納米ZnO叉指電極阻抗傳感器用于細(xì)胞檢測研究

崔傳金，劉雙，龔瑞昆，田景瑞，張曉晨

（華北理工大學(xué)a:電氣工程學(xué)院;b:基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北唐山063200）

納米ZnO叉指電極阻抗傳感器用于細(xì)胞檢測研究

崔傳金a，劉雙a，龔瑞昆a，田景瑞b，張曉晨a

（華北理工大學(xué)a:電氣工程學(xué)院;b:基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北唐山063200）

新鮮牛奶中體細(xì)胞數(shù)是衡量牛奶品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，實(shí)現(xiàn)其快速、準(zhǔn)確、低成本檢測意義重大。用電化學(xué)沉積法將納米ZnO固定在微叉指金電極的表面，構(gòu)建了一種納米ZnO阻抗傳感器，在1 MHz內(nèi)用電化學(xué)工作站對傳感器中不同細(xì)胞濃度的奶樣進(jìn)行檢測研究。結(jié)果表明修飾前后的阻抗圖譜變化明顯，修飾后阻抗傳感器明顯提高了檢測的精度和靈敏度，能正確區(qū)別0，1×105，3× 105，8×105，3.1×106mL-1的5個等級試驗(yàn)?zāi)虡樱粚鞲衅鳒y試牛奶的體系用等效電路模型代替進(jìn)行仿真研究，發(fā)現(xiàn)常相位角元件CPEC與牛奶中細(xì)胞的含量相關(guān)性最好，CPEC值可用作傳感器檢測牛奶體細(xì)胞的指標(biāo)。

納米ZnO；叉指電極；CPEC阻抗傳感器；細(xì)胞檢測

0 引言

牛奶是一種重要的食品，牛奶中體細(xì)胞數(shù)（somat?ic cell count，簡稱SCC)是評價新鮮牛奶質(zhì)量和奶牛乳腺健康狀況的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[1]。大多數(shù)西方發(fā)達(dá)國家都制定了相應(yīng)的含量標(biāo)準(zhǔn)[2]。因此，牛奶中體細(xì)胞數(shù)的快速檢測非常重要。雖然，現(xiàn)在有多種檢測牛奶體細(xì)胞的方法[2-3]，但是，準(zhǔn)確、快速、便捷、低成本的檢測方法仍需要進(jìn)一步的研究。

針對以上問題，本文采用微加工和納米技術(shù)構(gòu)建了一種納米ZnO叉指微陣列阻抗傳感器，對不同細(xì)胞濃度的奶樣進(jìn)行了測試，并用等效電路模型進(jìn)一步仿真研究了被測體系的阻抗組成，得到了一種快速、準(zhǔn)確、便捷的檢測牛奶體細(xì)胞含量的阻抗傳感器。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

Gamry Reference 600電化學(xué)工作站，C1-20B離心機(jī)，KQ218型超聲波清洗器，PHS-3EpH測量儀，DHG-9053A鼓風(fēng)干燥箱，Olympus顯微鏡，TOMY SX-700高壓鍋，thermo 1300 SERIES A2超凈工作臺，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱等。

六水硝酸鋅（Zn(NO3)2·6H2O）AR，丙酮（CH3COCH3）AR，無水乙醇（CH3CH2OH）AR，氫氧化鉀（KOH）AR，鹽酸（HCl）AR，K562細(xì)胞株，RP?MI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，胎牛血清，雙抗等。

1.2 傳感器的構(gòu)建

采用光刻剝離工藝制備叉指微陣列電極，如圖1（a）所示，共26對叉指，指長7 950 μm，指寬50 μm，間距50 μm，厚度0.1 μm。按照圖1（b）所示的工藝過程進(jìn)行加工[4]，選擇1 mm厚的石英玻璃作為傳感器基底，將基底清洗、烘干，在其表層旋涂光刻膠，后按設(shè)計(jì)尺寸進(jìn)行光刻，用整片浸沒式顯影技術(shù)顯影出電極形貌并烘干；然后在顯影好的電極上濺射鉻層和金層，最后剝離成預(yù)期的電極。

圖1 叉指電極的制作流程

本文采用陰極恒電位法[5]在金叉指電極表面沉積納米ZnO薄膜，化學(xué)總反應(yīng)式為

采用三電極系統(tǒng)制備納米氧化鋅，工作電極（WE）為金叉指電極，參比電極（RE）為飽和甘汞電極（SCE），輔助電極（CE）為鋅片電極。首先將工作電極表面清洗干凈，先用稀鹽酸浸泡5 min，再依次用丙酮、無水乙醇、超純水超聲15 min，常溫干燥后備用。配制濃度0.1 mol/mL的硝酸鋅溶液40 mL為電解液，攪拌均勻后放入恒溫?zé)忻芊饧訜嶂?5℃?zhèn)溆?。并用稀鹽酸和氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)硝酸鋅溶液的酸堿度至pH=5。將電極按照工作電極和輔助電極相對、且和參比電極相鄰的位置固定，再與電化學(xué)工作站連接。設(shè)置沉積電位為-1.0 V，沉積時間為10 min，穩(wěn)定2 min后開始沉積[6]。沉積好后傳感器放入干燥箱內(nèi)充分干燥，最后密封、避光保存。

1.3 測試實(shí)驗(yàn)

1.3.1 測試樣品的準(zhǔn)備

試驗(yàn)所用牛奶采自唐山市開平區(qū)正常生理期的同一頭奶牛。將采集的新鮮牛奶放入滅菌后的孔隙為5 μm的干凈砂芯過濾裝置中過濾除去牛奶中的雜質(zhì)和原有體細(xì)胞。試驗(yàn)用培養(yǎng)的K562細(xì)胞代替牛奶中的體細(xì)胞[7]，共配置5個濃度梯度的奶樣如表1所示。

首先計(jì)算好每個濃度所用細(xì)胞個數(shù)，將用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后的k562細(xì)胞懸液按照計(jì)算后的比例分成五份放在培養(yǎng)箱中備用（k562細(xì)胞17個小時分裂一次），每次測試試驗(yàn)之前再將分好的k562細(xì)胞懸浮溶液離心，去掉上清液，加入牛奶至5 mL，輕輕混勻后備用。為了保持細(xì)胞在牛奶中的活性，試驗(yàn)樣品現(xiàn)配現(xiàn)測。

1.3.2 測試實(shí)驗(yàn)

傳感器兩端分別與電化學(xué)工作站的兩條工作電極（W/WS）和輔助電極、參比電極（C/R））相連。取0.1 mL混勻的樣品溶液均勻滴到傳感器凹槽內(nèi)，如圖2所示。測試交流信號幅值為300 mV，測試頻率為10Hz-1MHz，每個樣品重復(fù)測量3次。

圖2 傳感器檢測實(shí)物

2 結(jié)果分析與討論

傳感器修飾納米氧化鋅后，會在叉指電極傳感器的表面會形成一層比較致密均勻的半導(dǎo)體納米ZnO薄膜，如圖3所示。由圖3可以看出，在金的表面形成了相對比較均勻致密的納米ZnO薄膜。用循環(huán)伏安法對傳感器進(jìn)行表征，并與修飾前的循環(huán)伏安圖譜進(jìn)行比較，如圖4所示,圖4中曲線1和曲線2分別是電極修飾前和修飾后的循環(huán)伏安曲線。由圖4可以看出，修飾前氧化還原峰比較明顯，在修飾了納米ZnO后氧化還原峰急劇減小，表明電極表面形成的納米ZnO已經(jīng)比較緊密的貼附在了金電極的表面，在傳感器表面制備了需要的納米ZnO薄膜。

圖3 納米ZnO修飾的叉指電極傳感器場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM）

圖4 納米ZnO修飾叉指電極前后的CV

用叉指電極傳感器在修飾ZnO前后分別測試了表1中5個不同細(xì)胞濃度奶樣得到了Bode圖，如圖5所示。圖5（a）中，曲線束1和曲線束2分別是電極修飾納米ZnO后和修飾納米ZnO前傳感器測取的阻抗曲線圖。

由圖5（a）可以看出，曲線1和2兩束阻抗曲線在10Hz～1MHz的頻率范圍內(nèi)，阻抗值都隨頻率值的增大而減小，這主要是由于叉指電極與牛奶間的界面電容隨頻率的變化引起的阻抗變化；從接近100 kHz時開始阻抗隨頻率的變化變得緩慢，并最終有保持在一定值的趨勢，這主要是因?yàn)閽呙桀l率增大到一定值后，牛奶的電阻逐漸成為阻抗的主導(dǎo)。另外，曲線1和2兩束阻抗曲線從100 Hz開始分離趨勢明顯，頻率越高阻抗差異越大，最后阻抗的差值保持在250 Ω左右，這主要是由電極表面的納米ZnO薄膜及薄膜表面吸附的細(xì)胞等物質(zhì)對電流的阻礙作用所致，與圖4所示的循環(huán)伏安圖譜結(jié)果相吻合。最后，圖5（a）中1和2兩束阻抗曲線的寬度不同，曲線1束阻抗圖譜較寬，即，不同細(xì)胞濃度奶樣的阻抗值差異大，這樣就提高了傳感器檢測的靈敏度和精度。取圖5（a）中曲線1的1 000～10 000Hz頻段阻抗譜得到（b）圖，（b）圖中曲線1至5分別對應(yīng)細(xì)胞含量從0～3.1×106mL-1的五個奶樣，由圖5（b）可以較清楚的看到奶樣中細(xì)胞含量從低到高，對應(yīng)樣品的阻抗也從低到高，有較好的對應(yīng)關(guān)系。

圖5 不同細(xì)胞濃度奶樣的Bode圖

為了更好的分析牛奶的頻譜響應(yīng)特性，一般用電路模型對電極系統(tǒng)進(jìn)行仿真研究[8]，文中用圖6所示的等效電路來等效納米ZnO叉指電極與牛奶組成的電極系統(tǒng)。

圖6中CPED用來描述電極與牛奶間的雙電層電容，由于存在“彌散效應(yīng)”[9]因此用常相位角元件CPED（constant phase element）來等效描述，其阻抗可以用式（2）表示，即

式中：Z為阻抗，單位Ω；ω為角頻率，單位Hz；Y0為CPED的參數(shù)，單位為Ω-1·cm-2·S-1；n為彌散系數(shù)，當(dāng)n=1時，它就是等效電容。Rs為牛奶電阻；Ri為界面電阻，由電子傳遞電阻和擴(kuò)散阻抗組成[10-11]。由于納米ZnO增加了電極的表面積、其高等電點(diǎn)和良好的生物兼容性更容易在電極的表面吸附牛奶中的細(xì)胞。因此用CPEC來表示細(xì)胞和電極間形成的電容，Rc為細(xì)胞質(zhì)電阻，是細(xì)胞內(nèi)部的介質(zhì)電阻。

圖6 等效電路模型

用Gamry Reference 600自帶的電路模型擬合軟件對修飾前后阻抗實(shí)測數(shù)據(jù)進(jìn)行仿真擬合，結(jié)果如圖7所示。圖7中，曲線1是電路模型對修飾后電極實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合曲線束，曲線2是電路模型對修飾前電極實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合曲線束。由圖7可以看出，電路模型可以很好的對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合；等效電路元件的仿真值如表1所示。

圖7 等效電路與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合結(jié)果

由表1可以看出，Rs在修飾后等效電阻有所增大，但隨細(xì)胞濃度的變化規(guī)律性不強(qiáng)。Ri修飾前后變化相對較大，修飾后界面電阻變小，說明納米ZnO在電化學(xué)反應(yīng)中起到了加速電子傳遞的作用，使得電子傳遞電阻變小，但隨細(xì)胞濃度的變化規(guī)律性不強(qiáng)。牛奶和電極間的相位角元件CPED在修飾后有增強(qiáng)的趨勢，但其值隨細(xì)胞濃度的變化規(guī)律性也不強(qiáng)。

CPEC的值在修飾前后變化較大，修飾前光滑的金電極表面對牛奶中大分子和細(xì)胞的吸附能力有限，牛奶中的體細(xì)胞和大分子蛋白質(zhì)類物質(zhì)主要懸浮在牛奶中，因此CPEC值較小。修飾納米ZnO后，電極的表面積增加，納米ZnO良好的生物兼容性和較高的等電點(diǎn)（9.5）使得電極表面很容易吸附體細(xì)胞和大分子蛋白質(zhì)物質(zhì)，使得電極與細(xì)胞之間形成的CPEC的值變大。在10 kHz的頻率下CPEC的值與五個不同濃度細(xì)胞含量的關(guān)系如圖8所示。由圖8可以看出，牛奶中從無細(xì)胞到有細(xì)胞CPEC的值變化較大，主要是細(xì)胞與電極間形成電容的原因。濃度從1×105mL-1到8× 105mL-1有較好的線性關(guān)系，對回歸曲線進(jìn)行計(jì)算，檢測閾值設(shè)為2%，如圖9所示，決定系數(shù)R2為0.9602。細(xì)胞從8×105mL-1增加到3.1×106mL-1時CPEC值增加不大，可能是由于傳感器表面達(dá)到飽和吸附狀態(tài)所致。雖然在圖9所示的細(xì)胞濃度區(qū)間內(nèi)能夠?qū)悠愤M(jìn)行正確的區(qū)分，但是檢測的閾值較小，區(qū)分度不夠好，可能主要是因?yàn)榧{米ZnO對牛奶中體細(xì)胞的特異性吸附不強(qiáng)所致，被吸附到電極表面的還有其它的一些物質(zhì)，如牛奶中的蛋白質(zhì)、脂肪和無機(jī)鹽等，這樣就大大降低了細(xì)胞在傳感器表面的附著率，使得細(xì)胞含量的決定性作用減弱。因此，要進(jìn)一步提高檢測細(xì)胞的靈敏度，應(yīng)當(dāng)增加細(xì)胞與傳感器表面的特異性吸附。

表1 等效電路中各元件的仿真值

圖8 10 kHz頻率下傳感器修飾后不同細(xì)胞濃度的CPEc值

圖9 10 kHz頻率下三個濃度測試樣品的擬合曲線

3 結(jié)論

本文用微加工技術(shù)，加工了微型叉指電極傳感器，并在傳感器的表面進(jìn)行了納米ZnO的修飾，在1 MHz以內(nèi)研究了傳感器檢測牛奶體細(xì)胞的頻譜特性。用等效電路模型研究了被測體系的阻抗特性，發(fā)現(xiàn)常相位角元件CPEC與細(xì)胞含量的關(guān)系密切，在10 kHz頻率下，在1×105mL-1到8×105mL-1的細(xì)胞濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。可作為一個檢測細(xì)胞含量的重要指標(biāo)，確定了納米ZnO在提高傳感器檢測精度方面的重要作用。另外，通過分析可以預(yù)測對納米ZnO表面進(jìn)行特殊修飾，實(shí)現(xiàn)其表面對牛奶中體細(xì)胞的特異性吸附應(yīng)該能夠極大提高傳感器的靈敏度。

[1]趙連生,王加啟,鄭楠,等.牛奶質(zhì)量安全主要風(fēng)險因子分析Ⅶ.體細(xì)胞數(shù)和菌落總數(shù)[J].中國畜牧獸醫(yī),2012,39(7):1-5.

[2]CAROLINE V,SUSHRUT A,NIAMH G,et al.Mastitis detection: current trends and future per spectives[J].Trends in Biotechnology, 2009,27(8):486-493.

[3]SHOHEI K,JUNJI F,ATSUSHI T,et al.On-chip diagnosis of sub?clinical mastitis in cows by electrochemical measurement of neutrophil activity in milk[J].Lab on a Chip,2012,12,1309-1315.

[4]陳穎慧,高楊,鄭英彬,等.剝離工藝制作SAW濾波器IDT的研究[J].微納電子技術(shù),2012，49(2):124-128.

[5]白珊珊.納米ZnO材料制備及其光電化學(xué)性能研究[D].哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2013:12-15.

[6]CHRISTOPH S,KONRAD W,BORIS S.Zinc exhaustion in ZnO electrodeposition[J].Thin Solid Films,2015,592:76-80.

[7]SHRAMIK S,DAVID A.B,HSUEH-CHIA C.A micro-scale multi-frequency reactance measurement technique to detect bacterial growth at low bio-particle concentrations[J].Lab Chip,2006,6：1-3.

[8]顏小飛,汪懋華,安冬.基于叉指陣列微電極的阻抗免疫傳感器研究進(jìn)展[J].分析化學(xué),2011,39(10):1601-1610.

[9]張鑒清.電化學(xué)測試技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2010：192-203.

[10]SHRIKRISHNAN S,LAKSHMINARAYANAN V.Electron trans?fer studies of redox probes in bovine milk[J].Journal of Colloid and Interface Science，2012,370:124–131.

[11]COUNIOT N,FLANDRE D,FRANCIS L A.Signal-to-noise ra?tio optimization for detecting bacteria with interdigitated micro?electrodes[J].Sensors and Actuators B:Chemical，2013,189:43–51.

Research of Nano-ZnO interdigitated array microelectrodes impedance sensors for sell detection

CUI Chuanjina,LIU Shuanga,GONG Ruikuna,TIAN Jingruib,ZHANG Xiaochena
（North China University of Science and Technology a.College of Electrical engineering;b.School of Basic Medical Sci?ences,Tangshan 063200,China）

Somatic cell count of fresh milk is one of the important indexes for milk quality evaluation.It is significant to realize its fast,accu?rate and low cost detection.A Nano-ZnO impedance sensor was constructed by immobilizing the Nano-ZnO which is deposited by elec?trochemical method on the surface of the gold interdigitated Array Microelectrodes.Electrochemical workstation was used to test the cell con?centrations below the test frequency 1MHz.The results showed that the changes of the impedance spectra were obvious,the sensor modified with Nano-ZnO can improve the detection accuracy and sensitivity,the 5 test samples which are 0,1×105,3×105,8×105and 3.1×106mL can be correctly distinguished.The equivalent circuit model of the electrochemical cell was introduced for interpretation of the impedance com?ponents of the system,and found that CPEChas a strong correlation with the somatic cell count,and can be used as an index of the sensor to detect the somatic cell count in milk.

Nano-ZnO;interdigitated microelectrode;impedance sensor;cell detection

TS252.7

A

1001-2230（2017）05-0023-04

2016-07-05

河北省自然科學(xué)基金（青年）項(xiàng)目（F2015209308）資助；河北省教育廳項(xiàng)目（ZD2016070）資助；河北省食品藥品監(jiān)督管理局項(xiàng)目（QN2015012）資助。

崔傳金（1982-），男，講師，研究方向?yàn)樯餀z測技術(shù)與智能儀器。