎn)錄本同擬南芥同源序列的比對

表5 蒙古扁桃編碼Ca調(diào)蛋白基因全長轉(zhuǎn)錄本同擬南芥同源序列的比對

進(jìn)一步對這16條蒙古扁桃編碼Ca2+結(jié)合蛋白的序列進(jìn)行了保守結(jié)構(gòu)域分析，并同擬南芥同源序列的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了比對。發(fā)現(xiàn)2個植物的ECA基因編碼蛋白都含有8個預(yù)測跨膜域，同時相對分布位置也一致(圖3)。2個植物的CPK序列在N端都具有保守的ATP結(jié)合位點和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，在C端都含有4個典型的EF手型(EF-Hand)Ca2+結(jié)合位點(圖3)。2個植物的CAM序列都具有均勻分布的4個典型的EF手型(EF-Hand)Ca2+結(jié)合位點(圖3)。對于新型Ca2+通道蛋白，盡管蒙古扁桃C23875基因和對應(yīng)的擬南芥ERD4都編碼有9個預(yù)測跨膜域的蛋白，但第7和第8個跨膜域的相對位置是不同的(圖4)。

在ECA3、CAX11中的黑色區(qū)域代表跨膜域；CPK9和CAM7中的EF代表EF手型Ca2+結(jié)合域；數(shù)字代表氨基酸位點；擬南芥同源基因編碼蛋白預(yù)測的結(jié)構(gòu)域與蒙古扁桃相同。In the ECA3，CAX11，the black region indicates the transmembrane-domain;The EF in the CPK9 and CAM7 stands for the EF-hand Ca2+ binding structure;The number in the figure indicates the amino acid position;The Arabidopsis homology gene encoding protein′s predicated structure is same as the Mongolian almond′s.

黑色區(qū)域.跨膜域;數(shù)字.氨基酸位點。The black region.The transmembrane-domain；The number.The amino acid position.

2.3 蒙古扁桃編碼Ca2+結(jié)合蛋白基因的表達(dá)分析

為了對這16條編碼Ca2+結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄本的生理功能有一個基本的了解，首先利用定量PCR研究了它們在根和葉組織中的特異性表達(dá)。大多數(shù)基因在根和葉中都沒有檢測到表達(dá)。只有C23875_ERD4、C28463_CAX3、C17801_CPK11和C19014_CAM7在葉和根中都有明顯表達(dá)(圖5)，其中，C23875_ERD4在根中表達(dá)最高，C19014_CAM7在葉中表達(dá)最高(圖5)。

圖5 蒙古扁桃編碼鈣結(jié)合蛋白基因在葉和根中的相對表達(dá)

進(jìn)一步研究了干旱和鹽脅迫對這4個基因在葉中表達(dá)的影響。在7 d或14 d 200 mmol/L NaCl或干旱處理的植物葉中，相對于對照植物，C23875_ERD4、C17801_CPK11和C19014_CAM7的表達(dá)量升高較大，C28463_CAX3的表達(dá)沒有明顯變化。其中，C23875_ERD4和C19014_CAM7對NaCl處理反應(yīng)最強烈，表達(dá)量隨著NaCl處理時間的延長進(jìn)一步升高(圖6)。

圖6 蒙古扁桃編碼鈣結(jié)合蛋白基因的表達(dá)對鹽和干旱脅迫的反應(yīng)

3 結(jié)論與討論

生長在特殊生境的野生植物是天然的功能基因庫。現(xiàn)代低成本高通量的測序技術(shù)使開發(fā)野生植物基因庫成為可能。本研究利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)和基因表達(dá)分析，在野生荒漠植物蒙古扁桃體內(nèi)鑒定到16個編碼Ca2+結(jié)合和轉(zhuǎn)運蛋白的全長轉(zhuǎn)錄本，包括2015年在擬南芥體內(nèi)鑒定到的具有9個跨膜域的新型Ca2+通道蛋白EDR4。生物信息學(xué)分析證明蒙古扁桃的Ca2+ATPase(ACA/ECA)、Ca2+/H+(CAX)、CPK以及CAM蛋白具有和擬南芥同源蛋白高度類似的蛋白結(jié)構(gòu)域，間接說明它們很有可能具有類似的功能。蒙古扁桃EDR4的第7個跨膜域的相對位置和擬南芥完全不同，說明它們的Ca2+轉(zhuǎn)運特性可能是不一樣的。

擬南芥體內(nèi)和EDR4在蛋白結(jié)構(gòu)上類似的蛋白OSCA1被證明是跨膜Ca2+通道，感知細(xì)胞外的滲透勢，介導(dǎo)Ca2+從葉保衛(wèi)細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[24]。擬南芥中的CPK11是一個典型的Ca2+依賴蛋白激酶，其表達(dá)受干旱和高鹽迅速誘導(dǎo)，通過磷酸化ABF類轉(zhuǎn)錄因子，正向調(diào)控ABA介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[25]。擬南芥的CAM7直接作用bZIP轉(zhuǎn)錄因子HY5的啟動子，進(jìn)一步調(diào)節(jié)和植物光形態(tài)建成相關(guān)的基因表達(dá)。把這些基因編碼蛋白的功能進(jìn)行總結(jié)[26]，我們可以假設(shè)，干旱和鹽脅迫有可能首先通過開啟位于蒙古扁桃細(xì)胞質(zhì)膜的EDR4 Ca2+通道蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，使蒙古扁桃細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度升高，激活位于細(xì)胞質(zhì)的Ca2+依賴蛋白激酶CPK11；進(jìn)入細(xì)胞核的Ca2+通過直接激活CAM7啟動脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。

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Mongolian Almond Ca2+Binding Protein Encoding Gene Systemic Identification and Expression Analysis

LIU Yang1，TIE Ying1，YANG Jia2，QI Zhi2，MAO Huiping1，2

(1.Inner Mongolia Hesheng Ecology Science and Technology Research Limited，Huhhot 010010，China；2.College of Life Sciences，Inner Mongolia University，Huhhot 010010，China)

Mongolian Almond(PrunusmongolicaMaxim)belongs to Rosaceae，under national protection of second class，primarily distributes at the Northwestern Dessert Region of China and is tolerant to drought and poor soil.Calcium ion is the most important signaling molecule for plant sensing and resistance to environment stresses.In this study，based on transcriptome analysis of the leaf，we identified sixteen strings of full length transcripts，including four Ca2+ATPase(ECA/ACA)，three novel Ca2+channel protein with several transmembrane domains(ERD)，five Ca2+/H+antiporter(CAX)，two Ca2+dependent protein kinase(CPK)and two calmodulins(CAM).Their predicated structures are similar to those homologies inArabidopsis.Four single genes from theERD，CAX，CPKandCAMcategories，respectively，had obvious expression in the leaves and roots，among which theERD，CPKandCAMgenes expression had been regulated by drought and salt at different extent.It indicated that the genes might modulate the plant′s environmental stress-tolerant ability.

Mongolian almond；Transcriptome；Ca2+binding protein；Calmodulin

2016-11-12

內(nèi)蒙古自治區(qū)科技重大專項(內(nèi)財教 [2014]2020號)

劉 洋(1983-)，女，內(nèi)蒙古包頭人，工程師，碩士，主要從事旱生灌木生理及分子生物學(xué)研究。

毛惠平(1973-)，女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，講師，博士，主要從事植物逆境脅迫生理及相關(guān)基因功能研究。

S662.9

A

1000-7091(2017)02-0081-06

10.7668/hbnxb.2017.02.013