生鮮牛乳中抗生素殘留檢測技術(shù)研究進展

李丹妮，貢松松，顧欣，吳劍平，嚴鳳，潘娟，張婧

(1.上海市動物疫病預防控制中心，上海201103；2.上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司，上海200131)

生鮮牛乳中抗生素殘留檢測技術(shù)研究進展

李丹妮1，貢松松2，顧欣1，吳劍平1，嚴鳳1，潘娟1，張婧1

(1.上海市動物疫病預防控制中心，上海201103；2.上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司，上海200131)

對生鮮牛乳中抗生素殘留的來源、危害、最高殘留限量、殘留的檢測方法以及樣品前處理新方法進行了綜述，為開發(fā)抗生素多殘留篩查方法以及建立樣品通用前處理技術(shù)提供參考。

生鮮牛乳；抗生素殘留；最高殘留限量；檢測方法；前處理技術(shù)

0 引言

食品安全是關系國計民生的重大問題，其中牛乳中抗生素殘留問題又尤為突出。歐盟2377/90/EC已對獸藥殘留限量進行規(guī)定[1]，我國也也有相關規(guī)定[2]。抗生素在獸醫(yī)臨診和畜牧生產(chǎn)中均有大量應用，但有部分抗生素被違法濫用于飼料添加劑中[3]生鮮牛乳中抗生素殘留問題已經(jīng)對乳品的安全造成了威脅[4]。據(jù)報道[5]，市售生鮮牛乳中，抗生素殘留超標率達20%以上的藥物有8種。對我國西寧、南寧、北京等大城市乳制品質(zhì)量調(diào)查[6]結(jié)果顯示，抗生素殘留超標居不合格項目第一位。因此開發(fā)牛乳中抗生素多殘留篩查的方法，已成為迫切需求。本文綜述了生鮮牛乳中抗生素殘留的來源、危害、最高殘留限量、殘留檢測方法以及樣品前處理策略。

1 生鮮牛乳中抗生素殘留來源的多樣性

牛乳中抗生素的來源較多，途徑復雜。一般認為，對泌乳牛用藥不當或不注意休藥期是牛乳中抗生素殘留的重要因素，尤其是使用乳房灌注法治療乳腺炎時，易造成牛乳中抗生素的殘留。另外，把抗生素作為奶牛飼料添加劑使用，也是一個重要原因。其次，使用未經(jīng)徹底清洗和消毒的擠奶工具和貯奶用具也會造成抗生素殘留問題。此外，還有一些不法交奶戶在牛奶中加入抗生素防止牛奶酸敗等等[7-9]。

2 生鮮牛乳中抗生素殘留的危害

抗生素對于治療和減輕人類和動物的疾病，起到了巨大的作用。在奶牛飼養(yǎng)過程中，對于提高牛奶產(chǎn)量方面也做出了相當大的貢獻，很重要的原因是抗生素可以很好的防治奶牛的乳腺炎。但牛奶中殘留的抗生素對人體具有潛在的危害和毒副作用[10-15]，其飲用對象包括了嬰幼兒、青少年、老年人及孕期婦女，此類消費群體對牛乳中抗生素殘留的耐受性較弱，會對其身體健康造成更嚴重的威脅，比如：青霉素、四環(huán)素、磺胺類藥物均有一定抗原性，容易引起過敏反應；牛奶中殘留的抗生素會誘導人體產(chǎn)生耐藥性菌株，耐藥細菌可延長感染病人的住院時間，加重病人的經(jīng)濟負擔，縮短抗菌藥物的使用壽命，加大感染者的死亡危險性，造成疾病流行綿延不斷；牛奶中的抗生素會造成人體內(nèi)菌群平衡紊亂，菌群失調(diào)，降低人的免疫力；在生產(chǎn)發(fā)酵類乳制品，如酸奶的發(fā)酵生產(chǎn)中，牛奶中的抗生素可阻止發(fā)酵的正常進行，影響奶制品品質(zhì)，降低產(chǎn)量和質(zhì)量，給生產(chǎn)企業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失；排泄到環(huán)境中的某些抗生素會污染環(huán)境等。

3 生鮮牛乳中抗生素的最高殘留限量

歐盟對獸藥中抗生素的使用有嚴格的規(guī)定，通過發(fā)布一些條例和指令用于監(jiān)管，歐盟已從1998年起全面禁止人用抗生素用于飼料[16]。歐盟委員會指令96/ 23/EC[17]是對動物產(chǎn)品監(jiān)控和檢測的重要法規(guī)性文件。該指令將需要監(jiān)測的獸藥分為A、B兩組，其中B類包括各類抗生素（如磺胺和喹諾酮類等）。

日本“肯定列表制度”對食品中農(nóng)業(yè)化學品殘留限量的要求更加全面、嚴格[18]。其主要內(nèi)容包括暫定標準和一律標準。暫定標準即是對當前通用農(nóng)藥、獸藥和飼料添加劑都設定新的殘留限量標準；一律標準指對尚不能確定“暫定標準”的農(nóng)藥、獸藥及飼料添加劑都設定為10 μg/kg的統(tǒng)一標準。

我國農(nóng)業(yè)部先后頒布了176號、193號、235號公告[2,19-20]。176號公布了5類40種禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種，包括各種抗生素殘渣。抗生素殘渣是抗生素類產(chǎn)品生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的工業(yè)三廢，因含有微量抗生素成分，在飼料和飼養(yǎng)過程中使用后對動物有一定的促生長作用，但存在一定的安全隱患。193號公告《禁用清單》中增加了氯霉素及其鹽、酯等。235公告對β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類等抗生素規(guī)定了明確的殘留限量。表1匯總了歐盟、日本以及中國在牛奶中的最高殘留限量（MRL）的部分實例。

4 生鮮牛乳中抗生素殘留檢測方法研究進展

4.1 理化檢測法

4.1.1 薄層色譜法

薄層色譜法（TLC）是從經(jīng)典柱色譜法和紙色譜法基礎上發(fā)展起來的一種色譜技術(shù)。其原理是將要分離的牛奶或奶制品點在用固定相均勻涂布的薄板下端，然后將薄板斜插在盛有溶劑的層析缸中，使溶劑進入一部分固定相。由于毛細作用，被分離組分隨展開劑以不同速度向上移動。由于固定相對混合試樣中各組分的吸附力大小不同，各組分會選擇性地保留在原點和展開劑前沿之間的固定相上，取出層析板晾干，用顯色劑與分離組分反應顯出有色(或熒光)斑點[21]。薄層色譜設備簡單，選擇性較好，但樣品處理繁瑣，靈敏度低，顯色過程復雜，當前已很少使用。

4.1.2 毛細管電泳法

毛細管電泳法（CE）是將已注入緩沖溶液的毛細管柱插入處于同一水平的兩個緩沖液槽中。在高壓直流電場的作用下，帶電溶質(zhì)便朝與其極性相反的電極方向移動，從而實現(xiàn)分離的電泳分析方法。該法取樣量少，節(jié)省成本，對分析成分的提取等步驟沒有嚴格的要求，但必須采取有效地濃縮操作，以使其可在低濃度范圍內(nèi)檢出。田春秋等[22]建立了同時檢測牛奶4種青霉素類抗生素的高效毛細管電泳法。利用正交試驗對緩沖液離子濃度和pH值等進行了優(yōu)化，該方法對殘留水平在1.56～100 mg/L的藥物能在4.5 min內(nèi)快速準確檢出。

4.1.3 超臨界流體色譜法

表1 歐盟、日本以及中國在牛奶中抗生素的最高殘留限量（MRL）舉例μg/kg

超臨界流體色譜（SFC）是以超臨界流體作為流動相的色譜法，其可作為液相色譜(LC)和氣相色譜(GC)的補充。超臨界流體具有特殊的熱力學和流體力學性質(zhì)，當用作流動相時，分離效率可比LC高。由于操作溫度較低，可分析GC不能分析的熱不穩(wěn)定化合物。Danaher等[23]建立了一個多殘留檢測的超臨界流體二氧化碳方法，可以提取動物肝臟中殘留的10種苯并咪唑類藥物。結(jié)果表明，該方法各種苯并咪唑的平均回收率介于51%和115%之間，該測定方法的定量限是50 μg/kg。

4.2 生物檢測法

4.2.1 微生物檢測法

微生物檢測法是應用較廣泛的方法，其測定原理是根據(jù)抗生素對微生物的生理機能、代謝的抑制作用，定性或定量檢測樣品中抗生素的殘留。比如TTC法（氯化三苯基四唑氮法）、BSDA法（嗜熱脂肪芽孢桿菌紙片法）、PD法（紙片法）及STOP法（拭子法）等[24]。傳統(tǒng)的微生物檢測法優(yōu)點是檢測費用低，缺點是檢測時間長，顯色狀態(tài)判斷通過肉眼辨別，易產(chǎn)生誤差，且操作復雜。其中，紙片法和TTC法是牛奶中藥物殘留檢測的兩種常用的微生物檢測法。常用的紙片法有枯草桿菌紙片法和嗜熱脂肪桿菌紙片法，主要用來檢測牛奶中的β-內(nèi)酰胺類抗生素。紙片法定性準確，靈敏度高，氯霉素最低檢出量10 μg/kg，土霉素50 μg/kg，鏈霉素1 000 μg/kg，紅霉素50 μg/kg，青霉素2.5 μg/kg。TTC法是目前我國食品衛(wèi)生標準中規(guī)定的檢查生鮮牛乳中抗生素殘留的檢測方法(GB4789.27-2008)。微生物法結(jié)果可靠，成本較低，耗時較長，顯色狀態(tài)需肉眼判別。

4.2.2 免疫分析法

免疫分析法是以抗原或半抗原和抗體特異性結(jié)合為抗原-抗體復合物的免疫反應為基礎的生化測試技術(shù)。目前藥物殘留免疫分析技術(shù)主要分為兩大類：一為相對獨立的分析方法，即免疫測定法(Immunoas?says,IAs)，如放射免疫標記技術(shù)(Radioimmunoassay, RIA)、酶聯(lián)免疫法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)等；二是將免疫分析技術(shù)與常規(guī)理化分析技術(shù)聯(lián)用，如利用免疫分析的高選擇性作為理化測定技術(shù)中的凈化手段，典型的方式為免疫親合色譜(Immunoaffinity Chromatogrphy,IAC)。與常規(guī)的理化分析技術(shù)相比，免疫分析技術(shù)專一性強，靈敏度高。可達到ng/g～pg/g級，分析效率則為HPLC或GC的幾十倍以上[7]。目前大部分抗生素已經(jīng)建立了免疫測定法，包括磺胺類、氯霉素類、喹諾酮類以及四環(huán)素類等[14]。ELISA是目前奶牛場和牛奶公司使用最廣泛、快速、靈敏的檢測抗生素殘留的方法。一般可進行40個以上樣品的同時監(jiān)測，檢測通量高且成本較低，易于操作，可作為檢測抗生素殘留的快速篩查方法。但ELISA法也存在一些缺陷，如往往只能針對一種或一類抗生素，對結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應，分析分子量很小或很不穩(wěn)定的化合物有一定的困難。因此，如果通過ELISA法篩查出陽性樣品，應再用其他儀器方法進行定性和定量確證，以避免假陽性實驗結(jié)果。

4.2.3 生物傳感器

生物傳感器是對生物物質(zhì)敏感并將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號進行檢測的儀器。它利用生物化學和電化學原理，將生化反應信號轉(zhuǎn)換為電信號，再通過放大和模數(shù)轉(zhuǎn)換，測量出被測物質(zhì)及其濃度。Gustavsson等[25]開發(fā)了一種基于羧肽酶活性的抑制反應檢測牛奶中青霉素G殘留的生物傳感器。具有活性的、完整的β-內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)構(gòu)可與受體蛋白形成穩(wěn)定的復合物，抑制酶活，從而通過酶活的降低測定青霉素的含量。結(jié)果表明，青霉素G的檢測限為2.6 μg/kg，低于歐盟的MRL:4 μg/kg。還有報道[26]，將乳酸菌脫氫酶用作生物傳感器的靈敏元件檢測牛乳中青霉素的含量，檢測靈敏度可達100 μg/kg。生物傳感器技術(shù)選擇型好，靈敏度高，分析速度快。但仍面臨一些困難：信號檢測器的使用壽命不長，生物響應的穩(wěn)定性和生物傳感器的便攜式問題等。

4.2.4 蛋白芯片技術(shù)

蛋白質(zhì)芯片是在基因芯片之后發(fā)展起來的一種高通量的蛋白功能分析技術(shù)，又稱蛋白質(zhì)微陣列。其原理是在固相支持物表面高密度排列蛋白質(zhì)探針，可特異地捕獲樣品中分子，然后用CCD相機或激光掃描系統(tǒng)獲取信息，最后用計算機進行定性定量分析。優(yōu)點是樣品用量少，高通量和檢測速度快，該方法在抗生素檢測領域有巨大潛力。Knecht等[27]開發(fā)了一種利用三甲氧基硅烷制備的抗原點陣，可同時檢測牛奶中的β-內(nèi)酰胺類和磺胺類等10種抗生素含量。整個檢測高度自動化，每種樣品的檢測時間不到5 min。結(jié)果表明，除青霉素G接近于MRL，其它抗生素的檢測限均遠遠低于MRLs，檢測范圍為0.12～32 μg/L。

4.3 聯(lián)用技術(shù)

各種分析技術(shù)的聯(lián)用是現(xiàn)代獸藥殘留分析的趨勢，如薄層色譜-質(zhì)譜法(TLC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、毛細管電泳-質(zhì)譜法(CE-MS)、液相色譜-核磁共振法(LC-NMR)、超臨界流體-質(zhì)譜法(SFC-MS)等。隨著色譜技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是與串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）的聯(lián)用，目前已廣泛應用于獸藥的多殘留篩查[28-36]。因LC-MS/MS高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對簡單樣品可進行分析前凈化并具有幾乎通用的多殘留分析能力，可準確定性定量復雜混合物的組分，是一種高通量、高效率、高可靠性的分析技術(shù)。表2列舉了近年來國際上關于牛乳中抗生素檢測的LC-MS方法的實例。從表中可以看出，液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用是用于牛乳中獸藥殘留分析的首選方法，常用的前處理方法是乙腈沉淀蛋白和固相萃取(SPE)凈化。

表2 關于抗生素等藥物殘留的LC-MS方法

近年來，國際上又出現(xiàn)了由LC-MS/MS向精確質(zhì)量和全掃描技術(shù)轉(zhuǎn)移的研究傾向，如LC-TOF-MS。利用液相色譜與飛行時間質(zhì)譜的優(yōu)勢，在牛乳中獸藥殘留檢測方面，已有多篇研究發(fā)表[10,37-38]。其優(yōu)勢明顯，可在單次分析中同時篩選數(shù)百上千種不同化合物，結(jié)合精確分子質(zhì)量數(shù)、保留時間、同位素豐度和二級特征碎片離子對目標化合物進行快速篩查與確證，在多殘留篩查領域潛力巨大。Stolker等[37]建立了用TOF篩查獸藥殘留的方法，樣品制備時放棄了超濾裝置，而用SPE，結(jié)果顯示，基質(zhì)效應比超濾更低。Tur?nipseed等[38]也利用四級桿飛行時間液相色譜質(zhì)譜法分析牛奶中的獸藥和代謝物，牛乳樣品用乙腈提取，凈化步驟經(jīng)過超濾膜處理，除去了SPE步驟，結(jié)果顯示在97%的時間里可檢出藥物殘留，加快了提取液的制備，提高了樣品處理量。表3總結(jié)了關于牛乳中抗生素殘留分析的LC-TOF-MS方法。

5 樣品前處理方法研究進展

當前，就抗生素殘留的危害和引起的爭議而言，抗生素的殘留已經(jīng)成為迫切需要解決的問題。雖然色譜質(zhì)譜的聯(lián)用提高了殘留的分析的靈敏度，檢測性能杰出，但即使是飛行時間質(zhì)譜，仍有局限性，通用的樣品前處理方法的建立是亟待解決的問題。目前，樣品處理的新趨勢有如下特點：更少的樣品量；減少或不用有機試劑；多種類化合物的通用提取方法以及自動化、高通量處理可能性[39]。其中，QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）方法是近年來用于農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速樣品前處理技術(shù)，是基于分散固相萃取建立起來的一種分析方法，在農(nóng)藥和獸藥殘留領域獲得了大量的應用[40-42]。表4總結(jié)了近年來關于樣品制備的方法。

6 結(jié)語

綜上所述，由于對奶牛的不恰當給藥等因素，抗生素類藥物的殘留對人體健康有較大危害。通過比較各國和國際組織的相關標準與法規(guī)，應重視與加強檢測與管理工作，利用高效、高靈敏度的聯(lián)用技術(shù)，如LC-MS/MS、Q-TOF LC-MS等，開發(fā)牛乳中抗生素多殘留篩查的方法，建立多殘留檢測樣品的通用前處理技術(shù)，是我們今后的發(fā)展方向。

表3 關于抗生素等藥物殘留的TOF-MS方法

表4 關于樣品制備的方法

[1]Offical Journal of the European Union,L22418 August 1990 Concil Regulation 2377/90/EC of 26 June 1990 laying down a Community procedur for the establishment of maximum residue limits of veteri?nary medicinal products in foodstuffs of animal arigin,Brussels,Bel?gium,1990.

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[18]The Japan Food Chemical Research Foundation(JFCRF).Maximum Residue Limits(MRLs)of Agricultural Chemicals in Foods,Decem?ber,2011.

[19]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部176號公告.關于發(fā)布《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》[B].(2002-2-9).

[20]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部193號公告.關于發(fā)布《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》[B].(2002-5-15).

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[43]王榮艷,王培龍,佘永新,等.分子印跡基質(zhì)固相分散-液相色譜法測定牛奶中的氯霉素殘留[J].分析實驗室,2009,28(8):26-28.

Research on the progress of the detection technology of antibiotic residues in raw milk

LI Danni1,GONG Songsong2,GU Xin1,WU Jianping1,YAN Feng1,PAN Juan1,ZHANG Jing1
(1.Shanghai Animal Disease Control Center,Shanghai 201103,China;2.WuXi AppTec,Shanghai 200131,China)

In this paper,the sources,hazards,maximum residue limits,residual detection methods and new methods of sample pretreatment of antibiotic residues in raw milk are reviewed,which may be expected to serve as references for developing antibiotic multi-residue screen?ing methods and establishing generic sample processing techniques.

raw milk;antibiotic residue;maximum residue limits;detection methods;pretreatment technology

TS252.7

B

1001-2230（2017）05-0038-05

2016-09-13

上海市科技興農(nóng)重點攻關項目[滬農(nóng)科攻字（2016）第4-5號]。

李丹妮（1978-），女，高級畜牧師，研究方向為動物性產(chǎn)品中藥物殘留檢測。

顧欣