大豆ZF-HD轉(zhuǎn)錄因子GmZHD1的克隆及表達(dá)分析

張晉玉，晁毛妮，杜弘楊，喻德躍，黃 方

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，國(guó)家大豆改良中心，江蘇 南京 210095；2.河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

大豆ZF-HD轉(zhuǎn)錄因子GmZHD1的克隆及表達(dá)分析

張晉玉1，2，晁毛妮2，杜弘楊1，喻德躍1，黃 方1

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，國(guó)家大豆改良中心，江蘇 南京 210095；2.河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

為了揭示大豆ZF-HD基因的生物學(xué)功能，通過(guò)PCR的方法，從大豆栽培豆科豐1號(hào)中克隆了ZF-HD轉(zhuǎn)錄因子Glyma.02g040100，命名為GmZHD1。生物信息學(xué)分析表明，該基因的cDNA全長(zhǎng)為888 bp，編碼295個(gè)氨基酸，GmZHD1蛋白分子量約為32.64 kDa，等電點(diǎn)為7.69；序列分析表明，GmZHD1含有ZF-HD家族保守的鋅指結(jié)構(gòu)域和同源異形盒結(jié)構(gòu)域，GmZHD1與FtHB2蛋白序列一致性最高，為44.4%；亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示GmZHD1定位于細(xì)胞核；熒光定量PCR結(jié)果表明，GmZHD1在大豆不同組織中都有表達(dá)，其中，花、種子和葉片中表達(dá)較高。此外，將GmZHD1基因連接到植物過(guò)表達(dá)載體pBA002上，為進(jìn)一步研究大豆GmZHD1基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

大豆；GmZHD1；亞細(xì)胞定位；RT-PCR

同源異形盒基因(Homeobox gene，HB)是一類廣泛存在于真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子，與生物的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。HB基因含有一段高度保守的大約180 bp的DNA序列，編碼的60～63個(gè)氨基酸稱為同源異形盒結(jié)構(gòu)域(Homeobox domain)，有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序，可以與DNA特異結(jié)合[1-2]。自從同源異形盒基因在果蠅中首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)[3]，科學(xué)家們?cè)谄渌锶缇€蟲(chóng)、斑馬魚(yú)、小鼠、人類和植物中相繼發(fā)現(xiàn)了同源異形盒基因[4-5]。研究表明，植物HB轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)環(huán)境變化[6]、花發(fā)育的調(diào)控[7]、胚胎和葉片發(fā)育[8-9]及激素應(yīng)答[10-12]等方面發(fā)揮著重要作用。

同源異形盒基因在植物中是一個(gè)龐大的基因家族，由多個(gè)成員組成，如擬南芥中有大約100個(gè)成員[13]。根據(jù)HB基因中同源異形盒的序列、位置以及其他結(jié)構(gòu)域，可以將HB家族分為6種類型：HD-Zip、PHD finger、BELL、ZF-HD、WOX和KNOX[14]。其中，ZF-HD為Zinc finger homeodomain，也稱為PLINC(Plant Zinc Finger)[13]，含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域和同源異形盒結(jié)構(gòu)域，是陸生植物特有的基因家族[15-16]。目前，在多個(gè)物種如擬南芥[13]、水稻[16]、楊樹(shù)[15]、小立碗蘚[16]、豆科植物[17-18]和葡萄[10]中鑒定了ZF-HD家族的基因。Windh?vel等[19]在C4植物黃花菊(Flaveriatrinervia)中發(fā)現(xiàn)4個(gè)ZF-HD基因可以特異結(jié)合葉肉細(xì)胞特異表達(dá)的PEPCase基因的啟動(dòng)子，暗示著這些基因可以調(diào)控PEPC基因的表達(dá)。Tan等[16]以擬南芥花特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子序列為誘餌載體，通過(guò)酵母單雜交實(shí)驗(yàn)篩選到了一系列ZF-HD轉(zhuǎn)錄因子，這些ZF-HD轉(zhuǎn)錄因子在花中的表達(dá)高于其他組織。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過(guò)量表達(dá)AtHB25后，花期提前，細(xì)胞和種子變大，并且種子壽命延長(zhǎng)[20]。Figueiredo等[21]通過(guò)酵母單雜交篩選到7個(gè)調(diào)控OsDREB1B基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其中有4個(gè)為ZF-HD基因(包括OsZHD1和OsZHD2)，表明這些轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控基因?qū)δ婢趁{迫的響應(yīng)。Xu等[9]從一個(gè)水稻卷葉突變體中定位到了OsZHD1，過(guò)表達(dá)OsZHD1及其同源基因OsZHD2都可以使水稻葉片發(fā)生卷曲，進(jìn)一步的研究表明，OsZHD1在水稻葉片形態(tài)發(fā)生尤其是泡狀細(xì)胞的形成和分布中行使功能。GmCAM4是大豆響應(yīng)病原菌脅迫的鈣調(diào)蛋白家族成員之一，Park等[22]發(fā)現(xiàn)，大豆GmZF-HD1和GmZF-HD2可以結(jié)合GmCAM4的啟動(dòng)子進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。這些研究表明，ZF-HD基因在植物葉片和花的生長(zhǎng)發(fā)育、種子貯藏以及病原菌脅迫方面具有重要的作用。需要指出的是，根據(jù)序列的多態(tài)性ZF-HD家族成員被劃分為7個(gè)Class，其中AtHB22、AtHB25和OsZHD1屬于Class Ⅰ，而GmZF-HD1和GmZF-HD2屬于Class VI[15]。

本研究克隆了OsZHD1、AtHB22和AtHB25在大豆中的同源基因Glyma.02g040100，命名為GmZHD1，對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；同時(shí)，研究了GmZHD1在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位以及GmZHD1在大豆不同組織中的表達(dá)情況。此外，構(gòu)建了植物過(guò)表達(dá)載體pBA002-GmZHD1，旨在為今后在大豆中過(guò)表達(dá)GmZHD1基因來(lái)研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

試驗(yàn)材料為大豆栽培豆科豐1號(hào)，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心提供。取大豆的根、莖、葉、花、莢和種子，迅速用液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱。

載體與試劑：pMD19-T載體購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；亞細(xì)胞定位載體HBT-sGFP(S65T)-NOS(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/118640535)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆實(shí)驗(yàn)室保存；植物過(guò)表達(dá)載體pBA002(10 182 bp)含有bar基因，具有草丁膦抗性，由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所陳受宜研究員惠贈(zèng)[23]；大腸桿菌感受態(tài)DH5α、植物總RNA提取試劑盒(DP437)和質(zhì)粒大提試劑盒(DP117)購(gòu)于天根生化科技有限公司；高保真酶Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase(P505)、菌液PCR所用的普通Taq酶2×TaqPlus Master Mix(P212-01)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(R232-01)和熒光定量試劑盒(Q141-02)均購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)于Axygen公司；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、XhoⅠ、SacⅠ和T4連接酶購(gòu)于Thermofisher公司。引物合成及測(cè)序工作由華大公司完成。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

使用RNA提取試劑盒提取大豆不同組織的總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳確定RNA質(zhì)量后，將RNA儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將大約2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20 ℃冰箱。

1.3 GmZHD1基因的克隆

根據(jù)Phytozome網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)上大豆GmZHD1(Glyma.02g040100)基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物用于GmZHD1基因的擴(kuò)增。上下游引物分別為：sense：5′-ATGAACGAATACACCTTTGGAC-3′，anti-sense：5′-CTAGGGCTTCTTACCGAGGG-3′。以大豆葉片cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL：2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix(dATP、dCTP、dGTP和dTTP的預(yù)混溶液，各自的濃度為10 mmol/L)1 μL，模板2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(1 U/μL)1 μL，ddH2O 17 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。使用1%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，割膠回收后加A接頭連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆后測(cè)序。

1.4 GmZHD1的生物信息學(xué)分析

利用網(wǎng)站http://web.expasy.org/protparam/分析GmZHD1蛋白的理化性質(zhì)；使用NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html)分別對(duì)磷酸化位點(diǎn)和蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；使用ProtComp 9.0(http://www.softberry.com/berry.phtml)預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位。

利用NCBI CDD數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)GmZHD1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域；在NCBI網(wǎng)站下載ZF-HD蛋白序列，使用Clustal X 2.0[24]進(jìn)行蛋白質(zhì)序列多重比對(duì)。使用MEGA 6.0[25]繪制進(jìn)化樹(shù)，使用鄰接法進(jìn)行分析，主要參數(shù)設(shè)置為：距離模型，p-distance；穩(wěn)健性檢測(cè)，Bootstrap法，1 000次重復(fù)；空位缺失數(shù)據(jù)的處理，Pairwise deletion。構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的蛋白包括：水稻OsZHD1-11[15]；擬南芥ZF-HD：AtHB21-34[16]；黃花菊：FtHB1-4[19]；大豆GmZF-HD1和GmZF-HD2[22]。

1.5 亞細(xì)胞定位載體HBT-GmZHD1的構(gòu)建

為構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體，在引物的5′端添加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，GmZHD1-F：5′-CGCGGATCCAT GAACGAATACACCTTTGGAC-3′，GmZHD1-R： 5′-CG CGGATCCGGGCTTCTTACCGAGGGT-3′(去掉終止密碼子TAG)，下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)序列。以測(cè)序正確的上述質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序如上所述。將PCR產(chǎn)物和亞細(xì)胞定位載體HBT-sGFP(S65T)-NOS分別用BamH Ⅰ進(jìn)行單酶切，電泳后的膠回收產(chǎn)物在T4連接酶作用下22 ℃連接30 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布含有Amp(50 μg/mL)的LB固體平板。挑選單克隆進(jìn)行菌液PCR，陽(yáng)性菌液提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，含有目的基因片段的菌液送測(cè)序，查看連接方向是否正確。將測(cè)序正確的菌液用試劑盒大提質(zhì)粒，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行濃縮。

1.6 亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位參考Campo等[26]的方法。首先用基因槍(Bio-Rad)將含有目標(biāo)基因的載體HBT-GmZHD1和不含目標(biāo)基因的空載HBT-sGFP(S65T)-NOS分別轉(zhuǎn)化至洋蔥(Alliumcepa)表皮細(xì)胞，然后將洋蔥表皮放置在光照培養(yǎng)箱中，24 ℃黑暗條件培養(yǎng)16～24 h，最后用激光共聚焦顯微鏡(LSM780，Zeiss)查看GmZHD1的亞細(xì)胞定位情況。

1.7 GmZHD1基因表達(dá)特性分析

采用RT-PCR(Real-time PCR)檢測(cè)GmZHD1基因在大豆不同組織中的表達(dá)情況。根據(jù)GmZHD1基因序列設(shè)計(jì)定量引物：sense： 5′-ATGCTTGAACTT GCTGAAAAACTA-3′，anti-sense：5′-GCTTCTTACCGA GGGTGTGC-3′。大豆基因Tubulin(GenBank：AY907703.1)為內(nèi)參，引物序列為sense：5′-GGAGT TCACAGAGGCAGAG-3′，anti-sense：5′-CACTTACGC ATCACATAGCA-3′。RT-PCR反應(yīng)體系為20 μL：10 μL 2×Master Mix，2.5 μL 0.5 mmol/L primer 1，2.5 μL 0.5 mmol/L primer 2，5 μL cDNA(反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA用ddH2O稀釋10倍)。RT-PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。所用儀器為ABI7500，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，數(shù)據(jù)用ABI 7500 Sequence Detection System(SDS)software分析。使用2-ΔΔCt法[27]計(jì)算GmZHD1基因的表達(dá)，使用Origin 9.0軟件繪圖。

1.8 植物過(guò)表達(dá)載體pBA002-GmZHD1的構(gòu)建

為構(gòu)建植物過(guò)表達(dá)載體，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物，GmZHD1-XF：5′-CCGCTCGAGATGAACGAATA CACCTTTGGACA-3′，GmZHD1-SR：5′-CCGGAGCTCC TAGGGCTTCTTACCGAGGGT-3′(含終止密碼子)，下劃線分別為XhoⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)序列。以測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。將擴(kuò)增的片段連接到植物過(guò)表達(dá)載體pBA002上，將PCR檢測(cè)和酶切鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒用于后續(xù)植物轉(zhuǎn)基因研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmZHD1基因序列的擴(kuò)增

利用PCR方法從大豆葉片cDNA中擴(kuò)增GmZHD1基因，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了1 000 bp左右條帶(圖1)，該片段與預(yù)期目的片段大小一致。對(duì)PCR產(chǎn)物電泳回收后，將回收產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明GmZHD1基因全長(zhǎng)CDS為888 bp，與Phytozome中大豆Glyma.02g040100的CDS序列完全一致，即目的基因克隆成功，將該基因命名為GmZHD1。

1.目的基因；M.DL2000 plus DNA Marker。1.Target gene；M.DL2000 plus DNA Marker.

2.2 大豆GmZHD1的生物信息學(xué)分析

ProtParam分析表明，GmZHD1編碼295個(gè)氨基酸，理論上GmZHD1蛋白分子質(zhì)量為32.64 kDa，等電點(diǎn)為7.69，不穩(wěn)定系數(shù)為49.12，為不穩(wěn)定蛋白。磷酸化是一種普遍的蛋白質(zhì)修飾方式，與絕大多數(shù)細(xì)胞活動(dòng)密切相關(guān)[28]。NetPhos 3.1 Server預(yù)測(cè)結(jié)果表明，GmZHD1蛋白存在19個(gè)蘇氨酸、9個(gè)絲氨酸和3個(gè)酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)(圖2)，暗示著蛋白的翻譯后修飾可能對(duì)GmZHD1蛋白功能的實(shí)現(xiàn)具有重要作用。

使用GOR4 對(duì)GmZHD1的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，α螺旋(Hh)占39.66%，伸展鏈(Ee)占12.88%，無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)占47.46%。此外，ProtComp 9.0預(yù)測(cè)GmZHD1定位在細(xì)胞核。

圖2 GmZHD1蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

將擬南芥、水稻和黃花菊中的ZF-HD蛋白與GmZHD1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，GmZHD1與FtHB2、AtHB22、AtHB25、OsZHD1、OsZHD2為一個(gè)分支，表明它們親緣關(guān)系較近(圖3)；而GmZF-HD1和GmZF-HD2處于進(jìn)化樹(shù)外圍位置的另外一個(gè)分支上，表明它們與GmZHD1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。將FtHB2、AtHB22、AtHB25、OsZHD1和OsZHD2與GmZHD1的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些蛋白含有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(圖4)，即GmZHD1的97-147AA和232-295AA區(qū)域，分別為鋅指結(jié)構(gòu)域(Zinc finger domain)和同源異形盒結(jié)構(gòu)域(Homeodomain)，前者介導(dǎo)蛋白二聚體的形成，后者可以與DNA特異結(jié)合。此外，GmZHD1與FtHB2序列一致性最高，為44.4%；GmZHD1與AtHB22、AtHB25、OsZHD1和OsZHD2序列一致性較高，分別為41.6%，36.9%，43.4%，42.2%。

圖3 GmZHD1和其他物種ZHD蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖4 四種植物中ZHD的氨基酸序列比對(duì)

2.3 GmZHD1的亞細(xì)胞定位

利用單酶切方法構(gòu)建了亞細(xì)胞定位載體HBT-GmZHD1(圖5)，然后用基因槍將HBT-GmZHD1載體轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，空載HBT-sGFP(S65T)-NOS作為陽(yáng)性對(duì)照。亞細(xì)胞定位顯示在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中可以檢測(cè)到GFP信號(hào)(圖6)，初步證明GmZHD1定位于細(xì)胞核。

1.BamH Ⅰ單酶切片段；M.DL15000 DNA Marker。1.Fragments of vector digested by BamHⅠ；M.DL15000 DNA Marker.

2.4 GmZHD1的組織表達(dá)分析

為了研究GmZHD1基因的表達(dá)模式，利用RT-PCR技術(shù)分析了GmZHD1在大豆不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，GmZHD1在根、莖、葉、花、莢和種子中都有表達(dá)，但是不同組織的表達(dá)存在明顯差異(圖7)。其中，花中表達(dá)量最高，其次是種子和葉片，根、莖和莢中表達(dá)量較低，推測(cè)GmZHD1可能在大豆花、葉片和種子發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。

1.暗場(chǎng)；2.明場(chǎng)；3.融合；上.陽(yáng)性對(duì)照；下.GmZHD1。1.Dark field；2.Bright field；3.Merge；Upper panel.Positive control；Lower panel.GmZHD1.

圖7 GmZHD1在大豆不同組織中的表達(dá)分析

2.5 GmZHD1植物過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

利用雙酶切方法構(gòu)建了植物過(guò)表達(dá)載體pBA002-GmZHD1，利用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和SacⅠ將載體切為2個(gè)片段，分別為10 134，888 bp，表明載體構(gòu)建成功(圖8)。

1.XhoⅠ/SacⅠ酶切片段；M.DL15000 DNA Marker。1.Fragments of vector digested by Xho Ⅰ/Sac Ⅰ；M.DL15000 DNA Marker.

3 結(jié)論與討論

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，可以產(chǎn)生一系列從細(xì)胞到生理水平的應(yīng)答反應(yīng)來(lái)適應(yīng)外界環(huán)境的變化，這些反應(yīng)通常由轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)抑制或激活基因的表達(dá)來(lái)完成[29]。HB基因家族是植物眾多轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。本研究從大豆中克隆了1個(gè)ZF-HD家族基因Glyma.02g040100，將其命名為GmZHD1。該基因編碼295個(gè)氨基酸，蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)其具有典型的ZF-HD家族的鋅指結(jié)構(gòu)域和同源異形盒結(jié)構(gòu)域。前人的研究表明，OsZHD1含鋅指結(jié)構(gòu)域的N端1-111AA序列具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，而含同源異形盒結(jié)構(gòu)域的C端112-279AA并不存在自激活[9]；黃花菊中ZF-HD基因的N端結(jié)構(gòu)域與其同源蛋白可以形成二聚體，N端結(jié)構(gòu)域則主要負(fù)責(zé)結(jié)合DNA[19]。進(jìn)化分析結(jié)果表明，同一個(gè)分支中同時(shí)包含擬南芥和水稻的基因，推測(cè)基因組復(fù)制可能發(fā)生在基因功能分化之前；相比黃花菊、擬南芥和水稻ZF-HD家族的其他成員，GmZHD1與FtHB2、AtHB22、AtHB25、OsZHD1和 OsZHD2親緣關(guān)系更近，推測(cè)它們可能具有相似的功能。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，GmZHD1定位在細(xì)胞核，這與其同源蛋白OsZHD1的定位結(jié)果是一致的[9-21]，預(yù)示著GmZHD1作為轉(zhuǎn)錄因子行使功能，對(duì)于下一步GmZHD1基因功能的研究具有指導(dǎo)意義。

ZF-HD家族基因在植物的各個(gè)組織器官中都有表達(dá)，但是不同基因之間的表達(dá)水平存在差異。如在擬南芥ZF-HD基因(AtHB21-34)中，AtHB24和AtHB29在根中的表達(dá)明顯高于其他基因，AtHB22和AtHB25在花中表達(dá)量較高，其中AtHB22在開(kāi)放的花中表達(dá)較高，而AtHB25在花序中表達(dá)較高[16]；水稻OsZHD1在根、葉片、小穗和節(jié)間都有表達(dá)，并且基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著葉片和小穗發(fā)育時(shí)期的變化而有所不同[9]；黃花菊FtHB22在葉片和莖中表達(dá)，而在根中的表達(dá)幾乎檢測(cè)不到。熒光定量結(jié)果顯示，GmZHD1在大豆花、葉片和種子中表達(dá)較高，其中花中表達(dá)最高，暗示GmZHD1可能在這些組織中發(fā)揮作用。

ZF-HD家族成員之間具有相似的結(jié)構(gòu)域，可能存在功能冗余的現(xiàn)象。如擬南芥AtHB22、AtHB23、AtHB25、AtHB29、AtHB31、AtHB32、AtHB33和AtHB34的T-DNA插入突變體，與野生型擬南芥相比，Tan和Irish[17]并沒(méi)有觀測(cè)到發(fā)育和形態(tài)學(xué)方面的差異。同時(shí)，水稻中OsZHD1干擾轉(zhuǎn)基因植株和T-DNA插入突變體中，盡管OsZHD1表達(dá)明顯降低，但是并沒(méi)有導(dǎo)致形態(tài)學(xué)上的變化[9]。不過(guò)，在擬南芥中過(guò)量表達(dá)AtHB25后，擬南芥種子變大，花期提前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果表明一些GA誘導(dǎo)的基因上調(diào)表達(dá)，同時(shí)一些GA抑制(如響應(yīng)ABA、脫水和非生物脅迫)的基因下調(diào)表達(dá)[20]。有意思的是，水稻OsZHD1和OsZHD2不僅與葉片卷曲有關(guān)，而且可以抑制脅迫響應(yīng)基因OsDREB1B的表達(dá)[21]，這些研究表明AtHB25、OsZHD1和OsZHD2可能在種子和花朵發(fā)育和/或植物響應(yīng)脅迫過(guò)程中發(fā)揮作用。本研究構(gòu)建了植物過(guò)表達(dá)載體pBA002-GmZHD1，為后續(xù)通過(guò)轉(zhuǎn)基因來(lái)研究大豆GmZHD1基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

[1] 劉國(guó)振, 朱立煌. 植物同源盒基因的克隆與功能研究[J]. 遺傳,1998，20(3):42-47.

[2] 郝 好, 崔永濤,錢 前, 等. 水稻同源異形盒基因的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)稻米, 2016(1): 1-9.

[3] Gehring W J, Affolter M, Burglin T. Homeodomain proteins[J]. Annual Review of Biochemistry, 1994, 63(1): 487-526.

[4] Vollbrecht E, Veit B, Sinha N, et al. The developmental gene Knotted-1 is a member of a maize homeobox gene family[J]. Nature, 1991, 350(6315): 241-243.

[5] Nam J, Nei M. Evolutionary change of the numbers of homeobox genes in bilateral animals[J]. Molecular Biology and Evolution, 2005, 22(12): 2386-2394.

[6] Shu Y, Tao Y, Wang S, et al.GmSBH1, a homeobox transcription factor gene, relates to growth and development and involves in response to high temperature and humidity stress in soybean[J]. Plant Cell Rep, 2015, 34(11): 1927-1937.

[7] Nakamura M, Katsumata H, Abe M, et al. Characterization of the class IV homeodomain-leucine zipper gene family inArabidopsis[J]. Plant Physiology, 2006, 141(4): 1363-1375.

[8] Nakata M, Matsumoto N, Tsugeki R, et al. Roles of the middle domain-specific WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX genes in early development of leaves inArabidopsis[J]. Plant Cell, 2012, 24(2): 519-535.

[9] Xu Y, Wang Y, Long Q, et al. Overexpression of OsZHD1 , a zinc finger homeodomain class homeobox transcription factor, induces abaxially curled and drooping leaf in rice[J]. Planta, 2014, 239(4): 803-816.

[10] Wang H, Yin X, Li X, et al. Genome-wide identification, evolution and expression analysis of the grape (VitisviniferaL.) zinc finger-homeodomain gene family[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(4): 5730-5748.

[11] Zhang S, Haider I, Kohlen W, et al. Function of the HD-Zip I geneOshox22 in ABA-mediated drought and salt tolerances in rice[J]. Plant Mol Biol, 2012, 80(6): 571-585.

[12] Turchi L, Baima S, Morelli G, et al. Interplay of HD-Zip Ⅱ and Ⅲ transcription factors in auxin-regulated plant development[J]. J Exp Bot, 2015, 66(16): 5043-5053.

[13] Mukherjee K, Brocchieri L, Bürglin T R. A comprehensive classification and evolutionary analysis of plant homeobox genes[J]. Molecular Biology & Evolution, 2009, 26(12): 2775-2794.

[14] Ariel F D, Manavella P A, Dezar C A, et al. The true story of the HD-Zip family[J]. Trends Plant Sci, 2007, 12(9): 419-426.

[15] Wei H, Depamphilis C W, Ma H. Phylogenetic analysis of the plant-specific zinc finger-homeobox and mini zinc finger gene families[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50(8): 1031-1045.

[16] Tan Q K, Irish V F. TheArabidopsiszinc finger-homeodomain genes encode proteins with unique biochemical properties that are coordinately expressed during floral development[J]. Plant Physiol, 2006, 140(3): 1095-1108.

[17] Bhattacharjee A, Ghangal R, Garg R, et al. Genome-wide analysis of homeobox gene family in legumes: identification, gene duplication and expression profiling[J]. PLoS One, 2015, 10(3): e0119198.

[18] 張大勇, 王長(zhǎng)彪, 易金鑫, 等. 大豆ZF-HD蛋白家族的全基因組序列特征分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,

27(3): 675-677.

[19] Windh?vel A, Hein I, Dabrowa R, et al. Characterization of a novel class of plant homeodomain proteins that bind to the C4phosphoenolpyruvate carboxylase gene ofFlaveriatrinervia[J]. Plant Molecular Biology, 2001, 45(2): 201-214.

[21] Figueiredo D D, Barros P M, Cordeiro A M, et al. Seven zinc-finger transcription factors are novel regulators of the stress responsive geneOsDREB1B[J]. J Exp Bot, 2012, 63(10): 3643-3656.

[22] Park H C, Kim M L, Lee S M, et al. Pathogen-induced binding of the soybean zinc finger homeodomain proteins GmZF-HD1 and GmZF-HD2 to two repeats of ATTA homeodomain binding site in the calmodulin isoform 4 (GmCaM4) promoter[J]. Nucleic Acids Res, 2007, 35(11): 3612-3623.

[23] 寧愛(ài)玲, 杜海平, 喻德躍, 等.GmAOC3基因轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化大豆的初步研究[J]. 大豆科學(xué),2015，34(4): 588-596.

[24] Larkin M A, Blackshields G, Brown N P, et al. Clustal W and Clustal X version 2.0[J]. Bioinformatics, 2007, 23(21): 2947-2948.

[25] Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0[J]. Mol Biol Evol, 2013, 30(12): 2725-2729.

[26] Campo S, Segundo B S. Overexpression of a calcium-dependent protein kinase confers salt and drought tolerance in rice by preventing membrane lipid peroxidation[J]. Plant Physiology, 2014, 165(2): 688-704.

[27] Schmittgen T D, Livak K J. Analyzing Real-time PCR data by the comparative CT method[J]. Nature Protocols, 2008, 3(6): 1101-1108.

[28] Humphrey, James, David E, et al. Protein phosphorylation: A major switch mechanism for metabolic regulation[J]. Trends in Endocrinology & Metabolism, 2015, 26(12): 676-687.

[29] Harris J C, Hrmova M, Lopato S, et al. Modulation of plant growth by HD-Zip class Ⅰ and Ⅱ transcription factors in response to environmental stimuli[J]. New Phytol, 2011, 190(4): 823-837.

Cloning and Expression Analysis of ZF-HD Transcription FactorGmZHD1 inGlycinemax

ZHANG Jinyu1，2，CHAO Maoni2，DU Hongyang1，YU Deyue1，HUANG Fang1

(1.Nanjing Agricultural University，National Center for Soybean Improvement，Nanjing 210095，China；2.Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，China)

The ZF-HD(Zinc finger homeodomain)transcription factors，which belong to Homeobox protein family，are unique to plant kingdom and play an important role in the development of flowers and leaves in plants.The Glyma.02g040100 gene，a ZF-HD transcription factor，was isolated from soybean cultivar Kefeng No.1 by PCR method and was named asGmZHD1.Bioinformatics analysis showed that this gene contained 888 bp encoding 295 amino acid residues and the molecular weight of GmZHD1 protein was 32.64 kDa with a theoretical isoelectric point(pI)7.69.Sequence analysis indicated that GmZHD1 possessed two conserved domains，a zinc finger domain and a homeobox domain，and shares highest sequence similarity with FtHB2(44.4%)；The result of subcellular localization indicated that GmZHD1 was located in nucleus；And RT-PCR results showed thatGmZHD1 expressed in all tissues detected，and with relatively higher transcript expression levels in flower，seed and leaf.In addition，theGmZHD1 was linked to the plant over-expression vector pBA002 successfully，providing foundation for further study on the function ofGmZHD1 in soybean.

Glycinemax；GmZHD1；Subcellular localization；RT-PCR

2017-02-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371644)

張晉玉(1989-)，女，河南林州人，博士，主要從事大豆分子生物技術(shù)研究。

黃 方(1977-)，女，天津人，教授，博士，主要從事大豆分子生物技術(shù)研究。

S565.1；Q78

A

1000-7091(2017)02-0001-07

10.7668/hbnxb.2017.02.001