利用細(xì)胞模型和動(dòng)物模型篩選抗過敏菌株

段翠翠，趙玉娟，高磊，牛春華，王春玲，李盛鈺

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，長春130033）

利用細(xì)胞模型和動(dòng)物模型篩選抗過敏菌株

段翠翠，趙玉娟，高磊，牛春華，王春玲，李盛鈺

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，長春130033）

食物過敏是機(jī)體對食物中的主要過敏原產(chǎn)生不正常免疫應(yīng)答而導(dǎo)致的一種變態(tài)反應(yīng)。相關(guān)研究表明食物過敏主要是由Th1/Th2細(xì)胞失衡所致，提示糾正Th1/Th2失衡可緩解食物過敏。近年來，利用益生菌特有的抗過敏作用緩解食物過敏是治療食物過敏的新方向。但缺少篩選用于治療或預(yù)防過敏反應(yīng)的益生菌的方法，本研究利用細(xì)胞模型和動(dòng)物模型篩選具有提高IFN-γ分泌水平，降低IL-4分泌水平的乳酸菌，可快速準(zhǔn)確地篩選到具有抗過敏功能的菌株。

植物乳桿菌；抗過敏；動(dòng)物模型；Th1/Th2平衡

0 引言

食物過敏是機(jī)體對食物中的過敏原產(chǎn)生不正常免疫應(yīng)答所引發(fā)的一種變態(tài)反應(yīng)，可造成過敏性鼻炎、哮喘、腹瀉等疾病[1]。益生菌是對宿主健康發(fā)揮有益作用的活的微生物，在過敏機(jī)體中補(bǔ)充益生菌可緩解過敏反應(yīng)[2]。研究者發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分泌不同細(xì)胞因子來影響免疫反應(yīng)，提示具有抗過敏潛力[3-4]。乳酸桿菌可抑制致敏小鼠體內(nèi)總IgE和抗原特異性IgE的產(chǎn)生，增強(qiáng)IL-12和IFN-γ的分泌而抑制IL-4的產(chǎn)生，進(jìn)而調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡[5-7]。

本研究利用細(xì)胞模型和動(dòng)物模型篩選具有提高IFN-γ分泌水平，降低IL-4分泌水平的乳酸桿菌，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所篩選菌株的抗過敏效果。該方法簡單可行、實(shí)驗(yàn)周期短、可信度非常高，可為科研工作者節(jié)約大量時(shí)間。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4～6周齡雌性清潔級Balb/c小鼠，體重16～18 g，購自長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號：SCXK（吉）2011-0007，飼養(yǎng)于室溫22℃，光照14 h（06:00-20:00），黑暗10 h條件下，自由采食和飲水。

1.1.2 菌株

28株植物乳桿菌分離自東北酸菜和內(nèi)蒙古發(fā)酵乳制品，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所乳品加工實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要化學(xué)試劑

卵白蛋白（Ovalbumin，OVA），弗氏完全佐劑，RPMI-1640培養(yǎng)液，青鏈霉素，胎牛血清，紅細(xì)胞裂解液，總IgE試劑盒，IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒。

1.1.4 儀器設(shè)備

Model 680酶標(biāo)儀，MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋，BCN-1360B超凈工作臺，HZQ-Q電熱恒溫培養(yǎng)箱，胎牛血清，梅特勒-托利多Delta320 pH計(jì)，移液槍。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化及菌懸液的制備

將28株植物乳桿菌（耐酸耐膽鹽）的凍干粉接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)至穩(wěn)定期，3 000 r/min離心10 min收集菌體。無菌PBS重懸，平板計(jì)數(shù)測定菌數(shù)，將菌懸液濃度調(diào)整至約1×109mL-1備用。

1.2.2 脾細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將小鼠脫頸處死，于70%酒精中浸泡5 min對小鼠進(jìn)行表面殺菌，無菌條件下取脾臟，放入裝有RP?MI-1640完全培養(yǎng)液（10%胎牛血清+1%青鏈霉素）的平皿中，用1 mL注射器反復(fù)沖洗脾臟，直至脾臟由暗紅色變?yōu)闇\紅色。棄脾，收集脾細(xì)胞，離心去上清，加入紅細(xì)胞裂解液裂解1 min，RPMI-1640完全培養(yǎng)液洗滌3次，獲得脾細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106mL-1備用。

1.2.3 植物乳桿菌刺激脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的測定

將脾細(xì)胞與植物乳桿菌按照1∶1共培養(yǎng)，加入刺激物OVA(Ovalbumin)，終質(zhì)量濃度為1 mg/mL。72 h后離心收集細(xì)胞上清，利用ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4和IFN-γ的分泌水平。

1.2.4 建立動(dòng)物模型

將6～8周齡雌性Balb/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，然后隨機(jī)分為4組（每組8只），分別為空白組、致敏組、預(yù)防組和治療組。致敏組腹腔注射0.2 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL混勻的過敏原（1 mL弗氏佐劑+1 mL質(zhì)量濃度1 mg/mL OVA），每周1次，共3次注射，第3次注射6 h后處死。為了判斷是否成功建立動(dòng)物模型，我們觀察了致敏癥狀，每周尾靜脈采血檢測IgE水平。預(yù)防組小鼠灌胃0.1 mL 1×109mL-1的菌液，每周3次，持續(xù)3周，并在第7、14、21 d腹腔注射1 mg/mL混勻的過敏原；治療組在小鼠最后一次致敏后，以0.1 mL灌胃1×109mL-1的菌液，共灌胃9 d；空白組則灌胃0.1 mL的生理鹽水，每周3次，持續(xù)兩周。建模結(jié)束后處死小鼠，分離脾臟，提取脾細(xì)胞，采用眼球取血，分離血清-80℃保存，待檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.5 腸道通透性的檢測

第二周皮下注射后，致敏組小鼠中取2只尾靜脈注射1mL芝加哥藍(lán)(1%)，10 min后脫頸處死小鼠，截取同部位等質(zhì)量的小腸，置于500 μL甲酰胺中，5 d后使用分光光度計(jì)測量620 mn處的吸光值，即代表小鼠的腸壁血管通透性，治療組和預(yù)防組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以同樣方式處理，檢測灌胃植物乳桿菌后腸壁血管的通透性。

1.2.6 ELISA法檢測脾細(xì)胞上清中細(xì)胞因子水平

無菌取小鼠脾細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度為2×106mL-1分別接種于6孔板中，同時(shí)加入OVA和植物乳桿菌與脾細(xì)胞共培養(yǎng)，37℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)48 h，離心收集上清用于檢測IL-4和IFN-γ的水平。

1.2.7 ELISA法檢測血清中細(xì)胞因子水平

建模結(jié)束后，摘眼球取血，37℃恒溫箱中靜置1 h，然后4℃條件下，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min離心10 min，取上清，放置于-80℃冰箱中保存，采用ELISA法檢測小鼠血清中細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的水平。

1.2.8 ELISA法檢測血清總IgE水平

建模結(jié)束后，摘眼球取血，37℃恒溫箱中靜置1 h，然后4℃條件下，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min離心10 min，取上清，放置于-80℃冰箱中保存，按試劑盒說明書測定血清總lgE的水平。450 nm處讀取OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05認(rèn)為差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 植物乳桿菌對小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

28株植物乳桿菌分別與小鼠脾細(xì)胞體外共培養(yǎng)，加入OVA刺激，采用ELISA法檢測脾細(xì)胞上清中IFN-γ和IL-4的分泌水平。IFN-γ主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，屬于Th1型細(xì)胞因子，機(jī)體發(fā)生過敏反應(yīng)時(shí)，IFN-γ促進(jìn)Th細(xì)胞向Th1分化從而對I型超敏反應(yīng)起到抑制作用，由于菌株對脾細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)細(xì)胞因子的水平差異較大，選擇可刺激脾細(xì)胞分泌

IFN-γ水平為主要因素，體外實(shí)驗(yàn)初步篩選獲得SnT、Sc52、Sc9和CH4，這4株菌能夠刺激脾細(xì)胞分泌較高水平的IFN-γ，所以我們選擇這4株菌作為具有免疫調(diào)節(jié)潛力的益生菌株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表1 植物乳桿菌對小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響pg/mL

2.2 成功建立食物過敏動(dòng)物模型的判定方法

為了利用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證體外所篩選菌株的抗過敏功能，以O(shè)VA為致敏原，利用Balb/c小鼠建立食物過敏動(dòng)物模型。第一次腹腔注射OVA致敏后，觀察小鼠免疫狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)致敏組小鼠出現(xiàn)抓耳、撓腮、活力降低、呼吸困難，毛發(fā)豎起的反應(yīng)。建模過程中小鼠體重比空白組明顯下降，出現(xiàn)此現(xiàn)象可能是因腹腔注射OVA致敏所致，小鼠對OVA致敏反應(yīng)強(qiáng)烈，導(dǎo)致體重下降。此外，建模結(jié)束處死小鼠后，摘取脾臟，發(fā)現(xiàn)致敏組與空白組相比免疫器官脾臟出現(xiàn)肥大現(xiàn)象。每周尾靜脈采血，檢測血清中的IgE水平，在末次激發(fā)后，IgE水平達(dá)到最高，是成功建立食物過敏模型的典型標(biāo)志（圖1）。

圖1 不同處理時(shí)間血清中的IgE水平

2.3 植物乳桿菌對致敏小鼠腸壁血管通透性的影響

受到抗原刺激后，小鼠發(fā)生過敏反應(yīng)，腸壁血管通透性會(huì)發(fā)生變化，如圖2所示。由圖2可以看出，致敏組小鼠腸壁血管通透性最高，但是灌胃4株乳酸菌后，腸壁血管通透性顯著下降，與對照組沒有顯著差異，說明灌胃篩選到的植物乳桿菌后，腸壁血管通透性恢復(fù)正常，治療組與預(yù)防組結(jié)果一致。圖2中，?表示與致敏組相比差異顯著（P＜0.05）。

圖2 植物乳桿菌對致敏小鼠腸壁血管通透性的影響

2.4 植物乳桿菌對致敏小鼠血清分泌細(xì)胞因子的影響

I型過敏性反應(yīng)的顯著特征是血清中IgE水平的升高，通常被認(rèn)為是由Th1和Th2型細(xì)胞失衡造成的[4]。本研究結(jié)果如下表所示，致敏組小鼠血清中IL-4水平顯著升高（P＜0.05），IFN-γ水平顯著降低（P＜0.05）。預(yù)防組和治療組結(jié)果提示，4株植物乳桿菌均可下調(diào)IL-4的分泌水平（P＜0.05），上調(diào)IFN-γ的分泌水平（P＜0.05），并且SnT、Sc52和Sc9治療組IFN-γ的分泌水平顯著增加（P＜0.05）。這些結(jié)果提示，植物乳桿菌可能通過下調(diào)IL-4，上調(diào)IFN-γ的水平來影響Th1/ Th2平衡，進(jìn)而緩解過敏反應(yīng)，可通過科學(xué)調(diào)配應(yīng)用于防治食物過敏癥狀。

表2 植物乳桿菌對致敏小鼠血清分泌Th細(xì)胞因子的影響pg/mL

2.5 植物乳桿菌對致敏小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-12等細(xì)胞因子，抑制機(jī)體產(chǎn)生IgE。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5等細(xì)胞因子，促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生IgE。細(xì)胞因子間相互刺激，在動(dòng)態(tài)平衡中調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞免疫。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取各組小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。與致敏組相比，四株植物乳桿菌均可抑制致敏小鼠脾細(xì)胞分泌IL-4，其中SnT和Sc52顯著抑制IL-4分泌水平的增加，而植物乳桿菌Sc9下調(diào)IL-4的作用最顯著，接近對照組，植物乳桿菌CH4組IL-4水平低于致敏組，但是差異不顯著。此外，我們檢測了植物乳桿菌對致敏小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ的影響，結(jié)果表明，灌胃植物乳桿菌SnT、Sc52和Sc9后，小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ的水平顯著增加，而灌胃植物乳桿菌CH4后，雖然IFN-γ的分泌水平與致敏組相比顯著增加，但是顯著低于空白組。

2.6 植物乳桿菌對小鼠血清總IgE水平的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，摘眼球取血，利用ELISA方法檢測各實(shí)驗(yàn)組中血清中總IgE水平的變化，如圖3所示。結(jié)果表明，致敏小鼠血清總IgE含量顯著高于空白組（P＜0.05），灌胃各種乳酸菌的預(yù)防組和治療組小鼠血清中的總IgE水平均顯著低于致敏組（P＜0.05）。通過結(jié)果可知，SnT、Sc52、Sc79和CH4均有效抑制總IgE水平（P＜0.05），進(jìn)而緩解食物過敏。圖3中，?表示與致敏組相比差異顯著（P＜0.05）。

表3 植物乳桿菌對致敏小鼠脾細(xì)胞分泌Th細(xì)胞因子的影響pg/mL

圖3 植物乳桿菌對小鼠血清總IgE水平的影響

3 討論

大量研究證實(shí)某些乳酸菌具有抗過敏功能，表現(xiàn)為刺激免疫細(xì)胞分泌某種細(xì)胞因子來發(fā)揮抗過敏作用[8-9]。因此，可以利用這一特點(diǎn)來篩選具有抗過敏潛力的乳酸菌。食物過敏的顯著特征是IL-4水平升高，IFN-γ水平降低，即存在Th1/Th2細(xì)胞失衡，本研究首先利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)從耐酸、耐膽鹽菌株中篩選能夠刺激免疫細(xì)胞分泌高水平IFN-γ的菌株，然后以O(shè)VA為致敏原，Balb/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立致敏動(dòng)物模型，灌胃篩選到的具有抗過敏潛力的乳酸菌，利用動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證所篩選菌株的抗過敏能力。

在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，我們分離培養(yǎng)脾細(xì)胞，將28株乳酸菌與脾細(xì)胞共培養(yǎng)，利用ELISA方法檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子水平。我們篩選到了四株具有抗過敏潛力的乳酸菌，分別為SnT，Sc52，Sc79和CH4，這4株菌可以刺激脾細(xì)胞產(chǎn)生較高水平的IFN-γ，提示其可能通過上調(diào)機(jī)體中IFN-γ水平來緩解過敏反應(yīng)，但是體外實(shí)驗(yàn)并不能完全證實(shí)此益生功能，我們需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

以Balb/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，腹腔注射致敏原OVA，建立食物致敏模型，灌胃植物乳桿菌后，致敏癥狀減輕，不再表現(xiàn)出抓耳、撓腮、活力降低和呼吸困難等癥狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后我們檢測了脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子水平，結(jié)果證實(shí)4株乳酸菌可以上調(diào)致敏小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平，下調(diào)IL-4的水平，提示乳酸菌可通過糾正過敏機(jī)體中的Th1/Th2平衡來緩解食物過敏，血清檢測結(jié)果也證實(shí)了這一推斷。

IgE在食物過敏反應(yīng)中起重要作用。當(dāng)初次接觸過敏原后刺激機(jī)體產(chǎn)生IgE，IgE在肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面結(jié)合使機(jī)體呈致敏狀態(tài)。研究表明，在益生菌干預(yù)下可有效降低IgE的產(chǎn)生[4,6,10]。因此我們檢測了各組小鼠血清中的IgE水平，灌胃植物乳桿菌4株乳酸菌后，小鼠血清中IgE水平顯著降低，提示這4株乳酸菌可通過降低體內(nèi)IgE水平緩解食物過敏反應(yīng)。從免疫學(xué)角度來說，IgE水平降低往往伴隨IFN-γ水平升高，即IFN-γ可調(diào)控IgE的產(chǎn)生。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

本研究利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)篩選到具有抗過敏潛力的乳酸菌，并利用動(dòng)物模型驗(yàn)證了4株乳酸菌的抗過敏能力，成功獲得具有抗過敏功能的乳酸菌。該方法實(shí)驗(yàn)周期短，投入成本低，如果將過敏原換成β-乳球蛋白就可以建立牛乳過敏模型，因此這是一種可以推廣使用的用于篩選抗過敏菌株的有效方法。

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Screening of Lactic acid bacteria(LAB)characterized by antianaphylaxis using cell and animal models

DUAN Cuicui,ZHAO Yujuan,GAO Lei,NIU Chunhua,WANG Chunling,LI Shengyu
(Institute of Agri-food Technology,Jilin Academy of Agricultural Sciences,Changchun 130033,China)

Food allergy is an allergic reaction caused by abnormal immune response by human body to the main allergens in food.Related studies have shown that food allergies are mainly caused by Th1/Th2 imbalance,indicating that shifting Th1/Th2 imbalance can alleviate food allergies.In recent years,it is a new direction for the treatment of food allergy to use probiotic-specific anti-allergic effects.However,it is lack of screening method to obtain probiotics for the treatment or prevention of allergic reaction.This study used cell and animal models to screen anti-allergyLactic acid bacteriathat could up-regulate IFN-γ secretion level and down-regulate IL-4 secretion level so as to quickly and accurately obtain the target strains.

Lactobacillus plantarum;antianaphylaxis;animal model;Th1/Th2 balance

Q93-331

A

1001-2230（2017）05-0010-04

2016-10-24

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（奶牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-37）；中國博士后科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（2016M591500）；吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（c5282010318）。

段翠翠（1984-），女，博士研究生，研究方向?yàn)槿槠芳庸ぁ?/p>

李盛鈺